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一种获取人源变性肌腱细胞的实验方案

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DOI：

10.3791/57634

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2018年6月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, CHA Bundang Medical Center, CHA University School of Medicine, 2Department of Pathology, Kyung Hee University Hospital at Gangdong, Kyung Hee University School of Medicine, 3Department of Physiology, CHA University School of Medicine, 4Department of Rehabilitation, CHA Bundang Medical Center, CHA University School of Medicine

通讯作者： Soonchul Lee <lsceline78@gmail.com>

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

体外 在研究新型疗法对肌腱病疗效时，使用退变的肌腱细胞至关重要。然而，大多数研究仅采用动物模型或健康的肌腱细胞。我们提出以下方案，用于在手术过程中分离人源性退变肌腱细胞。

摘要

肌腱病是一种因肌腱退变而引发的疼痛性疾病，在发达国家由于体力活动增加和预期寿命延长，其发病率正不断上升。尽管该病日益普遍，但其潜在的发病机制仍不明确，治疗通常以缓解症状为主。近年来，人们研究了多种治疗手段，包括生长因子、干细胞和基因治疗，希望增强退变肌腱的修复能力。然而，大多数相关研究仅在动物模型或健康人源腱细胞上进行。尽管已有部分研究使用了病变腱细胞，但据我们所知，目前尚无描述如何获取人源退变腱细胞的标准化操作流程。本研究旨在建立一种获取人源退变腱细胞的标准方案。首先，在手术过程中从一名患有肱骨外上髁炎的患者身上获取肌腱组织，随后从桡侧腕短伸肌腱中取活检样本，该部位对应于手术时观察到的结构改变。所有获取的肌腱组织均表现为 dull、灰白色、脆性增加且伴有水肿，肉眼即可与健康肌腱明显区分。将腱细胞进行体外培养并用于实验。同时，将一半获取的组织进行组织学分析，结果显示其具有肌腱病的关键组织学特征（血管纤维母细胞发育异常或增生）。进一步通过免疫细胞化学分析证实，所培养的细胞为腱细胞，其中大多数细胞对mohawk和tenomodulin蛋白呈阳性染色。随后通过增殖实验或qRT-PCR，将这些细胞与健康对照组进行比较，以确认其退变特性。退变腱细胞表现出更高的增殖速率，以及与既往报道一致的肌腱病相关基因表达模式。总体而言，该新方案可能为未来肌腱病的研究提供一种有用的工具。

引言

肌腱病是一种在身体多个部位发生的慢性退行性肌肉骨骼疾病。近年来，由于休闲体育活动的参与人数增加以及预期寿命延长，发达国家的肌腱病病例数量显著上升1,2。肌腱病的病因被认为是多因素的，包括缺血、氧自由基损伤、血管收缩与血管舒张神经支配失衡、内部微小撕裂以及神经调节的改变3,4,5,6,7,8。目前大多数肌腱病的治疗方法仅能缓解症状。此外，缺乏组织再生的治疗需要较长的康复时间，且对受损肌腱的修复效果有限，这给临床医生带来了挑战9。

由于现有治疗方案效果不佳，且退行性肌腱缺乏自我修复能力，研究人员开始关注探索替代性治疗策略。近期，多项新研究报道了利用生长因子、基于干细胞的疗法以及基因治疗来增强肌腱病肌腱愈合效果的许多有前景的结果10,11,12。

通过文献综述，我们发现相关研究可根据其分析材料分为两类：动物模型（如大鼠、小鼠或兔）和人体模型。在动物模型方面，目前有两种常用的技术用于建立腱病模型：化学诱导损伤或对模型进行机械性超负荷。然而，每种动物模型在模拟复杂的人类腱病病理方面均存在局限性13,14。

大多数使用人源样本的研究通过组织学方法进行分析或执行了 体外 基于健康人肌腱细胞而非退变肌腱细胞的实验15,16,17,18,19,20,21仅有少数论文报道使用了人退变肌腱细胞，但并未详细描述从人体获取退变肌腱细胞所采用的具体方案22,23在此背景下，需要注意的是，动物模型或健康组织/腱细胞的成功结果未必能够预测人体疗效或有效剂量，因为肌腱退变是一个复杂的过程，其发病机制尚未完全阐明。

