体外 在研究新型疗法对肌腱病疗效时，使用退变的肌腱细胞至关重要。然而，大多数研究仅采用动物模型或健康的肌腱细胞。我们提出以下方案，用于在手术过程中分离人源性退变肌腱细胞。
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摘要
摘要
肌腱病是一种因肌腱退变而引发的疼痛性疾病，在发达国家由于体力活动增加和预期寿命延长，其发病率正不断上升。尽管该病日益普遍，但其潜在的发病机制仍不明确，治疗通常以缓解症状为主。近年来，人们研究了多种治疗手段，包括生长因子、干细胞和基因治疗，希望增强退变肌腱的修复能力。然而，大多数相关研究仅在动物模型或健康人源腱细胞上进行。尽管已有部分研究使用了病变腱细胞，但据我们所知，目前尚无描述如何获取人源退变腱细胞的标准化操作流程。本研究旨在建立一种获取人源退变腱细胞的标准方案。首先，在手术过程中从一名患有肱骨外上髁炎的患者身上获取肌腱组织，随后从桡侧腕短伸肌腱中取活检样本，该部位对应于手术时观察到的结构改变。所有获取的肌腱组织均表现为 dull、灰白色、脆性增加且伴有水肿，肉眼即可与健康肌腱明显区分。将腱细胞进行体外培养并用于实验。同时，将一半获取的组织进行组织学分析，结果显示其具有肌腱病的关键组织学特征（血管纤维母细胞发育异常或增生）。进一步通过免疫细胞化学分析证实，所培养的细胞为腱细胞，其中大多数细胞对mohawk和tenomodulin蛋白呈阳性染色。随后通过增殖实验或qRT-PCR，将这些细胞与健康对照组进行比较，以确认其退变特性。退变腱细胞表现出更高的增殖速率，以及与既往报道一致的肌腱病相关基因表达模式。总体而言，该新方案可能为未来肌腱病的研究提供一种有用的工具。
引言
肌腱病是一种在身体多个部位发生的慢性退行性肌肉骨骼疾病。近年来，由于休闲体育活动的参与人数增加以及预期寿命延长，发达国家的肌腱病病例数量显著上升1,2。肌腱病的病因被认为是多因素的，包括缺血、氧自由基损伤、血管收缩与血管舒张神经支配失衡、内部微小撕裂以及神经调节的改变3,4,5,6,7,8。目前大多数肌腱病的治疗方法仅能缓解症状。此外，缺乏组织再生的治疗需要较长的康复时间，且对受损肌腱的修复效果有限，这给临床医生带来了挑战9。
由于现有治疗方案效果不佳，且退行性肌腱缺乏自我修复能力，研究人员开始关注探索替代性治疗策略。近期，多项新研究报道了利用生长因子、基于干细胞的疗法以及基因治疗来增强肌腱病肌腱愈合效果的许多有前景的结果10,
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方案
该方案遵循赫尔辛基宣言进行，并已获得CHA盆塘医疗中心机构审查委员会的批准。
1. 从患者体内获取退变的肌腱组织
- 通过采集病史并结合体格检查结果诊断肱骨外上髁炎：肱骨外上髁附近肌腱起始处有压痛；腕关节抗阻伸展时引发疼痛。
- 采用以下纳入标准：年龄超过18岁；患有肱骨外上髁炎病史至少六个月；对非手术治疗无效；自注射皮质类固醇、富血小板血浆或肉毒杆菌毒素以来已过去至少三个月。
- 排除以下情况：孕妇；有颈椎病、肘关节关节炎、风湿性疾病、肘部周围手术史或神经卡压综合征病史的患者；拒绝捐献组织的患者。
- 手术技术
注：参见 图124。- 采用异氟烷全身麻醉并行气管插管后，将上肢置于手术台上，绑扎止血带。随后在整个上肢涂抹聚维酮碘溶液，并用无菌手术巾覆盖。
- 在肱骨外上髁稍偏前内侧、关节水平近端处，使用15号外科手术刀片做一3–5 cm的切口，暴露肘部外侧。
- 肉眼辨认桡侧腕长伸肌（ECRL）与伸肌腱膜的交界处，并在该交界处使用15号外科手术刀片于ECRL与伸肌腱膜之间做一深约2–3 mm的纵行切开。
- 将ECRL向前方牵开，使下方病变的桡侧腕长伸肌短头（ECRB....
