小鼠远端结肠造口术：C57BL/6 小鼠分流性结肠炎的新模型

摘要

小鼠远端结肠造口术为人类分流性结肠炎提供了一种小鼠模型，该模型表现为粪流绕行的结肠节段中以淋巴细胞性为主的结肠炎。

摘要

倒流性结肠炎（DC）是一种常见的临床病症，发生在因转流性肠造口术导致肠段脱离粪流的患者中。该疾病的病因尚不明确，但似乎与克罗恩病和溃疡性结肠炎等经典炎症性肠病的病因不同。由于缺乏合适的鼠类模型，针对导致该疾病发生机制的研究受到严重阻碍。本方案建立了一种DC的鼠类模型，有助于研究免疫系统在DC发生过程中的作用及其与微生物组的相互作用。在该模型中，使用C57BL/6动物，通过建立远端结肠造口使结肠远端部分脱离粪流，从而在被隔离的肠段中诱发轻度至中度炎症，并重现人类DC的典型病变，同时伴随中等程度的全身性炎症反应。与大鼠模型相比，目前已有大量基于C57BL/6背景的基因修饰小鼠模型可供使用。将这些动物与本模型结合，可评估个别细胞因子、趋化因子或生物活性分子受体（e.g.，白细胞介素（IL）-17；IL-10、趋化因子CXCL13、趋化因子受体CXCR5和CCR7，以及鞘氨醇-1-磷酸受体4）在DC发病机制中的潜在作用。此外，基于C57BL/6背景的同源近交小鼠品系的可获得性，极大地方便了细胞转移实验，以明确不同细胞类型在DC病因学中的作用。最后，该模型还提供了评估局部干预措施（e.g.，局部微生物组的调节或局部抗炎治疗）对受累及非受累肠段黏膜免疫以及全身免疫稳态影响的机会。

引言

近年来，临床上和组织病理学上已鉴定出大量不同于经典炎症性肠病（IBD；即，克罗恩病或溃疡性结肠炎）的非感染性结肠炎类型。这些结肠炎类型的发病生理机制尚未完全阐明，部分原因是缺乏合适的动物模型。分流性结肠炎（diversion colitis）便是其中一种新近描述的类型。尽管该术语由Glotzer于1980年首次提出¹，但类似表型的最初描述可追溯至1972年Morson的研究²。该疾病发生于50%至91%的转流性肠造口患者中，其临床严重程度存在差异^3,4。鉴于美国每年约有120,000例结肠造口患者，这一疾病类型构成了重要的健康问题。

建立本方案的总体目标是提供一种依赖于与人类移植物抗宿主病（DC）相似的结肠炎触发因素的小鼠DC模型，并能够再现人类疾病的主要组织病理学特征。与其他小鼠结肠炎模型相比，本模型在诱导结肠炎时不需要使用基因修饰动物（例如，IL-7转基因小鼠、N-钙黏蛋白显性负性小鼠或TGFβ^-/-小鼠）、化学刺激物质（例如，葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎或三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的结肠炎），也不需要在免疫缺陷小鼠中转移特定细胞群体（如CD45RB^high....

方案

本文所述所有方法均已获得兽医政府主管部门（梅克伦堡-前波美拉尼亚州农业、食品安全与渔业局，(LALLF M-V)）的批准。

1. 动物术前护理与准备

1. 到达动物设施后，将动物（C57Bl/6）按体型相近分组，同组动物共同饲养，并在整个实验过程中保持分组不变。
   注意：使用同性别的动物。本文所述结果均使用雄性小鼠获得。
   注意：若使用雄性动物，应从7周龄开始将同组动物共同饲养，以建立等级 hierarchy，从而最大限度减少实验期间发生攻击性行为的风险。
2. 手术前至少一周，更换为高能量（>14 MJ/kg）和高蛋白（>20%）饲料，饲料中需包含所有必需的微量元素和维生素（具体信息见材料清单）。
   注意：确保所有小鼠在手术时体重均不低于25 g。
3. 通过腹腔注射氯胺酮（87 mg/kg i.p.）和盐酸赛拉嗪（13 mg/kg i.p.）诱导麻醉和镇痛。 等待至小鼠对机械刺激（如夹趾）无运动反应为止。
4. 将麻醉后的小鼠用胶带固定于手术台上的加热垫上，保持仰卧位，确保手术过程中体位稳定，并避免体温过度散失。
   注意：加热垫表面温度应维持在36 °C至40 °C之间；手术室温度应为21 °C。

2. 远端结肠造口术

1. 剃除腹部毛发。手术开始前，使用70%酒精和碘伏对术区进行三次消毒。铺巾....

