小鼠远端结肠造口术为人类分流性结肠炎提供了一种小鼠模型，该模型表现为粪流绕行的结肠节段中以淋巴细胞性为主的结肠炎。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
倒流性结肠炎（DC）是一种常见的临床病症，发生在因转流性肠造口术导致肠段脱离粪流的患者中。该疾病的病因尚不明确，但似乎与克罗恩病和溃疡性结肠炎等经典炎症性肠病的病因不同。由于缺乏合适的鼠类模型，针对导致该疾病发生机制的研究受到严重阻碍。本方案建立了一种DC的鼠类模型，有助于研究免疫系统在DC发生过程中的作用及其与微生物组的相互作用。在该模型中，使用C57BL/6动物，通过建立远端结肠造口使结肠远端部分脱离粪流，从而在被隔离的肠段中诱发轻度至中度炎症，并重现人类DC的典型病变，同时伴随中等程度的全身性炎症反应。与大鼠模型相比，目前已有大量基于C57BL/6背景的基因修饰小鼠模型可供使用。将这些动物与本模型结合，可评估个别细胞因子、趋化因子或生物活性分子受体（e.g.，白细胞介素（IL）-17；IL-10、趋化因子CXCL13、趋化因子受体CXCR5和CCR7，以及鞘氨醇-1-磷酸受体4）在DC发病机制中的潜在作用。此外，基于C57BL/6背景的同源近交小鼠品系的可获得性，极大地方便了细胞转移实验，以明确不同细胞类型在DC病因学中的作用。最后，该模型还提供了评估局部干预措施（e.g.，局部微生物组的调节或局部抗炎治疗）对受累及非受累肠段黏膜免疫以及全身免疫稳态影响的机会。
引言
近年来，临床上和组织病理学上已鉴定出大量不同于经典炎症性肠病（IBD；即，克罗恩病或溃疡性结肠炎）的非感染性结肠炎类型。这些结肠炎类型的发病生理机制尚未完全阐明，部分原因是缺乏合适的动物模型。分流性结肠炎（diversion colitis）便是其中一种新近描述的类型。尽管该术语由Glotzer于1980年首次提出1，但类似表型的最初描述可追溯至1972年Morson的研究2。该疾病发生于50%至91%的转流性肠造口患者中，其临床严重程度存在差异3,4。鉴于美国每年约有120,000例结肠造口患者，这一疾病类型构成了重要的健康问题。
建立本方案的总体目标是提供一种依赖于与人类移植物抗宿主病（DC）相似的结肠炎触发因素的小鼠DC模型，并能够再现人类疾病的主要组织病理学特征。与其他小鼠结肠炎模型相比，本模型在诱导结肠炎时不需要使用基因修饰动物（例如，IL-7转基因小鼠、N-钙黏蛋白显性负性小鼠或TGFβ-/-小鼠）、化学刺激物质（例如，葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎或三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的结肠炎），也不需要在免疫缺陷小鼠中转移特定细胞群体（如CD45RBhigh细胞转移结肠炎模型）（综述见5）。与其他模型不同的是，本DC模型保留完整免疫系统，因而可用于评估参与DC发展的免疫学机制。黏膜炎症局限于被隔离的肠段，使得研究人员能够评估其对胃肠道其他部位黏膜免疫、肠段其他免疫区室（例如，派尔集合淋巴结和肠系膜淋巴结）免疫稳态以及整个机体免疫稳态的影响。最后，本模型为研究调控局部炎症刺激的机制提供了合适的工具，这些刺激源于局部微环境改变，涉及正常局部微生物组以及食物抗原的变化。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本文所述所有方法均已获得兽医政府主管部门（梅克伦堡-前波美拉尼亚州农业、食品安全与渔业局，(LALLF M-V)）的批准。
