Method Article

GPC3-targeting 双特异性抗体, GPC3-S-Fab, 具有强大的细胞毒性

DOI:

10.3791/57588

⸱

July 12th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-Sen University, 2Center for Cellular & Structural Biology, Sun Yat-Sen University

In This Article

Summary

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在此, 我们提出了一种在大肠杆菌中产生双特异性抗体 GPC3-S-Fab 的协议.纯化 GPC3-S-Fab 对 GPC3 阳性肝癌细胞具有较强的细胞毒性作用。

Abstract

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该协议描述了双特异性抗体 (bsAb) 的构建和功能研究, GPC3-S-Fab。bsAbs 可以通过两个不同的手臂识别两个不同的表位。bsAbs 已积极研究他们的能力, 直接招募免疫细胞杀死肿瘤细胞。目前, 大多数 bsAbs 是以重组蛋白的形式生产的, 它们要么是含有 fc 的 bsAbs, 要么是没有 fc 区域的较小的 bsAb 衍生物。本研究通过将 anti-GPC3 抗体 GC33 与 anti-CD16 单域抗体相结合, 设计了一种基于抗体片段 (GPC3-S-Fab) 的双特异性抗体。GPC3-S-Fab 可在大肠杆菌中表达, 并经两种亲和 chromatographies 纯化。纯化的 GPC3-S-Fab 可以通过招募自然杀伤细胞来明确地结合和杀死 GPC3 阳性肝癌细胞, 这表明 GPC3-S-Fab 在肝癌治疗中的潜在应用。

Introduction

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单克隆抗体现在广泛用于癌症治疗1。由于抗体的柔韧性, 各种基于抗体的格式已经得到了积极的探索。与单克隆抗体相比, bsAbs 有两种不同的抗原结合模块, 能够同时识别两个不同靶点, 有效地触发免疫效应细胞的招募, 以靶向和杀死肿瘤细胞2。

当前的重组 bsAb 格式通常可以分配给两个类: fc 包含 bsAbs 和 bsAbs, 而没有 fc 区域。与大多数哺乳动物细胞中所含 fc 格式相比, 没有 fc 区域的 bsAbs 具有较小尺寸的优点, 更容易在微生物表达系统中产生, 并且能更有效地穿透肿瘤组织。3。

没有 Fc 区域的 bsAbs 通常是通过链接单个绑定基团 (如单链变量片段 (scFvs) 或3) 来形成的。如果没有稳定的域, 基于抗体碎片的 bsAbs 通常会损害热稳定性、低溶解度或增加聚集4、5的潜力。相比之下, 以 bsAbs 为基础的 heterodimerization, 由于 CH1 和 CL 在原生的晶圆4,

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Protocol

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所有的程序, 包括人的血液收集被孙中山大学伦理委员会批准。

1. GPC3-S-Fab 设计策略

  1. 设计 GPC3-S-Fab 通过链接一个 anti-GPC3 (人性化的 GC3313) 与 anti-CD16 VHH14 (图 1)。
  2. 将 VH-CH1-CD16-VHH 和 pET26b 和 pET21a 载体合成并克隆为先前报告的12。

2. 变革和文化

  1. 将含有 VH-CH1-CD16 (图1A) 和 100 pET26b 的 pET21a 的 100 ng 添加到100µL 的主管BL21 (DE3) 细胞中。拌匀, 在冰上孵育30分钟, 在42摄氏度的水浴中孵化 45-九十年代, 转移, 并在冰上孵化 3-5 分钟。
  2. 将500µL 溶源性汤 (磅) 培养基放入含有 BL21 (DE3) 细胞的管中, 然后在37摄氏度处孵化, 150 rpm 45-60 分钟100µL 的 BL21 (DE3) 细胞在含有....

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Results

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GPC3-S-Fab 净化

GPC3-S-Fab 从大肠杆菌中纯化, 经两步亲和纯化, 先用镍 NTA 琼脂糖, 其次 IgG-CH1 亲和纯化。两步亲和纯化后, GPC3-S-Fab 被纯化为同质性, 两链接近 1:1 (图 2A)。VH-CH1-CD16 VHH 和 cl 多肽的存在可以通过它们独特的 C 终端标记来识别, 反他的大约 25 kDa, 以及 VH-CH1-VHH 大约 38 kDa 的反旗 (图 2B)。在两步亲和纯化后, 可从某种培养物的1升中获得1.2 毫克蛋白质。为进一步表征纯化 GPC3-S-Fab, 进行了凝胶过滤。根据标准标记 (图 2C), GPC3-S-Fab 被确定为一个均匀单体的形式的.......

