在此，我们介绍一种用于调控心脏内自主神经系统并评估其对基础电生理学、心律失常发生机制及cAMP动态影响的方案，该方案采用一种 离体 朗根多夫装置
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摘要
摘要
自20世纪末发明以来th 世纪，兰格多夫 离体 心脏灌注系统仍是研究去中枢神经支配心脏中一系列生理学、生物化学、形态学及药理学参数的重要工具。本文介绍了一种用于调控心脏内自主神经系统并评估其对基础电生理学、心律失常发生机制及环磷酸腺苷（cAMP）动态影响的实验装置。心脏内自主神经系统的调控可通过机械分离主要含有小鼠神经节的房脂肪垫实现，也可通过全局性或靶向性药理学干预手段进行。将八极电生理导管置入右心房和右心室，并使用心外膜多电极阵列（MEA）进行高分辨率标测，以测定心脏电生理特性及心律失常的发生情况。通过荧光共振能量转移（FRET）成像技术，实时监测心脏不同区域的cAMP水平。采用基于抗体的全心染色方法，结合神经元标记物进行神经形态学研究，以指导在实验中识别和调控心脏内自主神经系统中的特定靶点。 离体 Langendorff 灌流系统可在短时间内实现大量可重复的实验。然而，该系统的部分开放性（例如在MEA测量期间，难以实现恒温控制，应尽量减少此类情况。本方法可实现对离体心脏内心脏自主神经系统进行分析和调节。
引言
兰格多夫 离体 心脏灌注系统仍是开展去神经支配心脏的生理学、生物化学、形态学及药理学研究的重要工具1,2,3,4,5 自20世纪末发明以来th 世纪6迄今为止，该系统仍被广泛应用于各种研究课题（例如，缺血再灌注）或研究心脏药理学效应7,8，是心血管研究中的基本工具。该方法之所以经久不衰，源于其多项优势（例如，可在不受中枢神经系统或其他器官、体循环或循环激素影响的情况下进行测量。如有需要，可将药物以受控方式加入灌注液中，或直接施加于特定结构。实验具有良好的可重复性，且可在较短时间内完成相对大量的实验。由于装置具有部分开放的特性，可能难以实现精确的温度控制，需在实验设计中予以考虑。尽管朗根多夫（Langendorff）系统也用于较大型物种9，主要使用较小的动物，因为实验装置较为简单，且生物变异性更大（例如，可使....
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方案
所有涉及动物的实验程序均经汉堡州地方主管部门及汉堡大学动物护理与使用委员会批准。
1. 兰格多夫装置的准备
注意：使用市售的 Langendorff 灌注系统。
- 配制改良的 Krebs-Henseleit 溶液（119 mM 氯化钠、25 mM 碳酸氢钠、4.6 mM 氯化钾、1.2 mM 一磷酸钾、1.1 mM 硫酸镁、2.5 mM 氯化钙、8.3 mM 葡萄糖和 2 mM 丙酮酸钠）。向灌注液中通入 95% 氧气和 5% 二氧化碳的混合气体，以防止钙盐沉淀。使用孔径为 0.22 µm 的滤器过滤缓冲液。
- 根据需要向缓冲液中添加药理学试剂，以研究其对心脏电生理和心律失常发生的影响。
- 启动水浴并将其内灌注液（含 95% 氧气和 5% 二氧化碳混合气体）放入其中。调节水浴温度，使灌注液在到达灌流插管前的温度约为 37 ˚C。
- 当温度达到设定值后，立即启动蠕动泵，并用灌注液填充装置。
- 在连接心脏前调节泵速，确保将插管安装至装置时，插管内无残留气泡。
2. 硬件和软件准备
- 将数字数据采集系统及其配套软件连接至Langendorff装置，以持续记录灌注压、流速和心率。
- 在常规设置中将目标灌注压设定为80 mmH....
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结果
图1展示了包含两个多电极阵列（MEAs）的兰格多夫装置图像。实验前，将心内导管置于靠近套管的位置，以便快速、顺利地插入右心房/右心室，并确保在最短时间内开始平衡过程。通过升高腔室的下部（见图1中的箭头），可完全闭合腔室，从而保证温度稳定。
图2 显示不同代表性的心脏染色结果。在 图2A 苏木精和伊红（H&E) 展示了石蜡切片的染色结果。在示例性放大图中（图2B），心房神经节的免疫组织化学染色显示，以副交感神经细胞为主（红色，ChAT阳性），而交感神经细胞较少（绿色，TH阳性）。在 图 2C<.......
