高效生成粘附培养中 Hpsc 的胰腺-二叶多布蛋白 1⁺后后福格内胰腺祖细胞

胰腺主要由外分泌细胞和内分泌细胞组成, 其功能障碍或超载导致胰腺炎、糖尿病和胰腺癌等多种疾病。为了阐明胰腺病的病因, 有必要对胰腺细胞的发育过程和功能进行分析。此外, 建立细胞组织补充治疗需要稳定的细胞供应和强大的质量。人类多能干细胞 (hpsc) 衍生的胰腺细胞是一个很有前途的细胞来源, 这是一个很有前途的细胞源, 和分化协议的胰腺细胞已深入研究^{1,2, 3, 4}. 我的工作是什么？胰腺β细胞体外生成的新进展模仿了成人人β细胞的生成, 这些细胞在糖尿病模型小鼠^2,3植入时显示出治疗效果。此外, 对健康和1型糖尿病患者捐献者诱导多能干细胞 (Ipsc) 产生的β细胞的分析显示, 包括在压力下 5, 没有功能差异^.此外, 在与 6^,7 患者相同的地点, 患者衍生的 ipsc 或 hpsc 存在基因突变, 导致胰腺细胞的疾病表型部分被复制。

为了从 Hpsc 中产生胰腺细胞, 采用了分步定向分化, 重述了发育过程。胰腺来源于早期胚胎的内皮层, 表达了性别决定性区域 y-盒 17 (SOX17) 和叉头盒 A2 (FOXA2)⁸。在小鼠研究的基础上, 内皮层形成原始的肠道管, 其特征是肝细胞核因子 1-beta (Hnf1β) 和肝细胞核因子 4-alpha (hnf4α) 的表达。原始的肠道管伸长并发展成呼吸系统、消化道和器官。伸长后, 后前部区成为推定胰腺区, 其特征是转录因子胰腺/十二指肠蛋白 1 (pdx1)^8,9,10的表达。pdx1⁺肠道管的背侧和腹侧部分变厚形成胰芽, 其特征是胰腺转录因子1亚基α (ptf1a) 和 nk6 同源 box 1 (nkx6.1)^8,11的共表达。这一表达标志着胰腺器官发生的形态开始。胰腺内真皮细胞是胰芽的组成部分, 形成一个分支管状的上皮结构^{网络 12,}并最终分化为外分泌和内分泌细胞, 包括胰岛素分泌β细胞和葡萄糖分泌的α细胞。pdx1 的表达首先在推定胰腺区检测, 然后在整个胰腺发育过程中观察到, 并显示出β-和细胞^{9、13、14 的}定位。虽然 Pdx1 + 细胞区不表达 Ptf1a^或Nkx6.1 分化为胃狭窄, 十二指肠, 肝外胆管和一些肠道细胞在发育的中后期阶段在小鼠 9, pdx1⁺ 细胞在人类早期发育阶段被认为是胰腺的祖细胞。

在这里, 我们提出了一个详细的协议, 以区分 Hpsc 到 PDX1⁺细胞的胰腺谱系的生成。该方案通过播种离解的单细胞^15、16、17来引发分化。一般情况下, 未分化的 Hpsc 在悬浮液或粘附中保持为菌落或细胞集体。因此, 大多数协议在传代后不久就开始分化。然而, 在菌落或聚集体的状态下, 细胞容易出现空间和转录异质性^{18、19、20、21、22, 这}可能会阻碍向最终内皮的第一步分化, 然后是低效率的分化到 PDX1⁺细胞。本协议可以提供易于操作, 以提高和稳定一些 hPSC 线的分化效率, 这些线路以前被发现对内皮谱系和 PDX1⁺细胞23的分化效率^{很低,24,25岁}

京都大学医学系和医学研究生院伦理委员会批准了使用 Hpsc 的实验。

1. 材料的制备

请注意:准备所有培养基和试剂, 以便在无菌环境中进行细胞培养。使用前将基础培养基加热至室温 (RT)。在 RT 使用培养基, 在6小时内使用. 试剂的详情列于物料表。

