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方法文章

小鼠远端结肠造口术:C57BL/6 小鼠分流性结肠炎的新模型

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DOI:

10.3791/57616

2018年7月12日

本文内容

摘要

小鼠远端结肠造口术为人类分流性结肠炎提供了一种小鼠模型,该模型表现为粪流绕行的结肠节段中以淋巴细胞性为主的结肠炎。

摘要

倒流性结肠炎(DC)是一种常见的临床病症,发生在因转流性肠造口术导致肠段脱离粪流的患者中。该疾病的病因尚不明确,但似乎与克罗恩病和溃疡性结肠炎等经典炎症性肠病的病因不同。由于缺乏合适的鼠类模型,针对导致该疾病发生机制的研究受到严重阻碍。本方案建立了一种DC的鼠类模型,有助于研究免疫系统在DC发生过程中的作用及其与微生物组的相互作用。在该模型中,使用C57BL/6动物,通过建立远端结肠造口使结肠远端部分脱离粪流,从而在被隔离的肠段中诱发轻度至中度炎症,并重现人类DC的典型病变,同时伴随中等程度的全身性炎症反应。与大鼠模型相比,目前已有大量基于C57BL/6背景的基因修饰小鼠模型可供使用。将这些动物与本模型结合,可评估个别细胞因子、趋化因子或生物活性分子受体(e.g.,白细胞介素(IL)-17;IL-10、趋化因子CXCL13、趋化因子受体CXCR5和CCR7,以及鞘氨醇-1-磷酸受体4)在DC发病机制中的潜在作用。此外,基于C57BL/6背景的同源近交小鼠品系的可获得性,极大地方便了细胞转移实验,以明确不同细胞类型在DC病因学中的作用。最后,该模型还提供了评估局部干预措施(e.g.,局部微生物组的调节或局部抗炎治疗)对受累及非受累肠段黏膜免疫以及全身免疫稳态影响的机会。

引言

近年来,临床上和组织病理学上已鉴定出大量不同于经典炎症性肠病(IBD;,克罗恩病或溃疡性结肠炎)的非感染性结肠炎类型。这些结肠炎类型的发病生理机制尚未完全阐明,部分原因是缺乏合适的动物模型。分流性结肠炎(diversion colitis)便是其中一种新近描述的类型。尽管该术语由Glotzer于1980年首次提出1,但类似表型的最初描述可追溯至1972年Morson的研究2。该疾病发生于50%至91%的转流性肠造口患者中,其临床严重程度存在差异3,4。鉴于美国每年约有120,000例结肠造口患者,这一疾病类型构成了重要的健康问题。

建立本方案的总体目标是提供一种依赖于与人类移植物抗宿主病(DC)相似的结肠炎触发因素的小鼠DC模型,并能够再现人类疾病的主要组织病理学特征。与其他小鼠结肠炎模型相比,本模型在诱导结肠炎时不需要使用基因修饰动物(例如,IL-7转基因小鼠、N-钙黏蛋白显性负性小鼠或TGFβ-/-小鼠)、化学刺激物质(例如,葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎或三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎),也不需要在免疫缺陷小鼠中转移特定细胞群体(如CD45RBhigh....

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方案

本文所述所有方法均已获得兽医政府主管部门(梅克伦堡-前波美拉尼亚州农业、食品安全与渔业局,(LALLF M-V))的批准。

1. 动物术前护理与准备

  1. 到达动物设施后,将动物(C57Bl/6)按体型相近分组,同组动物共同饲养,并在整个实验过程中保持分组不变。
    注意:使用同性别的动物。本文所述结果均使用雄性小鼠获得。
    注意:若使用雄性动物,应从7周龄开始将同组动物共同饲养,以建立等级 hierarchy,从而最大限度减少实验期间发生攻击性行为的风险。
  2. 手术前至少一周,更换为高能量(>14 MJ/kg)和高蛋白(>20%)饲料,饲料中需包含所有必需的微量元素和维生素(具体信息见材料清单)。
    注意:确保所有小鼠在手术时体重均不低于25 g。
  3. 通过腹腔注射氯胺酮(87 mg/kg i.p.)和盐酸赛拉嗪(13 mg/kg i.p.)诱导麻醉和镇痛。 等待至小鼠对机械刺激(如夹趾)无运动反应为止。
  4. 将麻醉后的小鼠用胶带固定于手术台上的加热垫上,保持仰卧位,确保手术过程中体位稳定,并避免体温过度散失。
    注意:加热垫表面温度应维持在36 °C至40 °C之间;手术室温度应为21 °C。

2. 远端结肠造口术

  1. 剃除腹部毛发。手术开始前,使用70%酒精和碘伏对术区进行三次消毒。铺巾....

