本文介绍了一种在大肠杆菌（Escherichia coli）中制备双特异性抗体 GPC3-S-Fab 的实验方案。纯化后的 GPC3-S-Fab 对 GPC3 阳性的肝癌细胞具有显著的细胞毒性。
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本文内容
摘要
摘要
本方案描述了一种双特异性抗体（bsAb）GPC3-S-Fab的构建及其功能研究。双特异性抗体可通过其两个不同的臂识别两种不同的表位。目前，双特异性抗体因其能够直接招募免疫细胞以杀伤肿瘤细胞的能力而被广泛研究。现阶段，大多数双特异性抗体以重组蛋白形式生产，包括含Fc区的双特异性抗体或不含Fc区的较小双特异性抗体衍生物。在本研究中，设计了一种基于抗体片段（Fab）的双特异性抗体GPC3-S-Fab，通过将抗GPC3抗体GC33的Fab片段与抗CD16单结构域抗体连接而成。GPC3-S-Fab可在Escherichia coli中表达，并通过两次亲和层析纯化。纯化后的GPC3-S-Fab能够通过招募自然杀伤细胞，特异性结合并杀伤GPC3阳性的肝癌细胞，提示GPC3-S-Fab在肝癌治疗中具有潜在应用价值。
引言
单克隆抗体目前已被广泛用于癌症治疗1。由于抗体具有结构灵活性，多种基于抗体的分子形式正被积极研究。与单克隆抗体相比，双特异性抗体（bsAbs）具有两个不同的抗原结合模块，能够同时识别两种不同的靶点，并有效触发免疫效应细胞的募集，从而靶向并杀伤肿瘤细胞2。
目前的重组双特异性抗体（bsAb）结构通常可分为两类：含Fc区的双特异性抗体和不含Fc区的双特异性抗体。与主要在哺乳动物细胞中表达的含Fc区结构相比，不含Fc区的双特异性抗体具有体积更小、更易于在微生物表达系统中生产以及更有效地穿透肿瘤组织等优势3。
不含Fc区域的双特异性抗体通常通过连接单个结合基团（如单链可变区片段（scFv）或Fab）构成3。由于缺乏稳定结构域，基于scFv片段的双特异性抗体往往热稳定性较差、溶解度低，或更易发生聚集4,5。相比之下，基于Fab的双特异性抗体因天然Fab基团中CH1与CL的异源二聚化作用而具有更高的稳定性4,6。....
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方案
所有涉及人体血液采集的程序均经中山大学伦理委员会批准。
1. GPC3-S-Fab 设计策略
- 通过将抗GPC3的Fab片段（人源化GC3313）与抗CD16的VHH14连接，设计GPC3-S-Fab（图1）。
- 按照先前报道的方法12，合成并将VH-CH1-CD16-VHH和VL-CL克隆至pET26b和pET21a载体中。
2. 转化与培养
- 加入100 ng含有VH-CH1-CD16的pET26b质粒图1A）以及含有 VL-CL 的 pET21a 100 ng（图1A)加入100 µL感受态BL21 (DE3)细胞中，充分混匀，冰上孵育30分钟。42 °C水浴孵育45 - 90秒，转移至冰上孵育3 - 5分钟。
- 加入500 µL的LB（Lysogeny Broth）培养基至含有BL21 (DE3)细胞的离心管中，随后在37 °C、150 rpm条件下振荡培养45–60分钟。取100 µL BL21 (D....
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结果
GPC3-S-Fab 纯化
GPC3-S-Fab 通过两步亲和纯化从 E. coli 中纯化获得，首先使用 Ni-NTA-agarose，随后进行 IgG-CH1 亲和纯化。经过两步亲和纯化后，GPC3-S-Fab 达到均一性，两条链的比例接近 1:1（图 2A）。通过其不同的 C 末端标签可鉴定 VH-CH1-CD16 VHH 和 VL-CL 多肽的存在：抗 His 标签识别 VL-CL（约 25 kDa），抗 Flag 标签识别 VH-CH1-VHH（约 38 kDa）（图 2B）。经过两步亲和纯化后，每 1 L SB 培养液可获得约 1.2 mg 蛋白质。为进一步表征纯化的 GPC3-S-Fab，进行了凝胶过滤分析。根据标准蛋白标记物（.......