1. 动物术前护理与准备
- 到达动物设施后，将动物（C57Bl/6）按体型相近分组，同组动物共同饲养，并在整个实验过程中保持分组不变。
注意：使用同性别的动物。本文所述结果均使用雄性小鼠获得。
注意：若使用雄性动物，应从7周龄开始将同组动物共同饲养，以建立等级 hierarchy，从而最大限度减少实验期间发生攻击性行为的风险。 - 手术前至少一周，更换为高能量（>14 MJ/kg）和高蛋白（>20%）饲料，饲料中需包含所有必需的微量元素和维生素（具体信息见材料清单）。
注意：确保所有小鼠在手术时体重均不低于25 g。 - 通过腹腔注射氯胺酮（87 mg/kg i.p.）和盐酸赛拉嗪（13 mg/kg i.p.）诱导麻醉和镇痛。 等待至小鼠对机械刺激（如夹趾）无运动反应为止。
- 将麻醉后的小鼠用胶带固定于手术台上的加热垫上，保持仰卧位，确保手术过程中体位稳定，并避免体温过度散失。
注意：加热垫表面温度应维持在36 °C至40 °C之间；手术室温度应为21 °C。
2. 远端结肠造口术
- 剃除腹部毛发。手术开始前，使用70%酒精和碘伏对术区进行三次消毒。铺巾以确保无菌条件。
- 沿腹白线切开腹壁肌肉和腹膜，行15毫米正中剖腹切口，以尽量减少出血。
- 使用两把DeBakey无创镊，小心地将盲肠、回肠末端以及升结肠和横结肠从腹腔中取出。
注意：应严格限制对肠管的机械操作，以避免损伤肠系膜结构。 - 确定盲肠极、升结肠和小肠（图1a和1b）。
注意：正确识别升结肠对于结肠造口的准确定位至关重要。当回盲部解剖结构不明确时，派尔集合淋巴结（Peyer's patches）的存在可确认为小肠，而成形粪便的存在则可判定为结肠。 - 使用直尺确定未来结肠造口的位置。对于远端结肠造口，应将其置于回盲瓣远端20 mm处。
- 在右上腹象限的腹壁上做第二个3毫米切口。将先前已识别的结肠段经此切口拉出，形成肠袢，注意避免扭曲肠袢。
- 小心地将22号柔性静脉导管穿过肠系膜。注意避免损伤肠系膜血管结构。
- 将肠管复位至腹膜腔内。
- 使用简单的缝合和可吸收缝线将柔性管的两端固定在皮肤上例如，聚乳酸-羟基乙酸共聚物910或聚羟基乙酸4-0 1/2c）。
- 在关闭剖腹切口前，通过腹腔内注射0.5 mL 0.9%氯化钠溶液进行液体复苏。
- 使用可吸收缝线连续缝合腹膜和肌肉层例如， 使用可吸收缝线（如聚乳酸-羟基乙酸共聚物910或Polyfil 4-0 1/2c）行连续缝合关闭皮肤。
- 使用精细剪刀对暴露的结肠袢进行次全横断，打开结肠腔。操作时避免损伤肠系膜，切勿将结肠完全切断。
- 使用单丝可吸收缝线，以三个单个全层缝合针将每个结肠造口开口固定于腹膜和皮肤例如，聚对二氧环己酮或单丝6-0 3/8圆针）。此时，传入袢（功能性端结肠造口）与传出袢（黏液瘘）已明确分开（图1c).