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结果
组织学分析显示，从肱骨外上髁炎获取的组织具有肌腱病肌腱的特征。肌腱病退行性肌腱的H&E切片显示胶原束排列紊乱，失去极性，缺乏细密、笔直且紧密排列的平行纤维结构。样本中常见提示退变的组织学征象，如细胞密度增高、细胞核增大且无典型梭形形态。此外，退变肌腱的胶原束经H&E染色后呈较弱的嗜酸性，但经阿利新蓝染色呈阳性，表明蛋白聚糖和糖胺聚糖物质增加。
在所有情况下，与正常的裂隙状血管相比，血管数量增加，并出现占据纤维间嵌入区域的血管聚集。免疫组化染色显示，变性肌腱中的细胞对 VEGF 呈细胞质颗粒状阳性反应，而对照组细胞则呈阴性反应。综上所述，这些结果证实，从肱骨外上髁炎获取的组织为变性组织，适用于变性肌腱细胞的培养（参见 图2).
通过免疫细胞化学（ICC）确认培.......
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讨论
既往多项研究报道了使用不同方法（如胶原酶或软骨诱导素注射、跑步机跑动等）建立慢性肌腱病动物模型的方法26,27。尽管大量基于这些动物模型的研究显示出有前景的治疗效果，但在肌腱病研究领域中，使用人类退变型腱细胞进行实验对于重现治疗效果至关重要。本文中，我们建立了一种可稳定获取并培养人类退变型腱细胞的实验方案。所获取的腱组织及培养的腱细胞均表现出退变型腱组织和腱细胞的典型特征7,28。
根据我们的经验，为了成功获取组织，必须充分理解退行性肌腱常伴随的形态学变化，并在手术过程中准确定义该区域。退行性组织通常呈灰色或棕色，组织较薄、脆弱、结构紊乱且质地疏松。在取材前，应严格遵守本方案的纳入与排除标准，并仔细评估患者既往的治疗情况。
组织大小对于成功的细胞培养也非常重要。我们建议采集超过1 cm.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由韩国卫生科技研发计划资助&D项目，由韩国保健产业振兴院（KHIDI）资助，资金来源于保健福祉部 & 福利部，大韩民国（项目编号：HI16C1559）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 手术刀 | Kisanbio | KS-Q0306-15 | 15号 |
| 微型刀片 | Beaver | 374769 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Gibco | 11995065 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | 14190250 | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 16000044 | |
| 50 mM 抗坏血酸-2-磷酸 | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| 抗生素-抗真菌素溶液 | Gibco | 15240062 | |
| 4% 甲醛 | Bio-solution | BP031 | |
| 曲拉通 X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Rdtech | C0082 | |
| 吐温 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
| 腱调节蛋白（Tenomodulin, N-14） | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
| 荧光封片剂 | DAKO | S3023 | |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐） | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| BrdU细胞增殖检测试剂盒 | Cell Signaling Technology | #6813 | |
| TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 | |
| iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | 170-8891 | |
| TaqMan基因表达主混合液 | Applied Biosystems | 4369016 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
| COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
| ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
| TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
| TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
| PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
| ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
| 细胞筛（100 µm） | Corning | 352360 | |
| 100 mm 培养皿 | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
| 8孔腔室载玻片 | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
| 96孔透明平底聚苯乙烯TC处理微孔板 | Corning | 3596 | |
| 尼康Eclipse 50i显微镜 | 尼康 | ||
| VERSA max微孔板读数仪 | Molecular Devices | ||
| CFX96实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | ||
| 中性缓冲福尔马林溶液，10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 石蜡 | Leica Biosystems | 3801340 | |
| 乙醇 | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
| 苏木精 | DAKO | CS70030-2 | |
| 伊红 | DAKO | CS70130-2 | |
| 阿利新蓝 | DAKO | AR16011-2 | |
| 柠檬酸 | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 二甲苯 | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
| 内源性过氧化物酶阻断剂 | DAKO | S200380-2 | |
| 加拿大树胶 | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
| 切片机刀片 | FEATHER | A35 | |
| 载玻片 | SUPERIOR | 1000612 | |
| 盖玻片 | Marienfeld-Superior | 101050 | |
| VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
| SPSS软件 | IBM | Ver. 18.0 | |
| 多功能离心机 | LABOGENE | 1248R |
参考文献
- Ackermann, P. W., Renstrom, P. Tendinopathy in sport. Sports Health. 4 (3), 193-201 (2012).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clinical Sports Medicine. 22 (4), 675-692 (2003).
- Lui, P. P., Chan, L. S., Fu, S. C., Chan, K. M.
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重印与许可
