小鼠急性心肌梗死的实时压力-容积分析

摘要

小鼠急性心肌梗死会引发急性但尚未完全明确的左心室（LV）功能变化。在冠状动脉闭塞的小鼠中进行左心室插管，是一种用于实时评估左心室功能的新方法。

摘要

急性心肌梗死可导致急性心力衰竭和心源性休克。血流动力学评估对于任何针对急性左心室（LV）功能障碍的潜在治疗策略的评价至关重要。目前的成像方式（例如，超声心动图和磁共振成像）存在若干局限性，因为无法直接测量左心室压力。在冠状动脉闭塞小鼠模型中进行左心室导管插入术，可作为一种实时评估左心室功能的新方法。

在手术开始时，对小鼠进行麻醉，随后行气管插管。进行左心室插管时，暴露右侧颈动脉 通过 中颈部切口。插入导管并置于左心室腔内。行左侧开胸术，结扎左主冠状动脉（LCA）。为诱导再灌注，在45分钟后松解缝线。全程记录压力-容积数据。

结扎左冠状动脉（LCA）导致左心室（LV）收缩功能下降，表现为每搏输出量、左心室射血分数（EF）和心输出量减少30%。作为左心室收缩力指标的最大dP/dt也显著降低，舒张功能严重受损（最小dP/dt下降40%）。再灌注20分钟后，左心室功能未完全恢复。

实时压力-容积分析是监测小鼠急性心肌梗死期间心脏功能的有效方法。保持稳定的麻醉状态和标准化的手术操作对于确保结果的有效性至关重要。由于急性心肌梗死的早期阶段对发病率和死亡率具有关键影响，所描述的方法可能有助于对新型心肌保护策略进行临床前评估。

引言

心血管疾病是西方文明中最常见的死亡原因¹急性心肌梗死是一种危重事件，与较高的急性和慢性死亡率相关²即使实现了再血管化 通过 急诊经皮冠状动脉介入治疗（PCI）后，急性心肌梗死患者的死亡率仍然较高，尤其是在症状发作后的前48小时内³由左心室（LV）功能急性下降所致的心源性休克是这些患者院内死亡的主要原因³这种左心室功能的早期下降是由缺血及再灌注后心肌损伤引起的。这种所谓的缺血/再灌注（I/R）损伤由细胞代谢组的改变所介导，例如活性氧物质的过度生成。^4,5.

为了在临床前研究中探索可能的保护机制以减少心肌损伤，需要可靠的鼠类模型，包括评估缺血/再灌注（I/R）后左心室（LV）功能的方法⁶。在此背景下，经胸超声心动图⁷和磁共振成像（MRI）⁶被广泛用于功能表型分析^8,9。然而，这些方法不适用于正在发生的急性心肌梗死过程中对严重左心室功能障碍和心源性休克的评估，且无法直接提供左心室压力数据。利用离体心脏进行体外（ex vivo）实验的朗根多夫（Langendorff）装置可提供有关早期缺血/再灌注损伤病理机制的信息¹⁰。但由于该方法无法重现体内（in vivo）的适应性机制，例如自主神经系统调节、激素调节以及酸碱稳态，因而存在局限性。目前尚无可用的方法能够对持续发生的心肌缺血/再灌注损伤期间的心源性休克和左心室功能障碍进行全面的功能表型分析。

结合压力-容积（PV）导管术与短暂外科左主冠状动脉（LCA）阻断的同步化方法可能具有优势，但在技术上具有挑战性。在缺血/再灌注（I/R）损伤期间维持稳定的外部心脏血流动力学对于获得有效结果至关重要，因为不稳定的麻醉或失血可能显著影响实验结果。一种用于I/R损伤血流动力学表型分析的新方法 通过 左心室压力-容积导管插入术与左冠状动脉前降支短暂阻断可为急性心肌梗死所致心源性休克及左心室功能障碍提供新的研究视角，并可作为未来心肌保护研究的分析方法。

方案

所有实验均按照相关法规进行并符合其要求 （《用于实验和其他科学目的的脊椎动物保护欧洲公约》（指令 2010/63/EU）），动物护理遵循机构指南。所有实验均使用6月龄的雄性C57BL/6JRj小鼠进行。

