单个缓步动物标本的超低起始量基因组测序文库制备

摘要

在微观生物的基因组测序过程中，污染问题仍然十分严重。本文介绍一种方法，仅需50 pg基因组DNA且无需全基因组扩增，即可对单个个体缓步动物的基因组进行测序，从而最大限度地降低污染风险。

摘要

缓步动物是一类在面临干燥胁迫时可进入一种称为隐生的状态的微型动物，该状态下其新陈代谢几乎停止，而在重新获得水分后可恢复至正常状态。对缓步动物等微型动物进行基因组测序时，容易受到细菌污染，有时会导致错误的结论，例如关于这些动物中水平基因转移程度的判断。本文提供了一种超低起始量的测序方法，可从单个缓步动物个体中完成对 Hypsibius dujardini 基因组的测序。通过严格的清洗与污染物排除，并高效提取单一个体中约 50 ~ 200 pg 的基因组 DNA，我们构建了适用于DNA测序仪的文库。所构建的文库具有高度可重复性和无偏性，对测序读段进行生物信息学分析，并与其他 H. dujardini 基因组数据进行比较，结果显示污染程度极低。该方法可应用于此前因无法培养而难以测序的缓步动物种类。

引言

缓步动物是一类微小的动物，当面临干燥环境时可进入一种称为隐生的无代谢状态。它们通过吸收水分恢复生命活动^1，2。在无代谢状态下，缓步动物能够耐受多种极端环境，包括极端温度³、压力^4，5、高强度的紫外线照射⁶、X射线和γ射线^7，8，以及宇宙空间环境⁹。基因组数据是研究隐生分子机制不可或缺的基础。

此前对缓步动物基因组进行测序的尝试均显示出细菌污染的迹象^{10,11,12,13,14}。对这类微小生物进行基因组测序需要大量个体，且容易受到细菌污染；因此，我们此前已建立了一种超....

方案

1. 准备

1. 使用蒸馏水（DW）作为溶剂，在90 mm塑料培养皿中制备2%琼脂糖凝胶，并加入10 mL含1%青霉素/链霉素的混合液与蒸馏水。该凝胶可在18 °C的培养箱中保存2–3周。
   注意：避免将凝胶储存在低于10 °C的环境中，因为低温会导致琼脂糖凝胶收缩，从而在凝胶与培养皿壁之间形成微小缝隙，可能导致缓步动物被困其中。

2. 样品制备与污染物排除

1. 选取一只缓步动物，将其放置于已准备好的琼脂平板上，并用去离子水清洗2至3次，以去除残留的颗粒物。
2. 将缓步动物在18 - 22 °C条件下孵育24小时，以清除肠道内多余的食料。
3. 将饥饿处理后的缓步动物置于青霉素/链霉素抗生素溶液中处理2 - 6小时，以去除可能的细菌污染，随后使用P10移液器将去污染后的个体转移至洁净的载玻片上。
4. 在500倍放大倍数下使用显微镜观察缓步动物，确认其体表无残留细菌。
   注意：使用体视显微镜进行高倍观察效果最佳，但也可选用光学显微镜替代，无需加盖盖玻片。
5. 使用P10移液器吸取最多5 µL液体将个体转移至低吸附性的聚合酶链式反应（PCR）管中，并尽可能去除多余液体。
   注意：所使用的微量离心管、PCR管及移液器吸头均应为低吸附性，以最大限度减少DNA损失。
   注意：应尽快进行匀浆处理，因为动物的快速干燥或死亡会严重破....

结果

污染物排除：

本方案包括对缓步动物进行彻底清洗，并使用抗生素处理以实现灭菌，从而最大限度地减少污染。此外，还需通过显微观察检查以确保上述步骤的完整性。在验证过程中（方案步骤2.4）拍摄的显微图像如图2所示。在500倍放大倍数下观察时，细菌细胞表现为围绕缓步动物个体移动的小颗粒。

DNA文库质量的验证：

构建的DNA-Seq文库总量约为109.5 ng（7.3 ng/µL × 15 µL）¹⁶。为验证片段化长度分布，电泳图谱应与

讨论

细菌污染对微生物基因组测序构成威胁。尽管先前关于缓步动物基因组测序的研究已通过广泛的生物信息学方法过滤污染序列^12,20我们对单个个体进行了基因组测序，以最大限度降低污染风险。由于单个缓步动物个体所含基因组DNA约为50 - 200 pg¹⁶ 并且被包裹在一层厚厚的几丁质外骨骼中，因此排除污染物和高质量DNA提取是本方案中的关键步骤。现有的缓步动物培养物并非无菌，而从野外采集的个体体表携带大量污染物，其肠道内也含有食物残渣。此前的缓步动物基因组测序项目通常将10,000至100,000个个体合并为一个样本进行测序^12,14，这意味着结果极有可能受到细菌污染物的影响。在他们的报告中，Boothby 等 收集 H. dujardini 利用个体的负趋光性行为¹⁴，且该组未采用任何.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SZ61 显微镜	OLYMPUS
BactoAgar	Difco Laboratories	214010
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Gibco by life technologies	15140-148
VHX-5000 系统	Keyence
0.2 mL 硅涂层管	Bio Medical Science	BC-bmb20200
Quick-DNA Microprep 试剂盒	ZYMO Research	D3021	该试剂盒的使用至关重要；参见步骤 3.1
1.5 mL 微量离心管	greiner bio-one	616-201	参见 4.1.1
高速冷冻微量离心机	TOMY	MX-307
Covaris M220	Covaris Inc.	4482277
ThruPLEX DNA-Seq 试剂盒	Rubicon Genomics	CAT. NO. R400406	该试剂盒的使用至关重要；参见步骤 4.2
PCR 仪	Bioer Technology	TC-96GHbC
AMPure XP 试剂	BECKMAN COULTER Life Science	A63881
乙醇	Wako	054-027335
EB 缓冲液	QIAGEN	19086
2200 TapeStation	Agilent	G2965AA
D1000 试剂	Agilent	5067-5583
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582
Qubit dsDNA BR 缓冲液/试剂	ThermoFisher Scientific	Q32850
Cubee Mini-Centrifuge	RecenttecGenereach	R5-AQBD01aqbd
MiSeq 600 循环 v3	Illumina Inc.	MS-102-3003
MiSeq 测序仪	Illumina Inc.	SY-410-1003