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讨论
本研究中，我们提出一种构建新型双特异性抗体（bsAbs）GPC3-S-Fab的策略，该抗体可募集自然杀伤细胞（NK细胞）以靶向GPC3阳性肿瘤细胞。S-Fab基于天然Fab结构，通过添加抗CD16的VHH11,12而构建。与含有Fc区的双特异性抗体相比，GPC3-S-Fab可在细菌周质中大规模高效表达。
采用本方案中描述的表达与纯化策略，我们大量获得了可溶且具有功能的 GPC3-S-Fab。为了促进周质表达，在N端添加了信号序列 pelB，以引导蛋白分泌至E. coli17的周质空间。与细胞质相比，位于细胞质膜与外膜之间的周质空间具有更氧化的环境，并含有多种对蛋白质折叠和组装至关重要的蛋白质，因此有助于重组蛋白的正确折叠并提高其可溶性16。然而，E. coli中蛋白质折叠及向周质转运的分子机制容量有限，高水平表达重组蛋白常导致蛋白在周质.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由R提供资金支持&中国广东省“&D计划”（2016A050503028）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 摇床培养箱 | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| 摇床培养箱 | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| 离心机 | Cence | GL-10MD | |
| 离心机 | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| 离心机 | eppendorf | 5810R | |
| 紫外分光光度计 | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| 分析型聚丙烯酰胺凝胶电泳装置 | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| 转印电泳装置 | Criterion | Bio-rad | |
| 成像系统 | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| 快速蛋白液相色谱仪 | GE Healthcare | AKTA avant | |
| 凝胶过滤柱 | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| 流式细胞仪 | Beckman coulter | FC500 | |
| 离心机 | eppendorf | 5702R | |
| Envision 酶标仪 | TECAN | Infinite F50 | |
| 抗 His 标签抗体 | eBioscience | 14-6657-82 | |
| 抗 Flag 标签抗体 | Sigma | F1804 | |
| 抗人源（H&L）-488 | A11013 | Invitrogen | |
| 抗小鼠 IgG HRP 标记抗体 | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-琼脂糖 | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 亲和树脂 | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK 细胞富集试剂盒 | Stemcell | 19055 | |
| 磁力架 | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 试剂盒 | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma | F2442 | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 15050-057 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | 细胞培养 |
| 标准分子量标记物 | Sigma Aldrich | MWGF200 | 凝胶过滤 |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG） | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| 透析袋 | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| 卡那霉素 | VWR | VWRC0408-100G | |
| 氨苄青霉素 | VWR | VWRC0339-100G | |
| 胰蛋白胨 | Thermo Fisher | LP0042B | |
| 酵母提取物 | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | 生工生物 | A100241 | |
| Trizma 碱 | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| 甘氨酸 | 阿拉丁 | A110752-500g | |
| KCl | 阿拉丁 | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| 琼脂 | 生工生物 | A505255-0250 | |
| 磷酸二氢钾（无水）（KH2PO4） | VWR | 7778-77-0 | |
| 磷酸氢二钠（无水）（Na2HPO4） | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-巯基乙醇 | VWR | 60-24-2 | |
| 苯甲基磺酰氟（PMSF） | VWR | 329-98-6 | |
| 溶菌酶 | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| 考马斯亮蓝 R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| 溴酚蓝 | 生工生物 | A500922-25G | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | VWR | VWRC0332-100G | |
| 甘油 | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100 mm × 20 mm 塑料培养皿 | Corning | 430167 | |
| 25 cm² 培养瓶 | Corning | 430639 | |
| 96 孔细胞培养板 | Corning | 3599 | |
| 蔗糖 | 生工生物 | A610498-0005 | |
| CHO | 中国科学院典型培养物保藏中心 | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | 中国科学院典型培养物保藏中心 | SCSP-528 | |
| HepG2 | 中国科学院典型培养物保藏中心 | TCHu 72 | |
| Huh7 | 中国科学院典型培养物保藏中心 | TCHu182 | |
| Hep3B | 中国科学院典型培养物保藏中心 | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
参考文献
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl ....
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