1. 区别 (图 1 a)
   1. 阶段1A 介质: 使用移液器将 RPMI 1640 介质转移到试管中。加入无血清补充剂, 活性 a、CHIR99021 和 Y-27632, 浓度分别为1x、100 ngml、3μm 和10μm。
   2. 阶段1B 介质: 使用移液器将 RPMI 1640 介质转移到试管中。加入无血清补充剂, 活性 a 和 CHIR99021, 浓度分别为1x、100 ngml、≤1μm。
      注: CHR99021 的浓度应低于第1 a 期介质, 并且不需要添加, 但它会增加电池数量。
   3. 第2阶段介质: 使用移液器将改进的 MEM (iMEM) 介质转移到试管中。加入无血清补充剂和角质形成细胞生长因子 (KGF), 浓度分别为 0.5 x 和 50 ngml。
   4. 第3阶段介质: 使用移液器将 iMEM 介质转移到试管中。加入无血清补充剂、KGF、NOGGIN、3-酮-n-氨基-n-氨基外给前列腺二氢肉桂酰环磷胺 (cyc) 和 4-e-2-(5, 6, 7, 8-四氢-5, 5, 8, 8-四甲基-2-萘基)-1-丙基]-苯甲酸 (ttnpb)浓度分别为 0.5 x、50 ngml、100 ngml、0.5μm 和10nm。
2. 流式细胞术 (FCM)
   1. 1 x 渗透/清洗缓冲液: 通过移液器将水输送到管子中。将移液器的渗透/洗涤缓冲液加入1x 的浓度。
   2. FCM 阻隔溶液: 通过移液器将1x 的每一次渗透/清洗缓冲液输送到试管中。将驴血清通过移液器加入到2% 的浓度 (vol/vol) 中。
3. 免疫染色
   1. 阻塞溶液: 将 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 通过移液器输送到试管中。将驴血清和 Triton X 通过移液器加入, 浓度分别为 5% (vol/vol) 和 0.4% (vol/vol)。

2. hPSC 分化为后后后细胞胰腺祖细胞 (PDX1⁺细胞)

请注意:使用无菌技术执行所有程序。根据制造商的说明^17、26, hpsc 在6孔板上进行维护, 该板材由带有 hpsc 维护介质的合成表面材料包覆。当细胞达到50-80 融合 (第0阶段) 时, 使用它们进行分化。