1. 准备

1. 准备手术显微镜、加热垫以及用于监测体温的直肠探针。清洁并灭菌所有手术器械。
2. 准备2根10 cm长的5-0丝线用于血管结扎，1根5 cm长的6-0聚丙烯线，以及一段2 mm硅胶管用于左冠状动脉（LCA）结扎。
3. 将PV导管校准比色皿预热至37 °C，并准备一支装有100 µL含15%氯化钠（NaCl）的H₂O 用于生理盐水校准。
4. 将PV导管（3 cm，1.4 F）置于37 °C预热的0.9% NaCl溶液中₂在测量前至少30分钟给予生理盐水。将导管连接至数据采集装置，并将该装置连接至模拟/数字转换器。将两个设备均连接至计算机。
5. 设置软件。根据软件引导的工作流程，进行软件指导下的压力校准和导纳校准⁸.

2. 麻醉与镇痛

1. 使用氯胺酮（100 mg/kg 体重）和盐酸赛拉嗪（10 mg/kg 体重）通过腹腔注射麻醉小鼠。在缺血/再灌注（I/R）手术开始时，腹腔注射0.05 mg/kg 体重的丁丙诺啡以维持镇痛。
2. 10分钟后，使用20 G静脉（iv）导管进行气管插管，并以40%氧气（O₂） ventilate 小鼠。₂）和 2%（v/v）异氟烷。设定适当的通气参数（例如， 220 µL 搏出量，150 次/分钟，适用于 25–30 g 的 C57BL/6JRj 小鼠。
3. 持续监测体温 通过 直肠探头。将小鼠固定在加热板上，头部朝向操作者。 小鼠正常体温为36.5 - 38 °C。通过调节加热板温度，将体温维持在正常范围1度以内。

3. 左心室导管插入术

1. 消毒胸部和颈部 用聚维酮碘和70%酒精交替擦拭三次。  等待皮肤消毒剂干燥。 使用小型动物剃毛系统去除胸部毛发。 
2. 使用小型手术剪在下唇下方5 mm处向胸骨方向做一条10 mm的纵向正中切口。
3. 分离下颌下腺的左侧和右侧部分 通过 使用镊子进行钝性分离。在右侧气管旁区域分离肌肉和脂肪组织，暴露右侧颈总动脉。用弯头镊子沿血管小心进行钝性分离，将血管从周围结缔组织中游离出来，分离长度为5–10 mm。
   注意：应始终避免对迷走神经或颈动脉体进行机械操作，因为这可能导致严重的低血压和心动过缓。
4. 将两条已准备好的丝线从血管下方穿过。用紧结结扎远端血管，并在近端暴露区域打一个松结，松结应保持足够宽松以允许导管通过。
5. 将颅侧（紧侧）结的线头固定在小鼠头部附近，对血管施加轻微张力，以利于导管插入。在近端血管的松结近心侧放置一把止血血管夹，以可逆地阻断血流。
6. 用显微剪刀在颅侧结扎结近端1 mm处作楔形切口以打开血管。
   注意：出现少量血滴表明此步骤操作正确。
7. 小心插入导管10 mm。开始记录导管数据。
   注意：用镊子拉伸切口可使此过程更容易。
8. 取出血管夹。在切口处加入1至2滴生理盐水，以利于导管移动。继续插入导管约10 mm。当传感器尖端通过近端结扎线后，小心收紧结扎线，力度以足以防止血液沿导管较细部分反流，同时不阻碍导管移动为宜。
   注意：导管尖端传感器的尺寸可防止在取出血管夹时发生血液反流。
9. 轻柔地继续插入导管，直至压力分析显示动脉血压波形，表明导管已放置于主动脉内（图3A).
   注意：导管到达主动脉瓣时，会表现出轻微阻力以及与脉搏同步的导管运动。
10. 当通过主动脉瓣遇到阻力时，将导管回撤5 mm后再次前进，直至左心室插管成功；左心室插管成功的指征是压力-容积（PV）分析发生变化，舒张压达到0–20 mmHg图3B）。注意观察容积监测的变化，以进一步确认传感器尖端位于左心室图3C。将近端结扎得更紧，以防止导管移动。