总体而言，有必要描述一种从人体组织中获取退变肌腱细胞的标准方案，同时避免对供体造成不良影响。本文介绍了一种获取人源退变肌腱细胞的实验方法。为验证该方案的有效性，对所获取的组织进行了组织学分析。随后，通过免疫细胞化学（ICC）、定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）以及细胞活力检测，确认所培养的细胞为退变肌腱细胞。

方案

该方案遵循赫尔辛基宣言进行，并已获得CHA盆塘医疗中心机构审查委员会的批准。

1. 从患者体内获取退变的肌腱组织

  1. 通过采集病史并结合体格检查结果诊断肱骨外上髁炎：肱骨外上髁附近肌腱起始处有压痛；腕关节抗阻伸展时引发疼痛。
  2. 采用以下纳入标准：年龄超过18岁；患有肱骨外上髁炎病史至少六个月；对非手术治疗无效；自注射皮质类固醇、富血小板血浆或肉毒杆菌毒素以来已过去至少三个月。
  3. 排除以下情况：孕妇；有颈椎病、肘关节关节炎、风湿性疾病、肘部周围手术史或神经卡压综合征病史的患者；拒绝捐献组织的患者。
  4. 手术技术
    ​注：参见 图124。
    1. 采用异氟烷全身麻醉并行气管插管后，将上肢置于手术台上，绑扎止血带。随后在整个上肢涂抹聚维酮碘溶液，并用无菌手术巾覆盖。
    2. 在肱骨外上髁稍偏前内侧、关节水平近端处，使用15号外科手术刀片做一3–5 cm的切口，暴露肘部外侧。
    3. 肉眼辨认桡侧腕长伸肌（ECRL）与伸肌腱膜的交界处，并在该交界处使用15号外科手术刀片于ECRL与伸肌腱膜之间做一深约2–3 mm的纵行切开。
    4. 将ECRL向前方牵开，使下方病变的桡侧腕长伸肌短头（ECRB）起点直接暴露于视野中。
    5. 通过其特征性的暗灰色外观以及通常呈现水肿和易碎的组织形态，肉眼识别病变的退变组织。
    6. 确认后，使用15号外科手术刀片和微型刀片仔细锐性切除所有退变组织。
    7. 立即将切除的组织（约1 cm3）浸入磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并尽快将周围非腱性组织彻底去除，仅保留腱组织，置入约10 mL PBS中。
    8. 若肱骨外上髁处存在骨性骨赘，则使用咬骨钳去除骨赘，并用骨锉将其表面磨平。在股骨髁外侧前部钻多个孔（直径1.6 mm，约6–8个孔），以增强血供。此步骤为可选。
    9. 使用不可吸收缝线逐层关闭切口。
  5. 健康对照组腱细胞
    1. 在自体腘绳肌腱或自体髌腱前交叉韧带重建术中获取剩余的健康腱组织，作为后续实验的对照组25。
      注：本研究中每组使用的样本数量为三个。