1. 准备基底膜基质涂层板。
   1. 将 RPMI 1640 ( 4°c) 的6毫升转移到冰上冷却至4°c的管中。加入2毫克的基底膜基质 ( 4°c) 与冷却 1 ml-移液器的尖端, 并通过温和的移液混合, 使 0.33 mL-pipette 基底膜基质。
   2. 用移液器将稀释后的基底膜基质2毫升转移到6井细胞培养板的每口井上。将板材置于37°c下, 在孵化器中放置60-90分钟。之后, 将板材保持在 RT, 直到使用 (3小时内)。
2. 将 Hpsc 播种, 并开始分化到最终的内皮 (1A 阶段)。
   1. 通过移液器将使用的培养基中的2毫升加入 0.5 mm 乙二胺四乙酸 (EDTA) (RT), 清洗在6孔板中培养的 Hpsc。
   2. 通过移液器吸收 0.5 mM edta, 每口每口添加2毫升 0.5 mM EDTA。在37°c下将板材取出5分钟。
   3. 在 RT 中加入1毫升的 hPSC 维护介质, 每口液中加入 10μm y-27632。移液器轻轻但迅速地吹掉板上附着的细胞, 并将聚集的细胞分解成单个细胞。在移液过程中不要将细胞悬浮液泡泡。
   4. 将细胞悬浮液转移到一个50毫升的离心管中, 其中含有4毫升的 hPSC 维护介质, 并辅以 10μm Y-27632。轻轻移液细胞悬浮液。
   5. 使用 Trypan 蓝色染色排除过程对细胞悬浮液中的细胞号进行计数。
      1. 在管内混合15Μl 的细胞悬浮液和15μl 的色氨酸蓝。
      2. 将用 Trypan Blue 稀释的细胞悬浮液10Μl 转移到细胞上, 用10μl 移液器将一式重复的滑块。
      3. 用自动单元格计数器计算单元格数, 并计算细胞悬浮液中的单元格密度。可行性通常是 & gt;98%。
   6. 在50毫升的离心管中倾斜细胞悬浮液, 每口6井板 (1-1. 1.5 x 10 细胞/^{厘米 2} ), 每管 1-1.5 x 10 6 细胞.
   7. 在 RT 以 200 x g的速度离心 50 Ml 管5分钟。
   8. 使用移液器吸吸上清液, 每口用1a 期介质 (RT) 1 毫升重新悬浮细胞。轻轻移液细胞悬浮液, 再加入1毫升的1A 级培养基 (共2毫升, 每口)。
   9. 在 1, 000μl 移液器2.1.2 制备的细胞培养板的井中吸收稀释的基底膜基质。立即继续执行下一步。
   10. 轻轻移液细胞悬浮步再次2.2.8。混合后, 立即将细胞悬浮液 (2 毫升) 转移到6井板的每一口井中。用铝箔覆盖板材, 以保护板材不受光线的影响。将板材放在 RT 干净的长凳上10-15。
       请注意:播种后不要移动盘子。
   11. 轻轻将板材放入37°c、5% co₂孵化器 (加湿气氛), 培养24小时。
       请注意:播种后不要摇晃盘子。
3. 诱导分化为最终的内皮 (期 1B)。
   1. 采用移液器在井中加入2毫升的 DPBS。重复一次 DPBS 的愿望和添加。
      请注意:要从单层中取出任何死细胞, 请在每次抽吸前轻轻摇晃板。
   2. 用移液器吸收使用过的 DPBS, 每口添加4毫升的1B 级介质 ( 37°c)。轻轻将板材放入37°c孵化器 (5% co₂的加湿气氛), 培养48小时。
   3. 采用移液器在井中加入2毫升的 DPBS。重复一次 DPBS 的愿望和添加。
      请注意:在每次抽吸前, 通过轻轻的晃动将死细胞从单层中取出。
   4. 用移液器吸收使用过的 DPBS, 每口在1B 期介质 ( 37°c) 中加入4毫升。轻轻将板材放入孵化器 ( 37°c, 加湿气氛为5% 二氧化碳₎, 培养24小时。
4. 诱导分化为原始的肠道管 (第2阶段)。
   1. 采用移液器在井中加入2毫升的 DPBS。
      注: 每次抽吸前, 通过轻轻的晃动将死细胞从单层中取出。
   2. 用移液器吸收使用过的 DPBS, 每口添加4毫升的第2阶段介质 ( 37°c)。将板材放入孵化器 ( 37°c, 加湿气氛为5% 二氧化碳₎并培养4天。
5. 诱导分化为 PDX1⁺细胞 (第3阶段)。
   1. 采用移液器在井中加入2毫升的 DPBS。重复一次 DPBS 的愿望和添加。
   2. 用移液器吸收使用过的 DPBS, 每口在3期介质 ( 37°c) 中加入4毫升。将板材放入孵化器 ( 37°c, 加湿气氛为5% 二氧化碳₎并培养3天。
6. 诱导分化为胰腺内分泌细胞。
   1. 执行 nkx6.1⁺细胞诱导 (第4阶段, 8天), 然后进行内分泌细胞诱导 (第5阶段, 12天), 其先前描述的协议^{为 3、16、26}。通过免疫染色和定量实时逆转录聚合酶链反应 (qRT-PCR) 分析, 表征和验证内分泌细胞分化。
      请注意:有关详细的实验程序, 请参阅丰田章男等16人和木村等^人26 人。关于用于 qRT-PCR 分析的引物序列, 请参见表 1 。