4. 缺血/再灌注手术

1. 从胸骨下端向左侧腋窝做皮肤切口，总长度为15 mm。随后钝性分离两层肌肉，直至可见肋骨。
2. 打开胸腔 通过 在左侧第三与第四肋骨之间做切口。使用手术钩暴露心包。切除心脏上方的心包组织。在继续进行左冠状动脉前降支（LCA）结扎前，保持30秒不触碰动物，以记录用于有效分析的压力-容积（PV）数据。
3. 定位左心耳下方出现并沿心脏左侧向心尖走行的左冠状动脉。使用6-0聚丙烯缝线，在左心耳下方2 mm处环绕该动脉打一结扎环。将一小段硅胶管置于结扎环下方，然后在其上方打紧结。
   注意：远端心肌变为灰色可作为左冠状动脉结扎成功的阳性对照⁶I/R 手术应由操作研究人员独立完成，且手术时间应在 5 min 内。
4. 将缝线剪至1毫米长度。松开手术钩，手动闭合切口上方的肌层。持续记录PV数据，等待45分钟。
5. 45分钟后，重新打开切口并移除硅胶管以诱导再灌注。继续记录数据20分钟。
   注意：再灌注成功的标志是缺血前观察到的颜色变为红色。

5. 校准

注意：PV 导管系统的校准包括 4 个必要步骤，其中两个步骤必须在测量完成后进行。每次实验后都应重复校准，以确保结果的有效性。

1. 在实验前按照步骤1.5所述进行压力校准和电导校准。
2. 实验结束后，当导管仍置于左心室时进行生理盐水校准。在已备好的区域中定位颈总动脉外侧的右颈静脉。注入10 µL 25% NaCl溶液₂O 通过 使用 Hamilton 注射器记录数据。
3. 使用采集软件，通过在容积曲线上选择上升相来计算校准图5C）。重复此步骤共3次。在注射器抽出后，使用血管夹迅速夹闭穿刺部位，以避免血液流失。
4. 进行体积校准，通过分析标准体积来校准体积数据采集。使用经轻微肝素化的1 mL注射器经心脏穿刺获取约500 µL小鼠血液。例如，每200 IE肝素使用5 µL。回撤门静脉导管10 - 15 mm，以避免损伤导管。
5. 将获取的血液注入已预热至37 °C的校准比色皿中（图5A）。避免产生气泡，以免干扰实验结果。将导管尖端插入每个孔中并记录数据。通过软件引导分析获得标准曲线（图5B重复该过程，共计3次。
6. 在持续维持足够异氟烷麻醉的条件下，通过放血或颈椎脱臼法处死小鼠。

6. 数据分析

1. 完成校准步骤后，按照软件引导进行数据分析。因此，在PV Workflow的分析部分中选中适当区间（至少十个心动周期），并执行基线分析。如有必要，排除因通气或操作干扰导致异常的周期（图3D）。
2. 在主动脉瓣通过前（仅动脉压）、左前降支冠状动脉（LCA）阻塞前即刻及阻塞后即刻进行PV基线分析。随后在缺血期间及再灌注后每5分钟进行一次PV基线分析。实验结束时，在导管从左心室撤出后对压力数据进行分析（动脉压）。
3. 分析至少连续10个心动周期，以避免采样误差。若获得的数据受到通气强烈干扰，可考虑暂时中断通气，最长不超过5秒。
4. 使用基线分析中计算的以下参数（图3D）来评估左心室功能：
   1. 每搏输出量（µL）
   2. 射血分数：每搏输出量 / 舒张末期容积（%）
   3. 心输出量：每搏输出量 × 心率（µL/min）
   4. 心脏指数：心输出量 / 体表面积（µL/(min·cm²)）
   5. 每搏功：压力-容积环的内面积（mmHg·µL）
   6. 最大压力（Pmax）；平均压力（Pmean）
   7. max dP/dt（mmHg/s），用于评估左心室收缩功能
   8. min dP/dt（mmHg/s），用于评估左心室顺应性
   9. 等容舒张时间常数：Tau（ms）