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Discussion

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在这项研究中, 我们提出了一个新的格式 bsAbs, GPC3-S-Fab, 它可以招募 NK 细胞靶向 GPC3 阳性肿瘤细胞。s-工厂是基于自然的晶圆格式, 添加一个 anti-CD16 VHH11,12。与含 Fc 区的 bsAbs 相比, GPC3-S-Fab 可以很容易地在细菌 periplasm 中产生。

利用该协议中描述的表达式和纯化策略, 得到了大量的可溶性和功能 GPC3-S-Fab。为便于周质表达, 政局在 N 终点添加了信号序列, 直接分泌到大肠杆菌的 periplasm17。与细胞质相比, 胞质和外层膜之间周质空间中的氧化环境越多, 蛋白质的折叠和组装就有许多重要的蛋白质, 从而促进了矫正褶皱和重组蛋白的溶解度16。然而, 蛋白质折叠和出口到大肠杆菌的 periplasm 的机器容量有限。高表达重组蛋白往往导致不.......

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Disclosures

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作者声明没有利益冲突。

Acknowledgements

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这项工作得到了广东省 (2016A050503028) 研究 & 开发计划的资助。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
振荡培养箱Thermo FisherMAXQ 4000
振荡培养箱志诚ZWYR-D2402
离心机CenceGL-10MD
离心机贝克曼犁刀Avanti j-26S XPI
离心机eppendorf5810R
紫外分光光度计Thermo FisherNanodrop
分析聚丙烯酰胺凝胶电泳仪Mini-PROTEAN®TetraBio-rad
反式印迹仪CriterionBio-rad
成像系统Bio-radchemidoc tm XRS+
Fast Protein 液相色谱图GE HealthcareAKTA avant
GF 色谱柱GE Healthcare28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL
流式细胞仪Beckman coulterFC500
离心eppendorf5702R
Envision 读板机TECANInfinite F50
抗 His 标签eBioscience14-6657-82
抗 Flag 标签SigmaF1804
抗人（H&L）-488A11013Invitrogen
抗小鼠 IgG HRP 连接抗体细胞信号传导7076S
Ni-NTA-琼脂糖TribioscienceTBS9202-100
IgG-CH1 亲和树脂Thermo Fisher194320005
Ficoll-Plaque PlusGE Healthcare17-1440-03
NK 细胞富集试剂盒干细胞19055
磁力干细胞18000
CCK8 试剂盒DojindoCK04
DMEMGibcoC11995500CP
RPMI-1640GibcoC11875500CP
胎牛血清 （FBS）SigmaF2442
胰蛋白酶Gibco15050-057
青霉素-链霉素Gibco15140-122细胞培养
标准标志物Sigma AldrichMWGF200凝胶过滤
异丙基-b-D-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG）VWR 化学品VWRC0487-100G
透析管Sigma AldrichD0655-100FT
克那霉素VWRVWRC0408-100G
氨苄青霉素VWRVWRC0339-100G
胰蛋白胨Thermo FisherLP0042B
酵母提取物Thermo FisherLP0021B
NaClSangon BiotechA100241
Trizma 碱Sigma AldrichT6791-1KG
EDTASigma AldrichV900106
甘氨酸阿拉丁A110752-500g
KCl阿拉丁P112134-500g
MgClSigma AldrichV900020
琼脂Sangon BiotechA505255-0250
无水二氢磷酸钾 （KH2PO4）VWR7778-77-0
无水氢氢磷酸钠 （Na2HPO4）VWR7558-79-4
2-巯基乙醇VWR60-24-2
苯甲基磺酰氟 （PMSF）VWR329-98-6
溶菌酶Sigma AldrichL6876-25G
考马斯亮蓝 R250VWRVWRC0472-50G
溴酚蓝Sangon BiotechA500922-25G
牛血清白蛋白 （BSA）VWRVWRC0332-100G
甘油Sigma AldrichV900122
100mm x 20mm 塑料培养皿康宁430167
25cm2 培养瓶康宁430639
96 孔细胞培养簇康宁3599
蔗糖Sangon BiotechA610498-0005
CHO中国科学院类型培养物保藏GNHa 3
MHCC-97H中国科学院类型培养物保藏SCSP-528
HepG2中国科学院类型培养物保藏TCHu 72
Huh7中国科学院类型培养物保藏TCHu182
Hep3B中国科学院典型培养物保藏TCHu106
NK92ATCCCRL2408
机 中心 中心 中心 中心 中心

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
  2. Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl ....

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Bispecific AntibodyGPC3 S FabE coli ExpressionNickel NTA PurificationNatural Killer CellsCytotoxicity AssayPeriplasmic FractionPBMC IsolationGPC3 BindingAffinity Chromatography

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