3. 流式细胞仪 (FCM)

1. 采用移液器将使用过的培养基加入2毫升 0.5 mM EDTA。重复一次 0.5 mM EDTA 的抽吸和添加。
   请注意:轻轻摇晃板, 在每次抽吸前从单层细胞中取出任何死细胞。
2. 要分离细胞 (每口井约 3-6x10^6个细胞), 加入 2 ml 0.25% 的胰蛋白酶, 每口井含有 0.5 MM EDTA。在37°c下将板材孵化5-10。
3. 移液器温和但迅速地分离成单个细胞的细胞。在移液过程中不要将细胞悬浮液泡泡。
4. 加入 8-10 mL 的碱基培养基 (RPMI 1640 或 iMEM, RT), 含有0.5倍无血清补充剂, 每口井 10Μm y-27632, 混合细胞悬浮液。将细胞悬浮液转移到离心管中。
5. 在 RT 以 300 x克的速度离心管5分钟。
6. 用 0.5 mM EDTA (RT) 的2毫升吸吸上清液并重新悬浮细胞。轻轻移液细胞悬浮液。
7. 在 RT 以 300 x克的速度离心管5分钟。
8. 在引擎盖下, 用100μl 的固定和渗透缓冲液吸住上清液并重新悬浮细胞 。轻轻将细胞悬浮液置于引擎盖下。将管材保持在 RT 30分钟。
9. 在 RT 以 400 x g的速度离心管5分钟。
10. 将上清液吸进引擎盖下, 每 10 6个细胞用 500μl FCM 阻隔溶液重新悬浮细胞.轻轻移液细胞悬浮液。将管材保持在 RT 30分钟。
11. 将细胞悬浮液的50Μl 转移到试管中 (约 1 x^{10 5 细胞})。在 RT 以 400 x g的速度离心管 5分钟, 取出上清液, 在 fcm 阻滞溶液中用100Μl 稀释的原代抗体 (见材料表) 重新悬浮细胞, 并在4°c孵育 & gt;16 h。
12. 在 RT 以 400 x克的速度离心管 5分钟, 取出上清液, 用180μl 的 1x Perm/Wash 清洗缓冲液重新悬浮电池。
13. 在 RT 以 400 x克的速度离心管 5分钟, 取出上清液, 用100μl 稀释的二级二级抗体 (见材料表) 在 fcm 阻断溶液中重新悬浮细胞。在 RT 中将细胞培养 60分钟, 或在4°c时, 防止光线照射。
14. 在 RT 以 400 x克的速度离心管 5分钟, 取出上清液, 用180μl 的 1x Perm/Wash 清洗缓冲液重新悬浮电池。
15. 在 RT 以 400 x克的速度离心管 5分钟, 取出上清液, 并在 DPBS 中用 180μl 2% 的驴血清重新悬浮细胞。
16. 过滤细胞悬浮液通过转移5毫升圆底部聚苯乙烯管与电池过滤器 (35μm 尼龙网), 并保持在4°c, 防止光线, 直到分析。
17. 用流式细胞仪^分析一定比例的阳性染色细胞。