结果

手术在实验组（结肠造口术）和假手术组（结肠切开术）中均具有良好的耐受性。若手术操作及围手术期管理得当，围手术期死亡率不应超过10%。术后第一周，实验组和假手术组均出现明显的体重下降。假手术组动物通常在术后第4天达到体重最低点，而实验组则延迟一天出现。实验组的体重下降更为显著，可达初始体重的21.7%；相比之下，假手术组动物的体重下降为初始体重的10.8%。图2)⁶术后第一周体重降至最低点后，两组实验动物的体重均持续上升，但实验组体重增长斜率较慢。严重肠道炎症的体征和症状（即，实验组和假手术组均未出现血性分泌物或液体样排便⁶）。造瘘组术后前60天的总死亡率约为40%，而肠切开组约为10%。大多数死亡发生在术后第一周（实验组为61%，假手术组为66%）。死亡原因如图所示。 图3.

讨论

本方案中介绍的小鼠DC模型能够可靠地再现人类DC的组织病理学特征（例如，在发炎肠段的黏膜下层e.g.，de novo形成淋巴滤泡、隐窝缩短以及杯状细胞数量减少）。除这一优势外，该模型由与人类极为相似的触发因素诱导产生，且临床病程表现为轻度至中度的严重程度，这与大多数患者的情况一致。

为了获得可重复的结果并控制围手术期死亡率在可接受范围内，需要具备一定的显微外科技术经验。然而，结肠造口术和假手术（结肠切开术）均可在围手术期死亡率极低（<10%）的情况下完成。以下操作步骤尤为重要：1）明确识别结肠和回肠末端。当回盲部解剖结构不清晰时，可通过是否存在成形粪便来确认结肠，通过是否存在派尔集合淋巴结（Peyer's patches）来确认回肠末端。2）在将结肠造口袢引出体外时，应确保肠系膜未发生扭曲，以避免肠系膜缺血和机械性肠梗阻。3）使用软管穿刺肠系膜时，应选择无血管区域，以防止出血和肠系膜缺血。4）在腹壁上制作小切口时，需检查止血是否充分；必要时，可采用热凝固法止住肌肉内血管的出血。5）确保结肠袢切口至少达到其周长的三分之二，并使后壁充分外翻，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
手术材料
6 瓦加热垫	ThermoLux, Witte + Sutor GmbH	461265
70% 乙醇（含甲乙酮）	格赖夫斯瓦尔德大学医院药房
木制涂药棒，单头小棉签，木柄，150 mm 长	Centramed GmbH，德国	8308370	用于手术区域的消毒
剪刀	Aesculap (BRAUN)	BC064R
无创 DeBakey 镊子	Aesculap (BRAUN)	OC021R
持针器	Aesculap (BRAUN)	BM012R
Vasofix Safety i.v. 导管 22G	Braun Melsungen AG，德国	4268091S-01
VICRYL Plus 4-0 紫色编织线；V-5 17 mm 1/2 弧；70 cm	ETHICON, Inc.	VCP994H
PDS II 6-0 单股线；V-18 13 mm 3/8 弧；70 cm	ETHICON, Inc.	Z991H
BD Plastipak 1 mL（带针头的一次性无菌注射器）	BD Medical	305501
Triacid-N（N-十二烷基丙烷-1,3-二胺）	ANTISEPTICA，德国	18824-01	用于超声波清洗槽中手术器械的消毒
药品
氯胺酮 10%，100 mg/mL（盐酸氯胺酮）	selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH	9089.01.00	87 mg/kg i.p.
Xylasel，20 mg/mL（盐酸赛拉嗪）	selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH	400300.00.00	13 mg/kg i.p.
0.9% 氯化钠	Braun Melsungen AG，德国	6697366.00.00
Buprenovet 0.3 mg/mL（丁丙诺啡）	Bayer，德国	PZN: 01498870	0.1 mg/kg s.c.
Tramal 滴剂，100 mg/mL（盐酸曲马多）	Grünenthal GmbH，德国	10116838	1 mg/mL 饮用水
Ceftriaxon-saar 2 g（头孢曲松）	Cephasaar GmbH，德国	PZN: 08844252	25 mg/kg 体重 i.p.
甲硝唑 5 mg/mL	Braun Melsungen AG，德国	PZN: 05543515	12.5 mg/kg 体重 i.p.
饲料
ssniff M-Z Ereich	ssniff，德国	V1184-3
固体饮料 Dehyprev Vit BIO，袋装	TripleATrading，荷兰	SDSHPV-75
设备
Nikon Eclipse Ci-L	Nikon Instruments Europe BV，德国		光学显微镜
VetScan HM 5	Abaxis，美国	770-9000	兽用血液学分析仪，用于 50 µl 静脉 EDTA 抗凝血
Bandelin SONOREX（超声波清洗槽）	Bandelin electronics，德国	RK 100 H	手术器械的消毒
软件
NIS-Element BR4 软件	Nikon Instruments Europe BV，德国
GraphPad Prism 版本 6	GraphPad Software, Inc.