2. 组织学

  1. 在化学通风橱或同等条件下，将约一半收获的组织保存于中性缓冲10%甲醛溶液中。
  2. 将组织包埋于石蜡块（4–5 mL）中，并以冠状面切成4–5 µm厚的切片。
  3. 使用苏木精-伊红染色法（H&E）和pH 2.5的阿辛蓝染色法对对照组和退变肌腱的切片进行染色。按照以下步骤在自动染色机中进行H&E染色。
    1. 使用二甲苯脱蜡（3次，每次5分钟）。
    2. 从梯度乙醇逐级水化至水（100%乙醇，4分钟；100%乙醇，3分钟；95%乙醇，2分钟；70%乙醇，1分钟；水，2分钟）。
    3. 苏木精染色5分钟，随后用清水充分洗涤2分钟。
    4. 用1%酸性乙醇（含1% HCl的70%乙醇）分化3秒，再用清水充分洗涤3分钟。
    5. 将切片浸入0.5%氨水中10秒以中和HCl，随后用清水洗涤3分钟。
    6. 伊红染色5分钟。
    7. 通过乙醇逐级脱水（80%乙醇，30秒；95%乙醇，1分钟；100%乙醇，1分钟；100%乙醇，2分钟）。
    8. 二甲苯透明（3次，分别为2分钟、2分钟和3分钟）。
    9. 加盖玻片封片。
  4. 使用Bond Polymer Refine Detection试剂盒进行免疫组织化学（IHC）染色，具体操作按照生产商说明书进行，仅作轻微修改。
    1. 使用二甲苯脱蜡后，采用Bond Epitope Retrieval Solution在100 °C下进行抗原修复30分钟。该修复液含有柠檬酸盐缓冲液和表面活性剂（1 L，pH 5.9–6.1）。
    2. 用过氧化氢孵育5分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。
    3. 在室温（21–22 °C）下，用针对血管内皮生长因子（VEGF）（1:200）、腱模蛋白（tenomodulin）（1:200）或mohawk（1:200）的一抗孵育切片15分钟。
    4. 采用非生物素化的聚合物辣根过氧化物酶连接抗体系统进行二抗标记。
      1. 使用含10%（v/v）动物血清的Tris缓冲盐水/0.09% 2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮溶液中的二抗兔抗小鼠IgG，以定位小鼠来源的一抗。
      2. 使用含10%（v/v）动物血清的Tris缓冲盐水/0.09%溶液中的聚合物抗兔Poly-HRP-IgG（<25 µg/mL），以定位兔来源的一抗。
      3. 使用稳定剂溶液中的3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐水合物，通过生成棕褐色沉淀显示抗原-抗体复合物。
      4. 用<0.1%苏木精（蓝色）复染，以显示细胞核。
  5. 在光学显微镜下观察经H&E染色、阿辛蓝染色以及针对VEGF、tenomodulin和mohawk的IHC染色的切片，并在每张切片的一个高倍视野（400X）下获取代表性显微图像。

3. 肌腱细胞培养

  1. 组织准备
    1. 使用显微剪刀和镊子彻底去除肌腱样本周围的所有组织。
    2. 用PBS洗涤，并切成小块（约1 mm3或更小）。
    3. 在37 °C条件下，将组织置于30 mL添加了30 mg/mL II型胶原酶的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中消化1小时。
    4. 用100 µm细胞筛过滤细胞。
    5. 加入1 mL胎牛血清（FBS）以终止II型胶原酶的消化作用。
    6. 以196 × g离心5分钟。
  2. 细胞培养
    1. 将3 × 105个细胞接种至100 mm培养皿中，在含10% FBS和1%抗生素-抗真菌溶液的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2培养箱中培养1周。
    2. 每三天更换一次培养基，直至细胞融合度达到80%。将健康对照组和退变细胞样本均培养至第四代，用于后续实验。

4. 免疫细胞化学（ICC）

  1. 将200 µL培养的细胞（2 × 105 个细胞）转移至八孔载玻片的各孔中，加入新鲜培养基培养1天，使细胞达到汇合状态。
  2. 用PBS洗涤细胞，每孔加入500 µL 4%多聚甲醛固定。
  3. 用含0.5% Triton X-100的PBS孵育载玻片10分钟，以通透细胞膜。
  4. 分别用含1%牛血清白蛋白和0.05% TWEEN-20的PBS对mohawk和tenomodulin进行封闭。
  5. 在避光条件下，加入鼠抗mohawk单克隆抗体（1:100稀释）和山羊抗tenomodulin抗体（1:100稀释），4 °C孵育过夜。
  6. 在避光条件下，室温孵育二抗1小时（tenomodulin使用Alexa 555-抗山羊抗体，1:200稀释；mohawk使用Alexa 488-抗小鼠抗体，1:200稀释）。
  7. 每样本加入0.5 µL荧光封片剂封片。
  8. 使用荧光显微镜（400×）进行观察分析。

