方法文章

单个缓步动物标本的超低起始量基因组测序文库制备

DOI：

10.3791/57615

⸱

2018年7月15日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Advanced Biosciences, Keio University, 2Systems Biology Program, Graduate School of Media and Governance, Keio University, 3Faculty of Environment and Information Studies, Keio University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在微观生物的基因组测序过程中，污染问题仍然十分严重。本文介绍一种方法，仅需50 pg基因组DNA且无需全基因组扩增，即可对单个个体缓步动物的基因组进行测序，从而最大限度地降低污染风险。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

缓步动物是一类在面临干燥胁迫时可进入一种称为隐生的状态的微型动物，该状态下其新陈代谢几乎停止，而在重新获得水分后可恢复至正常状态。对缓步动物等微型动物进行基因组测序时，容易受到细菌污染，有时会导致错误的结论，例如关于这些动物中水平基因转移程度的判断。本文提供了一种超低起始量的测序方法，可从单个缓步动物个体中完成对 Hypsibius dujardini 基因组的测序。通过严格的清洗与污染物排除，并高效提取单一个体中约 50 ~ 200 pg 的基因组 DNA，我们构建了适用于DNA测序仪的文库。所构建的文库具有高度可重复性和无偏性，对测序读段进行生物信息学分析，并与其他 H. dujardini 基因组数据进行比较，结果显示污染程度极低。该方法可应用于此前因无法培养而难以测序的缓步动物种类。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

缓步动物是一类微小的动物，当面临干燥环境时可进入一种称为隐生的无代谢状态。它们通过吸收水分恢复生命活动1，2。在无代谢状态下，缓步动物能够耐受多种极端环境，包括极端温度3、压力4，5、高强度的紫外线照射6、X射线和γ射线7，8，以及宇宙空间环境9。基因组数据是研究隐生分子机制不可或缺的基础。

此前对缓步动物基因组进行测序的尝试均显示出细菌污染的迹象10,11,12,13,14。对这类微小生物进行基因组测序需要大量个体，且容易受到细菌污染；因此，我们此前已建立了一种超低起始量的测序方案，从单个缓步动物个体开始，以最大限度降低污染风险15。基于这些数据，我们进一步对 H. dujardini 的基因组进行了高质量的重测序与重新组装16,17 。本文将详细描述从单个缓步动物个体进行基因组测序的这一方法（图1）。该测序方法的验证并非本文的重点，已在我们此前的报告中进行了充分讨论16。

该方法包括两个部分：以尽可能低的污染程度分离单个缓步动物，以及从图谱水平高效提取DNA。将缓步动物饥饿处理后，用清水及抗生素充分冲洗，并在500倍显微镜下观察，以确保彻底去除任何细菌污染。先前的估算和测量表明，单个缓步动物个体含有约50–200 pg的基因组DNA16，可通过冻融循环或手工匀浆裂解几丁质外骨骼来提取该基因组DNA。提取的DNA用于文库构建，并在DNA测序仪上进行测序。进一步的生物信息学分析显示，与以往的缓步动物测序项目相比，本方法获得的测序数据质量高，且污染水平低。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 准备

  1. 使用蒸馏水（DW）作为溶剂，在90 mm塑料培养皿中制备2%琼脂糖凝胶，并加入10 mL含1%青霉素/链霉素的混合液与蒸馏水。该凝胶可在18 °C的培养箱中保存2–3周。
    注意：避免将凝胶储存在低于10 °C的环境中，因为低温会导致琼脂糖凝胶收缩，从而在凝胶与培养皿壁之间形成微小缝隙，可能导致缓步动物被困其中。