结果

左心室插管后，进行可逆性左冠状动脉前降支结扎45分钟，随后再灌注10分钟。全程记录压力-容积（PV）数据（图1）。

通过获得典型的左心室压力-容积（LV PV）曲线图，确认了压力-容积（PV）导管的正确放置位置（图2A）。左心室导管放置显示出典型的心室压力范围，最低压力为0 - 20 mmHg；而若PV导管误置于主动脉内，则会显示典型的动脉压力曲线，其最低压力为30 - 60 mmHg（舒张压），并在收缩末期出现表示主动脉瓣关闭的小幅波动（图3B和3C）。左冠状动脉（LCA）成功阻塞通过左心室远端心肌变白得以肉眼确认（图2B）。

讨论

急性心肌梗死中左心室血流动力学的PV监测是一种用于实时评估的新方法 体内 评估心源性休克及缺血/再灌注损伤中左心室功能障碍。压力-容积（PV）导管检查可提供关于左心室收缩与舒张功能的广泛参数。除通常通过超声心动图或磁共振成像获得的左心室容积参数（心腔容积、射血分数、每搏输出量和心输出量）外，PV分析还能通过同步提供左心室收缩性能指标（收缩力dP/dt、每搏功）和左心室顺应性指标（-dP/dt、Tau）作为舒张功能参数，从而更全面地评估左心室功能。

由于急性心肌梗死患者发生急性心力衰竭是院内早期发病和死亡的重要预测指标²，在实验条件下监测急性心肌梗死中的急性血流动力学损害和心源性休克，可作为识别潜在保护机制的有价值工具。

多个因素被证明对成功获取数据至关重要。稳定的麻醉对于获得有效的压力-容积（PV）数据尤为关键，因为异氟烷具有显著的心脏抑制作用，可导致血压、左心室射血分数（LV EF）和每搏输出量下降。颈动脉的无创性准备对于避免因失血导致的低血容量至关重要。此外...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
贝塔碘溶液	Mundipharma	4162-1606/89x30mm	聚维酮碘
校准比色皿	Millar Instruments	910-1049	校准比色皿
Contura 专业动物毛发修剪器	Wella	HS-60	小型动物剃毛系统
Eclipse 27G 针头	BD	REF 305770	27G 针头
镊子	FST	11203-25, 11069-08, 11616-15, 11506-12, 11051-10	手术镊
镊子	Aesculap Braun	BN731R, BD 311R	手术镊
Foris FS2434	Eizo	0FTD2033	显示器
Hamilton 100µl 带针注射器	Hamilton	80621	100µl 带针注射器
加热式小型动物手术台	Harvard Apparatus	15001	加热手术台
肝素钠 25000	Ratiopharm	N68542.04	肝素
氯胺酮 10% 100 mg/ml	bela-pharm	FS1670041	氯胺酮
Labchart Pro 8 + Pro 模块	AD Instruments	MLS260/8	压力-容积数据分析软件
LAS EZ	Leica	LAS EZ	显微镜相机软件
Leica IC80 HD	Leica	IC80 HD	显微镜相机
Leica M80	Leica	M80	显微镜
微尖导管换能器	Millar Instruments	SPR-839	压力-容积导管
MiniVent	Harvard Apparatus	845	呼吸机
MPVS Ultra	Millar Instruments	PL3508B48/M	压力-容积导管数据采集装置
Octenisept	Schülke	20000832-A	消毒剂
Plastipak 1ml	PD	REF 303172	1ml 注射器
PowerLab 8/35	AD Instruments	PL3508	模拟/数字转换器
Prolene 6-0	Ethicon	XNEH7814.P31	聚丙烯缝合线
牵开器套装	FST	18200-20	手术部位牵开装置
Seraflex 5-0	Naila	IC108000	丝线缝合线
小型及微型剪刀	FST Essen	14059-11, 15007-08, 14064-11	手术剪
小型硅胶管	Reichelt Chemietechnik		用于左冠状动脉阻塞的导管
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653	氯化钠
testo 108	testo	5631080	直肠温度计
Thinkcentre 台式计算机	Lenovo	PC0EJS2V	计算机
Vasofix Safety 20G	Braun	4269110S-01	插管导管
Windows 10	Microsoft	KW9-00240	操作系统
赛拉嗪 2%	Ceva	6324464.00.00	盐酸赛拉嗪