在微观生物的基因组测序过程中,污染问题仍然十分严重。本文介绍一种方法,仅需50 pg基因组DNA且无需全基因组扩增,即可对单个个体缓步动物的基因组进行测序,从而最大限度地降低污染风险。
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在微观生物的基因组测序过程中,污染问题仍然十分严重。本文介绍一种方法,仅需50 pg基因组DNA且无需全基因组扩增,即可对单个个体缓步动物的基因组进行测序,从而最大限度地降低污染风险。
缓步动物是一类在面临干燥胁迫时可进入一种称为隐生的状态的微型动物,该状态下其新陈代谢几乎停止,而在重新获得水分后可恢复至正常状态。对缓步动物等微型动物进行基因组测序时,容易受到细菌污染,有时会导致错误的结论,例如关于这些动物中水平基因转移程度的判断。本文提供了一种超低起始量的测序方法,可从单个缓步动物个体中完成对 Hypsibius dujardini 基因组的测序。通过严格的清洗与污染物排除,并高效提取单一个体中约 50 ~ 200 pg 的基因组 DNA,我们构建了适用于DNA测序仪的文库。所构建的文库具有高度可重复性和无偏性,对测序读段进行生物信息学分析,并与其他 H. dujardini 基因组数据进行比较,结果显示污染程度极低。该方法可应用于此前因无法培养而难以测序的缓步动物种类。
缓步动物是一类微小的动物,当面临干燥环境时可进入一种称为隐生的无代谢状态。它们通过吸收水分恢复生命活动1,2。在无代谢状态下,缓步动物能够耐受多种极端环境,包括极端温度3、压力4,5、高强度的紫外线照射6、X射线和γ射线7,8,以及宇宙空间环境9。基因组数据是研究隐生分子机制不可或缺的基础。
此前对缓步动物基因组进行测序的尝试均显示出细菌污染的迹象10,11,12,13,14。对这类微小生物进行基因组测序需要大量个体,且容易受到细菌污染;因此,我们此前已建立了一种超低起始量的测序方案,从单个缓步动物个体开始,以最大限度降低污染风险15。基于这些数据,我们进一步对 H. dujardini 的基因组进行了高质量的重测序与重新组装16,17 。本文将详细描述从单个缓步动物个体进行基因组测序的这一方法(图1)。该测序方法的验证并非本文的重点,已在我们此前的报告中进行了充分讨论16。
该方法包括两个部分:以尽可能低的污染程度分离单个缓步动物,以及从图谱水平高效提取DNA。将缓步动物饥饿处理后,用清水及抗生素充分冲洗,并在500倍显微镜下观察,以确保彻底去除任何细菌污染。先前的估算和测量表明,单个缓步动物个体含有约50–200 pg的基因组DNA16,可通过冻融循环或手工匀浆裂解几丁质外骨骼来提取该基因组DNA。提取的DNA用于文库构建,并在DNA测序仪上进行测序。进一步的生物信息学分析显示,与以往的缓步动物测序项目相比,本方法获得的测序数据质量高,且污染水平低。
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1. 准备
2. 样品制备与污染物排除
3. 匀浆化与DNA提取
4. 文库构建流程
| 温度 | 时间 | 循环次数 |
| 72 ˚C | 3 分钟 | |
| 85 ˚C | 2 分钟 | |
| 98 ˚C | 2 分钟 | |
| 98 ˚C | 20 秒 | 4 个循环 |
| 67 ˚C | 20 秒 | |
| 72 ˚C | 40 秒 | |
| 98 ˚C | 20 秒 | 16 个循环 |
| 72 ˚C | 50 秒 | |
| 4 ˚C | 保持 |
表1:PCR条件。
5. DNA的质量检测、定量与序列分析
注意:由于 DNA 量较少,此步骤之前不进行质量检测。
6. 计算分析
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污染物排除:
本方案包括对缓步动物进行彻底清洗,并使用抗生素处理以实现灭菌,从而最大限度地减少污染。此外,还需通过显微观察检查以确保上述步骤的完整性。在验证过程中(方案步骤2.4)拍摄的显微图像如图2所示。在500倍放大倍数下观察时,细菌细胞表现为围绕缓步动物个体移动的小颗粒。
DNA文库质量的验证:
构建的DNA-Seq文库总量约为109.5 ng(7.3 ng/µL × 15 µL)16。为验证片段化长度分布,电泳图谱应与
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细菌污染对微生物基因组测序构成威胁。尽管先前关于缓步动物基因组测序的研究已通过广泛的生物信息学方法过滤污染序列12,20我们对单个个体进行了基因组测序,以最大限度降低污染风险。由于单个缓步动物个体所含基因组DNA约为50 - 200 pg16 并且被包裹在一层厚厚的几丁质外骨骼中,因此排除污染物和高质量DNA提取是本方案中的关键步骤。现有的缓步动物培养物并非无菌,而从野外采集的个体体表携带大量污染物,其肠道内也含有食物残渣。此前的缓步动物基因组测序项目通常将10,000至100,000个个体合并为一个样本进行测序12,14,这意味着结果极有可能受到细菌污染物的影响。在他们的报告中,Boothby 等 收集 H. dujardini 利用个体的负趋光性行为14,且该组未采用任何...
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作者无任何利益冲突需要披露。
作者感谢Nozomi Abe、Yuki Takai和Nahoko Ishii在基因组测序方面的技术支持。本研究由日本学术振兴会(JSPS)研究会员资助项目、JSPS科研费青年研究(A)(编号22681029)、JSPS科研费科学研究(B)(编号17H03620)、住友财团基础科学研究项目资助(编号140340)资助,并部分得到日本山形县及鹤冈市研究资金的支持。Chlorella vulgaris(用于喂养缓步动物)由Chlorella Industry Co. LTD.惠赠提供。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SZ61 显微镜 | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| 青霉素-链霉素(10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 系统 | Keyence | ||
| 0.2 mL 硅涂层管 | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Microprep 试剂盒 | ZYMO Research | D3021 | 该试剂盒的使用至关重要;参见步骤 3.1 |
| 1.5 mL 微量离心管 | greiner bio-one | 616-201 | 参见 4.1.1 |
| 高速冷冻微量离心机 | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
| ThruPLEX DNA-Seq 试剂盒 | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | 该试剂盒的使用至关重要;参见步骤 4.2 |
| PCR 仪 | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP 试剂 | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| 乙醇 | Wako | 054-027335 | |
| EB 缓冲液 | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 试剂 | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR 缓冲液/试剂 | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 循环 v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq 测序仪 | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
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