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讨论
本文介绍了一种著名的离体心脏灌注系统——Langendorff ex vivo 心脏灌注系统，该系统结合不同的标测和刺激技术（包括心内膜和心外膜方法），可用于研究心内神经元对心脏电生理学及心律失常发生的影响。
该实验方案中有多个关键步骤。首先，必须采用一种能够保持心房脂肪垫完整或在不损伤心肌的前提下快速将其去除的制备技术。其次，需在右心房切开一个大小合适的开口，以便八极导管顺利插入右心房和右心室。导管应能轻松进入右心室，且不产生额外压力。在将导管连接至套管时，应避免导管进一步深入心室，以防造成心脏损伤。第三，温度控制是所有兰格多夫（Langendorff）装置中的关键环节1,2,5。在心律失常检测期间，应关闭温控室以维持稳定的温度；但在进行MEA或FRET记录时，温控室需至少部分打开以允许测量操作。此时应尽量缩短记录时间，或采取其他减少热量散失的措施，例如在较长时间的测量过程中用.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Hartwig Wieboldt 提供出色的技术支持，以及汉堡埃彭多夫大学医学中心 UKE 显微成像中心（Umif）提供显微镜设备与支持。本研究由汉堡大学心脏中心促进协会（Förderverein des Universitären Herzzentrums Hamburg e.V.）和德国心血管研究中心（DZHK）[资助编号 81Z4710141] 提供资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S3014 | 改良克雷布斯-亨莱溶液 |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | 401676 | 改良克雷布斯-亨莱溶液 |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P5405 | 改良克雷布斯-亨莱溶液 |
| 磷酸二氢钾 | Sigma-Aldrich | P5655 | 改良克雷布斯-亨莱溶液 |
| 七水硫酸镁 | Sigma-Aldrich | M1880 | 改良克雷布斯-亨莱溶液 |
| 二水合氯化钙 | Sigma-Aldrich | C7902 | 改良克雷布斯-亨莱溶液 |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G5767 | 改良克雷布斯-亨莱溶液 |
| 丙酮酸钠 bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | 改良克雷布斯-亨莱溶液 |
| 碳合气（95% O₂ + 5% CO₂）2 / 5% CO₂2) | SOL-Group，TMG 技术与医疗气体有限公司，克雷费尔德，格尔茨霍芬，德国 | 改良克雷布斯-亨莱溶液 | |
| 无菌滤器 Steritop-GP 0.22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | 改良克雷布斯-亨莱溶液 |
| 硫酸阿托品 | Sigma-Aldrich | A0257 | 神经调节 |
| 氯化六甲双铵 | Sigma-Aldrich | H2138 | 神经调节 |
| 烟碱游离碱 98-100% | Sigma-Aldrich | N3876 | 神经调节 |
| 10% 中性缓冲福尔马林溶液 | Sigma-Aldrich | HT501128 | 整体染色 |
| 三(羟甲基)氨基甲烷 | Sigma-Aldrich | 252859 | 整体染色 |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 34860 | 整体染色 |
| 30%（w/w）的过氧化氢水溶液 | 默克，KGA，德国达姆施塔特 | H1009 | 整体染色 |
| 二甲基亚砜 | 德国达姆施塔特默克公司 | D8418 | 整体染色 |
| 磷酸盐缓冲液片剂 | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | 整体染色 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 整体染色 |
| 牛血清白蛋白第五组分 | Biomol，德国汉堡 | 11924.03 | 整体染色 |
| 鸡抗神经丝蛋白 | EMD Millipore | AB5539 | 整体染色 |
| 兔抗酪氨酸羟化酶 | EMD Millipore | AB152 | 整体染色 |
| 山羊抗胆碱乙酰转移酶 | EMD Millipore | AP144P | 整体染色 |
| 驴 α 兔IgG Alexa 488 | 赛默飞世尔科技 | A21206 | 整体染色 |
| 驴 α 山羊IgG Alexa 568 | 赛默飞世尔科技 | A11057 | 整体染色 |