5. 增殖实验

  1. 使用水溶性四唑盐（WST-1）检测细胞活力。
    1. 将健康细胞和变性细胞以每孔 2 × 103 个细胞的密度接种至 96 孔板中，分别培养 24、72 和 120 小时。
    2. 孵育结束后，向每孔加入 10 µL 的 10% WST-1 溶液。
    3. 将培养板置于含 5% CO2 的环境中，于 37 °C 孵育 3 小时。
    4. 使用酶标仪在 450 nm 波长下测定吸光度。每个样本在各时间点至少重复读数三次。
  2. 使用 BrdU 检测法测定细胞 DNA 含量。
    1. 将健康细胞和变性细胞以每孔 2 × 103 个细胞的密度接种至 96 孔板中，分别培养 24、72 和 120 小时。
    2. 孵育结束后，向每孔加入 10 µL 的 10% BrdU 溶液。
    3. 将培养板置于含 5% CO2 的环境中，于 37 °C 孵育 3 小时。
    4. 每孔加入 100 µL 固定/变性溶液（60–70% 乙醇，0.1–0.5% 氢氧化钠），室温静置 30 分钟。
    5. 每孔加入 100 µL 配制好的 1× 检测抗体溶液，室温孵育 1 小时。
    6. 吸去溶液，用 1× 洗涤缓冲液洗涤培养板三次。
    7. 每孔加入 100 µL 配制好的 1× HRP 标记的二抗溶液，室温孵育 30 分钟。
    8. 吸去溶液，用 1× 洗涤缓冲液洗涤培养板三次。
    9. 每孔加入 100 µL 的 50% TMB 底物溶液。
    10. 室温孵育 30 分钟。
    11. 每孔加入 100 µL 终止液。
    12. 使用酶标仪在 450 nm 波长下测定吸光度。
      注：每个样本在各时间点至少重复读数三次。

6. 统计分析

  1. 使用 SPSS 收集并分析数据。
  2. 以均值 ± 均值标准误表示数据。
  3. 采用 Mann Whitney U 检验。
  4. 当 p 值小于 0.05 时（p <0.05），认为差异具有统计学显著性。

结果

组织学分析显示，从肱骨外上髁炎获取的组织具有肌腱病肌腱的特征。肌腱病退行性肌腱的H&E切片显示胶原束排列紊乱，失去极性，缺乏细密、笔直且紧密排列的平行纤维结构。样本中常见提示退变的组织学征象，如细胞密度增高、细胞核增大且无典型梭形形态。此外，退变肌腱的胶原束经H&E染色后呈较弱的嗜酸性，但经阿利新蓝染色呈阳性，表明蛋白聚糖和糖胺聚糖物质增加。

在所有情况下，与正常的裂隙状血管相比，血管数量增加，并出现占据纤维间嵌入区域的血管聚集。免疫组化染色显示，变性肌腱中的细胞对 VEGF 呈细胞质颗粒状阳性反应，而对照组细胞则呈阴性反应。综上所述，这些结果证实，从肱骨外上髁炎获取的组织为变性组织，适用于变性肌腱细胞的培养（参见 图2).

通过免疫细胞化学（ICC）确认培养的细胞为腱细胞，通过免疫组织化学（IHC）确认收获的组织为腱组织。大多数培养的细胞以及腱组织中的细胞在显微镜下呈细长形态，并对已知的代表性腱细胞标志物——mohawk（绿色）蛋白和tenomodulin（红色）蛋白呈阳性染色（见图3）。此外，收获的组织在免疫组织化学染色中也显示mohawk蛋白和tenomodulin蛋白呈阳性（见补充图1）。上述结果表明，所收获的组织由腱组织构成。

从肱骨外上髁炎组织标本中培养的腱细胞表现出与腱病相应的特征性表现。将退变性与健康腱细胞在相同条件下培养4天，于各时间点采用BrdU法和WST-1法检测细胞增殖率。结果显示，与对照组相比，退变细胞的增殖率显著升高，与既往报道一致（p <0.05）（见图4A）。

通过qRT-PCR分析了在退行性肌腱中已知上调的五个基因。这些基因的表达水平 COL3A1、ACTA2、TAC1（SP）、TAC受体1 和 PTGS2（COX2） 退行性肌腱来源的培养细胞中基因表达的升高程度显著高于健康肌腱来源的细胞。所有基因的相对表达水平如图所示。 图4B 和 补充图2.