2. 样品制备与污染物排除

  1. 选取一只缓步动物，将其放置于已准备好的琼脂平板上，并用去离子水清洗2至3次，以去除残留的颗粒物。
  2. 将缓步动物在18 - 22 °C条件下孵育24小时，以清除肠道内多余的食料。
  3. 将饥饿处理后的缓步动物置于青霉素/链霉素抗生素溶液中处理2 - 6小时，以去除可能的细菌污染，随后使用P10移液器将去污染后的个体转移至洁净的载玻片上。
  4. 在500倍放大倍数下使用显微镜观察缓步动物，确认其体表无残留细菌。
    注意：使用体视显微镜进行高倍观察效果最佳，但也可选用光学显微镜替代，无需加盖盖玻片。
  5. 使用P10移液器吸取最多5 µL液体将个体转移至低吸附性的聚合酶链式反应（PCR）管中，并尽可能去除多余液体。
    注意：所使用的微量离心管、PCR管及移液器吸头均应为低吸附性，以最大限度减少DNA损失。
    注意：应尽快进行匀浆处理，因为动物的快速干燥或死亡会严重破坏基因组DNA。

3. 匀浆化与DNA提取

  1. 采用以下方法之一对动物进行匀浆，以获得其基因组DNA（gDNA）。
    注意：在后续DNA提取步骤中，必须使用材料表中指定的试剂盒，因为其他试剂盒（无论是基于柱子或磁珠的）在极低样本量输入时均无效。基因组裂解缓冲液在使用前已添加0.5% β-巯基乙醇。
    1. 通过冻融循环对动物进行匀浆18。
      1. 在完成步骤2.5后立即向含有缓步动物的PCR管中加入100 µL裂解缓冲液。
      2. 将PCR管置于液氮中10分钟，然后转移至预热至37 °C的金属加热块中10分钟。重复此步骤2次。
        注意：当匀浆不充分时可重复该步骤，也可在手动研磨后进行。
    2. 手动研磨动物。
      1. 在完成步骤2.5后，在体视显微镜下，用移液器P10吸头将个体紧压在PCR管壁上进行研磨，并立即加入100 µL裂解缓冲液。
        注意：必须在体视显微镜下观察此操作过程，因为缓步动物容易滑脱，研磨不充分将导致无法提取gDNA。确保缓步动物的角质层被破坏，以便裂解缓冲液能够渗入生物体内部。
  2. 将管子在室温下孵育30分钟，以实现充分裂解。
    注意：高效裂解至少需要30分钟，但孵育时间可更长。
  3. 将裂解混合液的全部体积（100 µL）转移至一个洁净的1.5-mL低吸附微量离心管中。
  4. 向用于匀浆且现已空置的低吸附PCR管中加入100 µL裂解缓冲液，吸取混合液后转移至步骤3.3中使用的1.5-mL低吸附微量离心管中。重复此步骤2次。
  5. 与步骤3.4相同，向低吸附PCR管中加入300 µL裂解缓冲液，吸取混合液后转移至1.5-mL低吸附微量离心管中。此步骤完成后，1.5-mL低吸附微量离心管中应含有600 µL混合液。
    注意：这些步骤通过多次洗涤样本，以尽量减少gDNA在PCR管壁上的吸附损失。
  6. 将总共600 µL的裂解混合液加入置于收集管中的离心柱中，并在10,000 x g下离心1分钟。
  7. 将流出液重新加回到离心柱中，并在10,000 x g下离心1分钟。
    注意：此步骤至关重要，以确保大部分gDNA结合到离心柱上。
  8. 向离心柱中加入500 µL洗涤缓冲液，在10,000 x g下离心1分钟。然后将离心柱转移至一个洁净的1.5-mL微量离心管中。
  9. 向离心柱中加入20 µL 10 mM Tris-HCl（pH 8.5），在室温下静置5分钟，然后在10,000 x g下离心1分钟。
    注意：洗脱缓冲液不得含有EDTA，因其会干扰文库构建酶的活性。
  10. 将流出液再次通过离心柱，在室温下孵育5分钟后，在10,000 x g下离心1分钟。
    注意：此步骤至关重要，以确保结合在离心柱上的gDNA实现最大程度的洗脱。