4. 免疫染色

1. 采用移液器在井中加入2毫升的 DPBS。重复一次 DPBS 的愿望和添加。
   请注意:在每次抽吸之前, 轻轻摇晃盘子, 从单层细胞中取出任何死细胞。
2. 在引擎盖下用移液器每口井加入2毫升4% 的甲醛 (PFA) ( 4°c)。将板材保持在4°c 下20分钟。
3. 用移液器将 PFA 移除在引擎盖下。在 rt 用移液器在引擎盖下将 DPBS 添加2毫升。重复一次 DPBS 的愿望和添加。
4. 每口井加入2毫升的堵液, 并将板材保持在 RT 30分钟。
5. 吸收使用的溶液, 并在每口阻断溶液中加入1毫升的原代抗体 (见材料表)。在 RT 上或在4°c下 gt;16。
6. 吸收使用的溶液, 加入含有 0.4% Triton X-100 的2毫升 DPBS, 在 RT 孵育 10分钟, 重复吸入, 加入溶液和孵育一次。
7. 吸收使用的溶液, 并在每口阻断溶液中添加1毫升的二级抗体 (见材料表)。在 RT 中培养 60分钟, 并有防光保护。
8. 吸收使用的溶液, 添加2毫升的 DPBS, 包含 0.4% Triton X-100 (RT), 并在 RT 孵育 5分钟, 防止光线。重复两次抽吸、添加溶液和孵育。
9. 在荧光显微镜下进行显微检查, 以观察^其分化效率28。

传播的 hpsc (585a129,30) 被浓缩并形成一个适合分化的均匀单层 (图 1b)。未分化的 Hpsc (第0阶段) 在低细胞密度 (1-1. 1.5 x10 5 细胞 2) 时分离并重新播种为单细胞.在1小时内, 细胞连接到板上, 开始显示突起。在第一天, 细胞增殖, 分布良好, 覆盖80% 至90% 的表面积。在第一阶段 b, 由于死细胞, 介质出现多云。去除死细胞对于高效分化至关重要, 因为死细胞可能会干扰下面细胞的存活和分化。在 3-4天, 细胞形成一个均匀的单层片, 可以被描述为鹅卵石外观。此时, 大多数细胞停止表达确定性别的区域 y-盒 2 (SOX2), 这是未分化细胞的标记, 而是以90% 以上的速度表达明确的内皮标记 SOX17 (图 2a 和 b)。大多数 SOX17+细胞表示 Foxa2 (图 2a)。以不适当的细胞密度开始分化会影响此步骤的分化效率 (图 3)。在第2阶段和第3阶段, 细胞死亡放松, 使用的培养基不像第1 b 阶段那样多云。细胞以90% 以上的速度表达原始肠道管标记 HNF1Β和 hnf4α (图 2c), 并最终表达后前胰腺祖细胞标记 PDX1 (图 2D 和 e)。PDX1+细胞诱导可在另一条 hiPSC 线 (1231a3 31)和 hesc 线 Khes-3 32 ( 图 4) 中重现。级标记物 mRNA 表达的 qRT-PCR 结果与免疫染色结果一致 (图 5a)。PDX1 的 mRNA 表达在第3阶段表现得很明显, 并显著增加了后记。

PDX1+细胞在早期发育阶段不仅有可能分化为胰腺细胞, 还有可能分化为胃内、十二指肠、肝外胆管和部分肠道 9. 体外生成的 pdx1+细胞对胰腺细胞的分化潜力可以通过延长培养评估, 并报告胰腺内皮和胰腺内分泌细胞的协议 3,16, 26. 第19天 (第4阶段) 和第31天 (第5阶段) 分别观察到胰腺内皮标志物 Nkx6.1 和两个胰腺内分泌标记 Insulin 和glucacon的表达 (图 5).