肌腱修复手术、退行性肌腱对比、标记的手术图像及切除组织。
图1： 退行性肌腱取材的手术照片。（A）皮肤切开并分离后，暴露位于共同伸肌起点处的病理性退行性组织，呈现特征性的暗灰褐色伴水肿改变（红线标示）。相比之下，正常肌腱组织外观光滑、致密，呈轻微灰白色（黑线标示）。（B）将所有确认的退行性组织锐性切除，随后暴露桡骨头骨面。（C）所有切除的组织立即置于磷酸盐缓冲液中，并尽快仔细剥离周围非肌腱组织。ECRB：桡侧腕短伸肌。EDC：指总伸肌。ECU：尺侧腕伸肌。 请点击此处查看该图的放大版本。

健康组织与退变组织的组织学比较；H&E、阿尔新蓝、VEGF染色结果。
图2：肌腱退变的组织学确认。（A） 在H&E染色中，来自肱骨外上髁炎的退变样本相较于健康对照组显示出胶原纤维束排列紊乱、极性丧失以及细胞数量增加。（B）阿尔新蓝染色显示，退变肌腱中蛋白聚糖和糖胺聚糖组成的基质增多，纤维之间可见多个黏液样斑块和空泡（箭头所示）。（C）此外，VEGF免疫组织化学染色表明，与对照样本相比，退变肌腱样本中血管形成区域的染色增强。VEGF：血管内皮生长因子。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。

荧光显微镜：染色的健康与退变细胞；腱调节蛋白、Mohawk蛋白表达。
图3：通过免疫细胞化学鉴定腱细胞。 体外培养的细胞及肌腱组织中的细胞通过免疫细胞化学（ICC）被确认为腱细胞。大多数细胞对典型的腱细胞标志物呈阳性染色，包括Mohawk（绿色）和腱调节蛋白（tenomodulin，红色），在显微镜下呈现细长形态。软骨细胞作为阴性对照。ICC：免疫细胞化学。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

细胞增殖与基因表达分析，WST-1、BrdU 检测；柱状图显示结果。
图 4：退变性腱细胞的特征。（A, B）退变性腱细胞（红色）增殖速率更高，细胞密度显著增加。（C）在退变性腱细胞中，五个已知与腱病发展相关的基因表达水平显著升高。基因表达水平以 GAPDH 为内参进行标准化。*：均值 <0.05，**：均值 <0.01。SP：P 物质。 请点击此处查看该图的放大版本。

肌腱健康组织与退化组织的组织学比较，tenomodulin 和 mohawk 染色示意图。
补充图1：采集组织为肌腱组织的组织学验证。采集的组织还通过免疫组织化学（IHC）对 mohawk 和 tenomodulin 进行分析，以确定其是否具备肌腱组织的典型特征。IHC：免疫组织化学。比例尺 = 50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

基因表达柱状图；比较 COL3A1、ACTA2、TAC1、TAC 受体 1、PTGS2；健康组与肌腱病组。
补充图2：肌腱细胞中与肌腱病相关基因的表达。 五个基因的转录本经肌动蛋白（actin）表达标准化后，在退变的肌腱细胞中显著升高，趋势与图4相似。基因表达水平以actin为内参进行标准化，*P < 0.05，**P < 0.01。SP：P物质（substance P）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

既往多项研究报道了使用不同方法（如胶原酶或软骨诱导素注射、跑步机跑动等）建立慢性肌腱病动物模型的方法26,27。尽管大量基于这些动物模型的研究显示出有前景的治疗效果，但在肌腱病研究领域中，使用人类退变型腱细胞进行实验对于重现治疗效果至关重要。本文中，我们建立了一种可稳定获取并培养人类退变型腱细胞的实验方案。所获取的腱组织及培养的腱细胞均表现出退变型腱组织和腱细胞的典型特征7,28。

根据我们的经验，为了成功获取组织，必须充分理解退行性肌腱常伴随的形态学变化，并在手术过程中准确定义该区域。退行性组织通常呈灰色或棕色，组织较薄、脆弱、结构紊乱且质地疏松。在取材前，应严格遵守本方案的纳入与排除标准，并仔细评估患者既往的治疗情况。