注意：操作时间应少于20分钟，以减少液体和热量的散失。 - 手术结束后，根据制造商说明，使用不含醛类的消毒液在超声波清洗仪中对器械进行消毒。
3. 假手术（结肠切开术）
- 执行步骤 1.1 至 2.4
- 使用直尺确定未来的结肠切开位置。结肠切开位置应距离回盲瓣与实验组中结肠造口相同的距离。
- 用精细剪刀将结肠剪开，切口长度至少达到结肠周长的三分之二。
- 用单股可吸收缝线进行单层全层间断缝合关闭肠切口例如， 聚对二氧环己酮，单丝6-0 3/8圆针。
注意：对于有经验的外科医生，手术时间应少于20分钟，以减少液体和热能的丢失。 - 执行步骤 2.10、2.11 和 2.14
4. 术后护理
- 将动物放回笼中。提供37 °C的适宜环境（例如，使用红外灯），直至小鼠完全清醒。随后，将小鼠置于温度和湿度受控的环境中（21 °C；相对湿度30% ± 10%）。自由供应食物和饮用水。为促进液体摄入，额外提供浸水的动物饲料。
- 当动物对机械刺激出现反应时，皮下注射0.1 mg/kg体重的丁丙诺啡，开始术后镇痛。注意避免呼吸抑制。
- 在术后第一周内，向饮用水中添加1 mg/mL曲马多，以持续镇痛。
- 为弥补因活动减少导致的液体摄入下降，在术后第一周内于笼中提供固体饮水垫。
- 术后第一周每日称量动物体重并评估行为学评分，第一个月其余时间每两天一次，第二个月每三天一次，采用Kleinwort et al.6所述的疾病严重程度评分标准。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
手术在实验组（结肠造口术）和假手术组（结肠切开术）中均具有良好的耐受性。若手术操作及围手术期管理得当，围手术期死亡率不应超过10%。术后第一周，实验组和假手术组均出现明显的体重下降。假手术组动物通常在术后第4天达到体重最低点，而实验组则延迟一天出现。实验组的体重下降更为显著，可达初始体重的21.7%；相比之下，假手术组动物的体重下降为初始体重的10.8%。图2)6术后第一周体重降至最低点后，两组实验动物的体重均持续上升，但实验组体重增长斜率较慢。严重肠道炎症的体征和症状（即，实验组和假手术组均未出现血性分泌物或液体样排便6）。造瘘组术后前60天的总死亡率约为40%，而肠切开组约为10%。大多数死亡发生在术后第一周（实验组为61%，假手术组为66%）。死亡原因如图所示。 图3.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案中介绍的小鼠DC模型能够可靠地再现人类DC的组织病理学特征（例如，在发炎肠段的黏膜下层e.g.，de novo形成淋巴滤泡、隐窝缩短以及杯状细胞数量减少）。除这一优势外，该模型由与人类极为相似的触发因素诱导产生，且临床病程表现为轻度至中度的严重程度，这与大多数患者的情况一致。
为了获得可重复的结果并控制围手术期死亡率在可接受范围内，需要具备一定的显微外科技术经验。然而，结肠造口术和假手术（结肠切开术）均可在围手术期死亡率极低（<10%）的情况下完成。以下操作步骤尤为重要：1）明确识别结肠和回肠末端。当回盲部解剖结构不清晰时，可通过是否存在成形粪便来确认结肠，通过是否存在派尔集合淋巴结（Peyer's patches）来确认回肠末端。2）在将结肠造口袢引出体外时，应确保肠系膜未发生扭曲，以避免肠系膜缺血和机械性肠梗阻。3）使用软管穿刺肠系膜时，应选择无血管区域，以防止出血和肠系膜缺血。4）在腹壁上制作小切口时，需检查止血是否充分；必要时，可采用热凝固法止住肌肉内血管的出血。5）确保结肠袢切口至少达到其周长的三分之二，并使后壁充分外翻，...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
所有作者均声明不存在任何利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 手术材料 | |||
| 6 瓦加热垫 | ThermoLux, Witte + Sutor GmbH | 461265 | |
| 70% 乙醇（含甲乙酮） | 格赖夫斯瓦尔德大学医院药房 | ||
| 木制涂药棒，单头小棉签，木柄，150 mm 长 | Centramed GmbH，德国 | 8308370 | 用于手术区域的消毒 |
| 剪刀 | Aesculap (BRAUN) | BC064R | |
| 无创 DeBakey 镊子 | Aesculap (BRAUN) | OC021R | |
| 持针器 | Aesculap (BRAUN) | BM012R | |
| Vasofix Safety i.v. 导管 22G | Braun Melsungen AG，德国 | 4268091S-01 | |
| VICRYL Plus 4-0 紫色编织线；V-5 17 mm 1/2 弧；70 cm | ETHICON, Inc. | VCP994H | |
| PDS II 6-0 单股线；V-18 13 mm 3/8 弧；70 cm | ETHICON, Inc. | Z991H | |
| BD Plastipak 1 mL（带针头的一次性无菌注射器） | BD Medical | 305501 | |