4. 文库构建流程

  1. DNA片段化
    1. 将15 µL的gDNA洗脱液转移至一个15 µL的微量离心管中用于DNA片段化，并使用台式微量离心机离心1分钟。
      注意：如材料表中所示，指定的微量离心管适用于低投入量。低体积超声片段化至关重要，由于DNA浓度极低，不能用酶法片段化替代。
    2. 将gDNA片段化至550 bp。
      注意：我们使用的550 bp设置如下：峰值入射功率 = 30 W，占空比 = 20%，每脉冲周期数 = 50，处理时间 = 23 s。
    3. 充分吹打混匀后，将10 µL片段化DNA混合物转移至一个新的低吸附PCR管中。
      注意：实验可在此处暂停。将DNA保存在4 °C或-20 °C。
  2. 文库构建流程
    注意：由于投入DNA量极少，在以下步骤中必须严格使用材料表中指定的试剂盒。
    1. 加入2 µL模板制备缓冲液和1 µL模板制备酶，用移液器充分混匀。
    2. 在热循环仪中进行模板制备反应，反应条件如下：22 °C孵育25分钟，55 °C孵育20分钟，4 °C保存，加热盖温度为101 - 105 °C。反应完成后，立即进行下一步。
    3. 向模板制备反应产物中加入1 µL文库合成缓冲液和1 µL文库合成酶，于22 °C孵育40分钟（最后保持在4 °C）。反应完成后，立即进行下一步。
    4. 加入30 µL文库扩增主混合液（包含25 µL文库扩增缓冲液、1 µL文库扩增酶和4 µL无核酸酶水）以及5 µL索引试剂。
    5. 用移液器充分混匀，并使用台式离心机短暂离心。
    6. 按照表1所示条件进行PCR扩增。
温度时间循环次数
72 ˚C3 分钟
85 ˚C2 分钟
98 ˚C2 分钟
98 ˚C20 秒4 个循环
67 ˚C20 秒
72 ˚C40 秒
98 ˚C20 秒16 个循环
72 ˚C50 秒
4 ˚C保持

表1：PCR条件。

  1. PCR产物的纯化
    注意：此步骤可用其他纯化方法替代。若使用替代方法，请务必使用分光光度计检测所得DNA的纯度。260/280和260/230的吸光度比值均需高于1.8。
    1. 加入50 µL磁珠，用移液器吹打溶液10次，然后在台式微量离心机中短暂离心。
    2. 在室温下孵育2分钟。
    3. 将样品置于磁力架上孵育5分钟，或直至溶液完全澄清，随后移除上清液。
    4. 在磁力架上的低吸附PCR管中加入200 µL新鲜配制的80%乙醇，静置30秒后移除上清液。重复此步骤两次。操作过程中勿扰动磁珠。
    5. 使用台式离心机对低吸附PCR管进行短暂离心，并在磁力架上去除残留乙醇。将磁珠空气干燥，但避免过度干燥。
    6. 用15 µL 10 mM Tris-HCl（pH 8.5）重悬磁珠，充分吹打溶液使磁珠均匀分散，室温孵育2分钟，短暂离心后置于磁力架上孵育2分钟，直至溶液澄清。
      注意：洗脱缓冲液不应含有EDTA，因其会干扰测序化学反应。
    7. 将上清液转移至新的低吸附PCR管中，注意勿扰动沉淀。
      注意：实验可在此处暂停。DNA可保存在4 °C，或长期储存于-20 °C。

5. DNA的质量检测、定量与序列分析

注意：由于 DNA 量较少，此步骤之前不进行质量检测。

  1. DNA文库片段大小分布的验证
    注意：也可使用其他高灵敏度的电泳系统，只要其能够以数字化方式报告片段大小分布即可。
    1. 将电泳缓冲液试剂和凝胶卡盒（范围为25 - 1,000 bp）恢复至室温。
    2. 取3 µL电泳缓冲液试剂与1 µL测序文库混合，涡旋振荡1分钟使其充分混匀，然后使用台式离心机短暂离心。
    3. 进行电泳，并使用配套软件验证文库的片段大小分布。主条带峰的大小应大致分布在300至1,000 bp范围内。
  2. DNA定量
    注意：也可采用其他基于荧光的方法或定量PCR进行定量，但应避免使用分光光度法，因其对测序文库的定量不够准确。
    1. 在796 µL溶液缓冲液中加入4 µL荧光试剂，充分混匀。将190 µL工作液分装至两个检测管中，197 µL分装至一个检测管中。
    2. 向含有190 µL工作液的每个检测管中加入10 µL已知浓度的DNA标准品，向含有197 µL工作液的检测管中加入3 µL制备好的文库样品。
    3. 短暂涡旋振荡各管，随后在台式离心机上离心。使用荧光计，设置3 µL检测模式对DNA进行定量。
  3. DNA文库测序
    注意：测序平台必须与指定的文库构建试剂盒兼容。
    1. 根据生产商提供的操作规程制备测序文库。
    2. 将试剂盒和流动池安装至测序仪中，并按照生产商的操作规程输入测序运行信息。
    3. 启动测序。
      注意：我们进行了两次测序运行：一次为单样本/单次运行，另一次为四个样本在同一测序运行中进行多重检测。