组织大小对于成功的细胞培养也非常重要。我们建议采集超过1 cm3的组织。通常情况下，只要切除了全部退变区域，所获取的组织量即足以用于细胞培养。最后，所有实验中均未使用传代超过第六代的肌腱细胞。我们认为，在第六代之前，培养的细胞仍保留退变特征。

本方案具有多项优势：由于退变组织在手术中本应被切除，因此不会对患者造成伤害；所需组织量足以满足实验需求，具有高效性；不涉及健康组织的损伤，符合高度伦理要求；病理组织可在手术中 readily 获取，具有良好的可重复性；最后，一旦熟练掌握手术技术，操作将非常简便。

然而，我们承认本实验存在若干局限性。首先，尽管我们仅纳入了此前接受任何治疗后已超过三个月的患者，但仍无法完全排除既往皮质类固醇或富血小板血浆注射的残留效应。此外，在本方案中，我们仅采集了桡侧腕短伸肌（ECRB）肌腱并用于培养退行性肌腱细胞，因为ECRB肌腱与跟腱和肩袖肌腱一样，是手术治疗肌腱病的常见部位。未来还需开展样本量更大的研究，进一步关注不同肌腱病部位之间的可能差异。

总之，这一经过验证的获取人类退变肌腱细胞的方案，将为肌腱生物学的未来研究以及新型治疗干预措施的测试提供有用的工具。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由韩国卫生科技研发计划资助&D项目，由韩国保健产业振兴院（KHIDI）资助，资金来源于保健福祉部 & 福利部，大韩民国（项目编号：HI16C1559）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
手术刀KisanbioKS-Q0306-1515号
微型刀片Beaver374769
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Gibco11995065
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco14190250
胎牛血清（FBS）Gibco16000044
50 mM 抗坏血酸-2-磷酸Sigma-AldrichA5960
抗生素-抗真菌素溶液Gibco15240062
4% 甲醛Bio-solutionBP031
曲拉通 X-100 Sigma-AldrichX100-100ml
牛血清白蛋白（BSA）RdtechC0082
吐温 20Sigma-AldrichP9416-100ml
MKX (C-5)Santa cruz biotechnologysc-515878
腱调节蛋白（Tenomodulin, N-14）Santa cruz biotechnologysc-49325
荧光封片剂DAKOS3023
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）Thermo Fisher ScientificD1306
WST-1Dojindo Molecular TechnologiesCK04
BrdU细胞增殖检测试剂盒Cell Signaling Technology#6813
TRIzol试剂Invitrogen15596018
iScript cDNA合成试剂盒 Bio-Rad170-8891
TaqMan基因表达主混合液Applied Biosystems4369016
GAPDHThermo Fisher ScientificHs02786624_g1
COL3A1Thermo Fisher ScientificHs00943809_m1
ACTA2Thermo Fisher ScientificHs00426835_g1
TAC1Thermo Fisher ScientificHs00243225_m1
TACR1Thermo Fisher ScientificHs00185530_m1
PTGS2Thermo Fisher ScientificHs00153133_m1
ACTBThermo Fisher ScientificHs99999903_m1
细胞筛（100 µm） Corning352360
100 mm 培养皿Thermo Fisher Scientific8188207
8孔腔室载玻片Thermo Fisher Scientific154534
96孔透明平底聚苯乙烯TC处理微孔板Corning3596
尼康Eclipse 50i显微镜 尼康
VERSA max微孔板读数仪 Molecular Devices
CFX96实时荧光定量PCR检测系统Bio-Rad
中性缓冲福尔马林溶液，10%Sigma-AldrichHT501128
石蜡Leica Biosystems3801340
乙醇JUNSEI CHEMICAL90303-2185
苏木精DAKOCS70030-2
伊红DAKOCS70130-2
阿利新蓝DAKOAR16011-2
柠檬酸Sigma-Aldrich251275
二甲苯JUNSEI CHEMICAL25165-0430
内源性过氧化物酶阻断剂 DAKOS200380-2
加拿大树胶JUNSEI CHEMICAL23255-1210
切片机刀片FEATHERA35
载玻片SUPERIOR1000612
盖玻片Marienfeld-Superior101050
VEGFSanta cruz biotechnologysc-7269
SPSS软件IBMVer. 18.0
多功能离心机LABOGENE1248R

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