图 1: 细胞在逐步分化下的代表性外观.(a) 一种从 Hpsc 到胰腺谱系的定向分化方案。括号中的数字表示浓度 (单位写在下面)。(b) 在分化培养的关键步骤中, 具有代表性的高职等私营保安公司明亮场显微镜。585A1 Hpsc 作为单细胞离解并诱导分化为最终的内皮、原始的肠道管和后前肢胰腺祖细胞。下面的面板是上面板的放大视图。RPMI, RPMI 1640;AA, 活性 a (Ng/ml);CH, 口径 99021 (μM);KGF (Ng/ml);NOG, NOGGIN (Ng/ml);CYC, 3-酮-n-氨基乙基-n '-氨基己基二氢肉桂酰环胺 (μM);TTNPB, 4-[(E)-2-(5, 6, 7, 8-四氢-5, 5, 8, 8-四甲基-2-萘基)-1-苯甲酸 (nM)。刻度柱 = 300μm。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: 来自 Hpsc 的胰腺谱系的代表性诱导.(a) 分化前 (第0阶段) 和第4天 (第1 b阶段) 经流式细胞仪分析的 sox2-sox17 + 细胞的比例.未分化的高 Psc (SOX2+sox17-) 被分化为最终内皮 (sox2-sox17+).大多数 SOX17+细胞共同表达 FOXA2。(b) 第4天 (第1 b 阶段) 有代表性的免疫荧光显微镜。固定细胞被染色为 SOX17 (绿色)、SOX2 (红色) 和细胞核 (蓝色)。(c) 第4天 (第1 b 阶段) 和第8天 (第2阶段) 具有代表性的免疫荧光显微镜。固定细胞被染色 HNF1 β (绿色), hnf4α (红色) 和细胞核 (蓝色)。(d) 第4天 (第1 b 阶段) 和第11天 (第3阶段) 用流式细胞术分析 PDX1 阳性细胞的比例。(e) 第11天 (第3阶段) PDX1 (绿色) 和原子核 (蓝色) 的代表性免疫荧光显微镜图。刻度柱 = 100μm。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 3: 从不同细胞密度开始的对最终内皮的代表性诱导.(a) 分化1小时后细胞的代表性明亮场显微图像。高 Psc 作为单个细胞离解, 并诱导在不同的细胞密度 (1-50x 10 4/cm 2)下分化为最终的内皮。下面的面板是上面板的放大视图。(b) 分化前 (第0阶段) 和第4天 (第1 b阶段) 经流式细胞仪分析的 sox2-sox17 + 细胞的比例.(c) 流式细胞术分析 PDX1+细胞在第8天 (第2阶段) 和第11天 (第3阶段) 的比例。刻度柱 = 300μm。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 4: 对 HESCs 和 hESCs 中 PDX1+细胞的代表性诱导.将 hiPSC 线、1231A3 (a) 和 hESC 线 Khes-3 (b) 分化为最终内皮细胞和 pdx1+细胞。流式细胞仪对细胞组成进行了分析。在分化前 (第0阶段) 和第4天 (第1 b 阶段) 分析了 SOX2-SOX17 + 细胞的比例.在第8天 (第2阶段) 和第11天 (第3阶段) 分析了 PDX1+细胞的比例。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 5: 对胰腺内皮细胞和内分泌细胞的代表性诱导.Hpsc (585A1) 被分化为 PDX1+细胞。这些细胞进一步分化为胰腺内皮和胰腺内分泌细胞, 报告的寿命为 3、16、26.(a) 用定量实时聚合酶链反应 (qrt-pcr) 测定了阶段标记物的 mrna 表达。将这些数据归一化为Gapdh的表达, 并将其呈现为基因表达相对于峰值的折叠变化。请注意, Pdx1表达式从第8天 (第2阶段) 增加到11天 (第3阶段), 增加了 gt;20 倍, 从第11天 (第3阶段) 增加到19天 (第4阶段), 增加了 gt;100 倍。成人胰腺中的表达显示为 Panc。sox2, 黑色;Sox17, 紫色;hnf1β, 棕色;hnf4α, 橙色;pdx1, 浅绿色;Nkx6.1, 绿色;胰岛素, 蓝色;格隆, 红的(b) 第11天 (第3阶段) 和第19天 (第4阶段) 胰腺内皮标记 NKX6.1 (红色) 的典型免疫荧光显微镜图。PDX1 (绿色) 和原子核 (蓝色) 进行了共染。(c) 两个胰腺内分泌剂胰岛素 (ins, 绿色) 和胰高血糖素 (gcg, 红色) 的代表性免疫荧光显微镜图, 第19天 (第4阶段) 和第31天 (第5阶段)。核 (蓝色) 被共染色。 请点击这里查看此图的较大版本.

表 1: qPCR 引物。

作者没有什么可透露的。