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结果

手术在实验组(结肠造口术)和假手术组(结肠切开术)中均具有良好的耐受性。若手术操作及围手术期管理得当,围手术期死亡率不应超过10%。术后第一周,实验组和假手术组均出现明显的体重下降。假手术组动物通常在术后第4天达到体重最低点,而实验组则延迟一天出现。实验组的体重下降更为显著,可达初始体重的21.7%;相比之下,假手术组动物的体重下降为初始体重的10.8%。图2)6术后第一周体重降至最低点后,两组实验动物的体重均持续上升,但实验组体重增长斜率较慢。严重肠道炎症的体征和症状(,实验组和假手术组均未出现血性分泌物或液体样排便6)。造瘘组术后前60天的总死亡率约为40%,而肠切开组约为10%。大多数死亡发生在术后第一周(实验组为61%,假手术组为66%)。死亡原因如图所示。 图3.

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讨论

本方案中介绍的小鼠DC模型能够可靠地再现人类DC的组织病理学特征(例如,在发炎肠段的黏膜下层e.g.de novo形成淋巴滤泡、隐窝缩短以及杯状细胞数量减少)。除这一优势外,该模型由与人类极为相似的触发因素诱导产生,且临床病程表现为轻度至中度的严重程度,这与大多数患者的情况一致。

为了获得可重复的结果并控制围手术期死亡率在可接受范围内,需要具备一定的显微外科技术经验。然而,结肠造口术和假手术(结肠切开术)均可在围手术期死亡率极低(<10%)的情况下完成。以下操作步骤尤为重要:1)明确识别结肠和回肠末端。当回盲部解剖结构不清晰时,可通过是否存在成形粪便来确认结肠,通过是否存在派尔集合淋巴结(Peyer's patches)来确认回肠末端。2)在将结肠造口袢引出体外时,应确保肠系膜未发生扭曲,以避免肠系膜缺血和机械性肠梗阻。3)使用软管穿刺肠系膜时,应选择无血管区域,以防止出血和肠系膜缺血。4)在腹壁上制作小切口时,需检查止血是否充分;必要时,可采用热凝固法止住肌肉内血管的出血。5)确保结肠袢切口至少达到其周长的三分之二,并使后壁充分外翻,.......

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披露

所有作者均声明不存在任何利益冲突。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
手术材料
6 瓦加热垫ThermoLux, Witte + Sutor GmbH461265
70% 乙醇(含甲乙酮)格赖夫斯瓦尔德大学医院药房
木制涂药棒,单头小棉签,木柄,150 mm 长Centramed GmbH,德国8308370用于手术区域的消毒
剪刀Aesculap (BRAUN)BC064R
无创 DeBakey 镊子Aesculap (BRAUN)OC021R
持针器Aesculap (BRAUN)BM012R
Vasofix Safety i.v. 导管 22GBraun Melsungen AG,德国4268091S-01
VICRYL Plus 4-0 紫色编织线;V-5 17 mm 1/2 弧;70 cmETHICON, Inc.VCP994H
PDS II 6-0 单股线;V-18 13 mm 3/8 弧;70 cmETHICON, Inc.Z991H
BD Plastipak 1 mL(带针头的一次性无菌注射器)BD Medical305501
Triacid-N(N-十二烷基丙烷-1,3-二胺)ANTISEPTICA,德国18824-01用于超声波清洗槽中手术器械的消毒
药品
氯胺酮 10%,100 mg/mL(盐酸氯胺酮)selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH9089.01.0087 mg/kg i.p.
Xylasel,20 mg/mL(盐酸赛拉嗪)selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH400300.00.0013 mg/kg i.p.
0.9% 氯化钠Braun Melsungen AG,德国6697366.00.00
Buprenovet 0.3 mg/mL(丁丙诺啡)Bayer,德国PZN: 014988700.1 mg/kg s.c.
Tramal 滴剂,100 mg/mL(盐酸曲马多)Grünenthal GmbH,德国101168381 mg/mL 饮用水
Ceftriaxon-saar 2 g(头孢曲松) Cephasaar GmbH,德国PZN: 0884425225 mg/kg 体重 i.p.
甲硝唑 5 mg/mLBraun Melsungen AG,德国PZN: 0554351512.5 mg/kg 体重 i.p.
饲料
ssniff M-Z Ereichssniff,德国 V1184-3
固体饮料 Dehyprev Vit BIO,袋装TripleATrading,荷兰SDSHPV-75
设备
Nikon Eclipse Ci-LNikon Instruments Europe BV,德国光学显微镜
VetScan HM 5 Abaxis,美国770-9000兽用血液学分析仪,用于 50 µl 静脉 EDTA 抗凝血
Bandelin SONOREX(超声波清洗槽)Bandelin electronics,德国RK 100 H手术器械的消毒
软件
NIS-Element BR4 软件Nikon Instruments Europe BV,德国
GraphPad Prism 版本 6GraphPad Software, Inc.

参考文献

  1. Glotzer, D. J., Glick, M. E., Goldman, H. Proctitis and colitis following diversion of the fecal stream. Gastroenterology. 80, 438-441 (1981).
  2. Morson, B., Dawson, I. Gastrointestinal Pathology. , Blackwell Scientific Publications. London. (1972).
  3. Whelan, R. L., Abramson, D., Kim, D. S., Hashmi, H. F.

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重印与许可

标签

粪便转流结肠炎模型手术方案免疫系统微生物组相互作用组织学特征淋巴滤泡