| Triacid-N（N-十二烷基丙烷-1,3-二胺） | ANTISEPTICA，德国 | 18824-01 | 用于超声波清洗槽中手术器械的消毒 |
| 药品 | |||
| 氯胺酮 10%，100 mg/mL（盐酸氯胺酮） | selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH | 9089.01.00 | 87 mg/kg i.p. |
| Xylasel，20 mg/mL（盐酸赛拉嗪） | selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH | 400300.00.00 | 13 mg/kg i.p. |
| 0.9% 氯化钠 | Braun Melsungen AG，德国 | 6697366.00.00 | |
| Buprenovet 0.3 mg/mL（丁丙诺啡） | Bayer，德国 | PZN: 01498870 | 0.1 mg/kg s.c. |
| Tramal 滴剂，100 mg/mL（盐酸曲马多） | Grünenthal GmbH，德国 | 10116838 | 1 mg/mL 饮用水 |
| Ceftriaxon-saar 2 g（头孢曲松） | Cephasaar GmbH，德国 | PZN: 08844252 | 25 mg/kg 体重 i.p. |
| 甲硝唑 5 mg/mL | Braun Melsungen AG，德国 | PZN: 05543515 | 12.5 mg/kg 体重 i.p. |
| 饲料 | |||
| ssniff M-Z Ereich | ssniff，德国 | V1184-3 | |
| 固体饮料 Dehyprev Vit BIO，袋装 | TripleATrading，荷兰 | SDSHPV-75 | |
| 设备 | |||
| Nikon Eclipse Ci-L | Nikon Instruments Europe BV，德国 | 光学显微镜 | |
| VetScan HM 5 | Abaxis，美国 | 770-9000 | 兽用血液学分析仪，用于 50 µl 静脉 EDTA 抗凝血 |
| Bandelin SONOREX（超声波清洗槽） | Bandelin electronics，德国 | RK 100 H | 手术器械的消毒 |
| 软件 | |||
| NIS-Element BR4 软件 | Nikon Instruments Europe BV，德国 | ||
| GraphPad Prism 版本 6 | GraphPad Software, Inc. |
参考文献
- Glotzer, D. J., Glick, M. E., Goldman, H. Proctitis and colitis following diversion of the fecal stream. Gastroenterology. 80, 438-441 (1981).
- Morson, B., Dawson, I. Gastrointestinal Pathology. , Blackwell Scientific Publications. London. (1972).
- Whelan, R. L., Abramson, D., Kim, D. S., Hashmi, H. F. Diversion colitis. A prospective study. Surg Endosc. 8, 19-24 (1994).
- Haas, P. A., Fox, T. A., Szilagy, E. J. Endoscopic examination of the colon and rectum distal to a colostomy. Am J Gastroenterol. 85, 850-854 (1990).
- Valatas, V., Bamias, G., Kolios, G. Experimental colitis models: Insights into the pathogenesis of inflammatory bowel disease and translational issues. Eur J Pharmacol. 759, 253-264 (2015).
- Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Heidecke, C. D., Schulze, T. Deviation of the Fecal Stream in Colonic Bowel Segments Results in Increased Numbers of Isolated Lymphoid Follicles in the Submucosal Compartment in a Novel Murine Model of Diversion Colitis. Biomed Res Int. 2017, 13(2017).