6. 计算分析

  1. 进行碱基识别，并在需要时对读段进行解复用。
  2. 使用 FastQC 验证序列数据的质量19。
    注意：如需对获得的数据进行更深入的验证，请参见我们之前的报告16。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

污染物排除：

本方案包括对缓步动物进行彻底清洗，并使用抗生素处理以实现灭菌，从而最大限度地减少污染。此外，还需通过显微观察检查以确保上述步骤的完整性。在验证过程中（方案步骤2.4）拍摄的显微图像如图2所示。在500倍放大倍数下观察时，细菌细胞表现为围绕缓步动物个体移动的小颗粒。

DNA文库质量的验证：

构建的DNA-Seq文库总量约为109.5 ng（7.3 ng/µL × 15 µL）16。为验证片段化长度分布，电泳图谱应与

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细菌污染对微生物基因组测序构成威胁。尽管先前关于缓步动物基因组测序的研究已通过广泛的生物信息学方法过滤污染序列12,20我们对单个个体进行了基因组测序，以最大限度降低污染风险。由于单个缓步动物个体所含基因组DNA约为50 - 200 pg16 并且被包裹在一层厚厚的几丁质外骨骼中，因此排除污染物和高质量DNA提取是本方案中的关键步骤。现有的缓步动物培养物并非无菌，而从野外采集的个体体表携带大量污染物，其肠道内也含有食物残渣。此前的缓步动物基因组测序项目通常将10,000至100,000个个体合并为一个样本进行测序12,14，这意味着结果极有可能受到细菌污染物的影响。在他们的报告中，Boothby 等 收集 H. dujardini 利用个体的负趋光性行为14，且该组未采用任何...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢Nozomi Abe、Yuki Takai和Nahoko Ishii在基因组测序方面的技术支持。本研究由日本学术振兴会（JSPS）研究会员资助项目、JSPS科研费青年研究（A）（编号22681029）、JSPS科研费科学研究（B）（编号17H03620）、住友财团基础科学研究项目资助（编号140340）资助，并部分得到日本山形县及鹤冈市研究资金的支持。Chlorella vulgaris（用于喂养缓步动物）由Chlorella Industry Co. LTD.惠赠提供。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
SZ61 显微镜OLYMPUS
BactoAgarDifco Laboratories214010
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Gibco by life technologies15140-148
VHX-5000 系统Keyence
0.2 mL 硅涂层管Bio Medical ScienceBC-bmb20200
Quick-DNA Microprep 试剂盒ZYMO ResearchD3021该试剂盒的使用至关重要；参见步骤 3.1
1.5 mL 微量离心管greiner bio-one616-201参见 4.1.1
高速冷冻微量离心机TOMYMX-307
Covaris M220Covaris Inc.4482277
ThruPLEX DNA-Seq 试剂盒Rubicon GenomicsCAT. NO. R400406该试剂盒的使用至关重要；参见步骤 4.2
PCR 仪Bioer TechnologyTC-96GHbC
AMPure XP 试剂BECKMAN COULTER Life ScienceA63881
乙醇Wako054-027335
EB 缓冲液QIAGEN19086
2200 TapeStationAgilentG2965AA 
D1000 试剂Agilent5067-5583
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582
Qubit dsDNA BR 缓冲液/试剂ThermoFisher ScientificQ32850
Cubee Mini-CentrifugeRecenttecGenereachR5-AQBD01aqbd
MiSeq 600 循环 v3Illumina Inc.MS-102-3003
MiSeq 测序仪Illumina Inc.SY-410-1003

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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DNA DNA DNA

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