| 驴 α 鸡IgY Alexa 647 | 默克，KGA，德国达姆施塔特 | AP194SA6 | 整体染色 |
| 生物素偶联的驴 α 兔IgG | R&D Systems | AP182B | 整体染色 |
| 生物素偶联的驴 α 山羊IgG | R&D Systems | AP192P | 整体染色 |
| 生物素偶联的山羊 α 鸡IgY | R&D Systems | BAD010 | 整体染色 |
| Vectashield封片剂 | Vector Laboratories，伯林盖姆，加利福尼亚州，美国 | H-1000 | 免疫组织化学 |
| Vectastain ABC试剂盒 | Vector Laboratories，伯林盖姆，加利福尼亚州，美国 | PK-4000 | 免疫组织化学 |
| 稳定型 DAB/Plus | Abcam plc，英国剑桥 | ab103723 | 整体染色 |
| HistoClear | DiaTec，德国班贝格 | HS2002 | 免疫组织化学 |
| 双苯并咪唑 H33342 三盐酸盐（Hoechst） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | B2261 | 免疫组织化学 |
| Vectashield HardSet 封片剂 | Vector Laboratories，伯林盖姆，加利福尼亚州，美国 | VEC-H-1400 | 免疫组织化学 |
| 灌注系统 | HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH，德国马尔-哈格斯泰滕 | 73-4343 | 朗根多夫装置 |
| 数据采集系统及其用于导管和生理参数的配套软件 | Powerlab 8/30 && Labchart，ADInstruments，达尼丁，新西兰 | PL3508 PowerLab 8/35 | 朗根多夫装置 |
| 八极导管 | CIB’ER 小鼠，NuMed 公司，美国纽约州霍普金顿 | 定制 | 朗根多夫装置 |
| 刺激发生器 | STG4002，Multi Channel Systems，德国吕特林根 | STG4002-160µA | 刺激设置 |
| 刺激软件 | Multi Channel Systems，德国吕特林根 | MC_刺激 II | 刺激设置 |
| 心外膜心电图数据采集系统及相应软件 | ME128-FAI-MPA-系统，Multi Channel Systems，德国吕特林根 | USB-ME128-系统 | MEA 设置 |
| 多电极阵列 | MEA，EcoFlexMEA36，Multi Channel Systems，德国吕特lingen | EcoFlexMEA36 | MEA 设置 |
| 多电极阵列记录软件 | Multi Channel Systems，德国吕特林根 | MC_Rack | MEA装置设置 |
| 弹簧剪 | Fine Science Tools GmbH，德国海德堡 | 15003-08 | 心脏制备 |
| 斜视剪刀 | Fine Science Tools GmbH，德国海德堡 | 14575-09 | 心脏制备 |
| 梅奥剪刀 | Fine Science Tools GmbH，德国海德堡 | 14110-15 | 心脏制备 |
| Dumont SS 镊子 | Fine Science Tools GmbH，德国海德堡 | 11203-25 | 心脏制备 |
| 伦敦产钳 | Fine Science Tools GmbH，德国海德堡 | 11080-02 | 心脏制备 |
| 窄型镊子 | Fine Science Tools GmbH，德国海德堡 | 11003-13 | 心脏制备 |
| 塑料薄膜 | Parafilm M，Bemis NA，美国威斯康星州尼纳赫 | 耗材 | |
| 体视显微镜 | Leica M165FC；Leica Microsystems GmbH，德国韦茨拉尔 | FRET | |
| LED | CoolLED，安多弗，英国 | pE-100 | FRET |
| DualView | Photometrics，图森，亚利桑那州，美国 | DV2-SYS | FRET |
| DualView滤光片组 | Photometrics，图森，亚利桑那州，美国 | 05-EM | FRET |
| optiMOS 科学级 CMOS 相机 | Qimaging，加拿大不列颠哥伦比亚省萨里市 | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | FRET |
| 成像软件 | Micro-Manager；美国加利福尼亚州旧金山加利福尼亚大学 Vale 实验室 | FRET | |
| 分析软件 | Image J 软件；公共领域，NIH，美国 | FRET |
参考文献
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isola....
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