- Tangjarukij, C., Navasumrit, P., Zelikoff, J. T., Ruchirawat, M. The effects of pyridoxine deficiency and supplementation on hematological profiles, lymphocyte function, and hepatic cytochrome P450 in B6C3F1 mice. J Immunotoxicol. 6, 147-160 (2009).
- Soave, O., Brand, C. D. Coprophagy in animals: a review. Cornell Vet. 81, 357-364 (1991).
- Ebino, K. Y., Yoshinaga, K., Suwa, T., Kuwabara, Y., Takahashi, K. W. Effects of prevention of coprophagy on pregnant mice--is coprophagy beneficial on a balanced diet. Jikken Dobutsu. 38, 245-252 (1989).
- Babickova, J., Tothova, L., Lengyelova, E., Bartonova, A., Hodosy, J., Gardlik, R., Celec, P. Sex Differences in Experimentally Induced Colitis in Mice: a Role for Estrogens. Inflammation. 38, 1996-2006 (2015).
- Lee, S. M., Kim, N., Son, H. J., Park, J. H., Nam, R. H., Ham, M. H., Choi, D., Sohn, S. H., Shin, E., Hwang, Y. J., et al. The Effect of Sex on the Azoxymethane/Dextran Sulfate Sodium-treated Mice Model of Colon Cancer. J Cancer Prev. 21, 271-278 (2016).
- Angele, M. K., Pratschke, S., Hubbard, W. J., Chaudry, I. H. Gender differences in sepsis: cardiovascular and immunological aspects. Virulence. 5, 12-19 (2013).
- Brown, R. Z. Social Behaviour, reproduction, and population changes in the house mouse (Mus musculus L). Eccological Monographs. 23, 788-795 (1953).
- Poole, T. B., Morgan, H. D. R. Differences in aggressive behaviour betweeen male mice (Mus musculus L.) in colonies of different sizes. Animal Behaviour. 21, 788-795 (1973).
- Pasquarelli, N., Voehringer, P., Henke, J., Ferger, B. Effect of a change in housing conditions on body weight, behavior and brain neurotransmitters in male C57BL/6J mice. Behav Brain Res. 333, 35-42 (2017).
- Langgartner, D., Foertsch, S., Fuchsl, A. M., Reber, S. O. Light and water are not simple conditions: fine tuning of animal housing in male C57BL/6 mice. Stress. 20, 10-18 (2017).
- Nicholson, A., Malcolm, R. D., Russ, P. L., Cough, K., Touma, C., Palme, R., Wiles, M. V. The response of C57BL/6J and BALB/cJ mice to increased housing density. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 740-753 (2009).
- Buchler, G., Wos-Oxley, M. L., Smoczek, A., Zschemisch, N. H., Neumann, D., Pieper, D. H., Hedrich, H. J., Bleich, A. Strain-specific colitis susceptibility in IL10-deficient mice depends on complex gut microbiota-host interactions. Inflamm Bowel Dis. 18, 943-954 (2012).
- Nakanishi, M., Tazawa, H., Tsuchiya, N., Sugimura, T., Tanaka, T., Nakagama, H. Mouse strain differences in inflammatory responses of colonic mucosa induced by dextran sulfate sodium cause differential susceptibility to PhIP-induced large bowel carcinogenesis. Cancer Sci. 98, 1157-1163 (2007).
- Mahler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, 544-551 (1998).
- Mekada, K., Abe, K., Murakami, A., Nakamura, S., Nakata, H., Moriwaki, K., Obata, Y., Yoshiki, A. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58, 141-149 (2009).
- Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Vet Pathol. 49, 32-43 (2012).
- Mills, C. D., Kincaid, K., Alt, J. M., Heilman, M. J., Hill, A. M. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. J Immunol. 164, 6166-6173 (2000).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
