向小鼠注射脂多糖以模拟肠道屏障受损后微生物来源产物的进入

摘要

本文介绍了一种模拟肠道屏障受损后细菌来源化合物进入机体的实验方案。向小鼠全身注射低剂量的亚致死浓度脂多糖，并在注射后连续监测24小时。在多个时间点检测脾脏、肝脏和结肠中促炎性细胞因子的表达水平。

摘要

肠上皮屏障将宿主与通常被耐受或忽略的微生物群分隔开。该屏障的破坏会导致细菌或细菌来源的产物进入宿主体内，进入宿主的循环系统和内部器官，引发不受控制的炎症，这在炎症性肠病（IBD）患者中可见，此类患者的特征是肠上皮通透性增加。

为了模拟细菌来源的化合物进入宿主的过程，本研究采用了内毒素血症模型，即将革兰氏阴性菌外细胞壁组分脂多糖（LPS）注射到小鼠体内。在本研究中，通过腹腔注射给予小鼠亚致死剂量的LPS，并在注射后连续8小时利用疾病评分系统对小鼠进行监测。此外，通过qPCR在LPS注射后的不同时间点检测了脾脏、肝脏和结肠中炎症细胞因子Il6、Il1b和Tnfa的表达水平。该模型可用于研究微生物或细菌来源产物因体表屏障受损而侵入后所引发的免疫应答。

引言

人类肠道中定植着大量微生物群落，这些微生物群落构成了肠道微生物组，并在进化过程中与宿主形成了互惠互利的关系。在这种关系中，宿主为微生物组提供稳定的生存环境，而微生物组则为宿主提供维生素、协助营养物质消化以及抵御病原体，其自身也栖居于宿主体内¹。当宿主与微生物组之间的这种有益关系被破坏时，便可能引发疾病，例如炎症性肠病（IBD）。IBD 是一种由遗传和环境因素共同作用引起的肠道多因素慢性炎症性疾病，主要表现为两种形式：克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）。尽管这两种 IBD 形式具有相似之处，但它们在炎症改变的部位和性质上存在特定差异。CD 是一种可反复发作的透壁性炎症性疾病，可能累及整个胃肠道的任何部位，而 UC 则为非透壁性炎症，局限于结肠。此外，核苷酸结合寡聚化结构域样受体 2（NOD2）的突变与 CD 相关；NOD2 是一种模式识别受体（PRR），能够识别大多数革兰氏阳性菌和阴性菌细胞壁组分——胞壁酰二肽（MDP）²。此外，在 CD 患者体内，Escherichia coli (E. coli)、Listeria 和 Streptococci 及其产物均被发现存在于巨噬细胞内，这些微生物是在肠道屏障受损后侵入宿主的³。当细菌或其产物在 CD 发生过程中进入宿主时，免疫系统会产生应答，导致循环中抗细菌抗体的生成

方案

小鼠在巴塞尔大学生物医学系（瑞士巴塞尔）动物实验设施的无特定病原体（SPF）条件下进行繁育和饲养。所有小鼠实验均依照瑞士联邦和州级法规进行（动物实验许可编号 2816 [巴塞尔城市州]）。

1. LPS 溶液的制备

1. 在无菌条件下打开来自 Escherichia coli 0111:B4 的脂多糖（LPS）储备液，用水重悬至浓度为 5 mg/mL。
2. 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）将 LPS 储备液稀释至工作浓度 0.2 µg/µL。

2. 小鼠腹腔注射LPS

1. 在超净工作台中，用带有30 G针头的0.5 mL注射器吸取LPS工作液。
2. 称量雌性C57Bl/6小鼠（6至10周龄），并计算需注射的LPS剂量：按10 µL（2 µg）/g体重给药。
   注意：例如，若小鼠体重为20 g，则需注射20 g × 10 µL = 200 µL的LPS工作液。
3. 轻柔但稳固地抓握小鼠，用一只手固定动物，确保其呼吸顺畅，同时防止其扭动或翻转。
4. 将小鼠鼻部略微朝向地面，以暴露腹部注射区域。找到腹部中线，并在中线左侧或右侧的下腹部确定注射部位。对照组小鼠则腹腔注射等量PBS而非LPS。
5. 用另一只手将适当体积（步骤2.2中计算出的体积）的LPS工作液注入腹腔。确保针....

结果

为了模拟肠道屏障受损后细菌或细菌来源的产物进入宿主体内所引发的后果，向C57Bl/6小鼠注射亚致死剂量的LPS（2 µg/g体重）。每只小鼠均被监测，并根据评分表中所列参数对其内毒素血症的发生情况进行评分，评分参数包括小鼠的外观、动物的活动性、眼睛状况以及呼吸频率和质量（表1）。动物表现出临床疾病症状，症状在注射LPS后6至10小时达到高峰，并在24小时内恢复（图1）。分别在注射LPS后2小时、4小时和8小时处死各组小鼠。从小鼠的脾脏、肝脏和结肠中采集组织样本。从这些器官中提取RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板进行qPCR，检测Il6（图2A）、Il1b（图2B）、TNFa（图2C）和Il10（

讨论

该方案模拟了微生物来源产物入侵后发生的免疫学过程。方案中的关键步骤包括小鼠品系的选择、小鼠的卫生状况、脂多糖（LPS）的剂量、动物内毒素血症发生情况的监测以及实验终止时间点的确定。尤为重要的是必须考虑小鼠品系的遗传背景。不同小鼠品系对LPS的敏感性存在差异。例如，C3H/HeJ和C57BL/10ScCr小鼠对LPS诱导的内毒素血症具有抗性^21,25此外，动物的卫生状况可能会影响脂多糖（LPS）诱导的内毒素血症进程。最常使用的是无特定病原体（SPF）动物。这类小鼠不携带特定清单中的病原体，但其完整的微生物群组成尚不明确。^26,27无菌动物（不携带任何微生物群）与SPF小鼠不同²⁶无菌动物在定植单一微生物或微生物群落（已知菌群动物）后，与无特定病原体动物相比，可能在脂多糖注射后影响诸如IL-19等基因的表达。⁸此外.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DreamTaq Green PCR预混液（2x）	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	K1081
高容量cDNA反转录试剂盒	Applied Biosystems, Foster City, CA, USA	4368813
无RNase的DNase试剂盒	Qiagen, Hilden, Germany	79254
大肠杆菌O111:B4脂多糖（LPS）	Invivogen, San Diego, CA, USA.	tlrl-eblps
Omnican 50一次性胰岛素注射器	B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany	9151125
Bioanalyzer 2100	Agilent Technologie, Santa Clara, USA	不适用
Centrifuge 5430离心机	Eppendorf, Hamburg, Germany	不适用
Centrifuge Mikro 220R离心机	Hettich, Kirchlengern, Germany	不适用
解剖工具	Aesculap, Tuttlingen, Germany	不适用
Fast-Prep-24 5G样品制备系统	M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA	不适用
NanoDrop ND-1000	NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA	不适用
TRI Reagent	Zymo Research, Irvine, CA, USA	R2050-1