利用膜组分分离和GTP酶联免疫吸附测定法检测小GTP酶的异戊二烯化及GTP结合能力

摘要

本文介绍了一种用于研究Rho GTP酶法呢基化及其与鸟苷-5'-三磷酸（GTP）结合的实验方案。该方案包含两个详细的方法，即膜组分分离和GTP酶联免疫吸附测定。本方案可用于检测其他多种小GTP酶的法呢基化状态及GTP结合水平。

摘要

Rho GTP酶家族属于Ras超家族，在人类中包含约20个成员。Rho GTP酶在调控多种细胞功能中具有重要作用，包括细胞骨架动态、细胞运动、细胞极性、轴突导向、囊泡运输以及细胞周期调控。Rho GTP酶信号通路的改变在多种病理条件下发挥关键的调控作用，例如 癌症、中枢神经系统疾病和免疫系统相关疾病。Rho GTP酶的翻译后修饰（即，甲羟戊酸途径中间产物介导的异戊二烯化）和GTP结合是影响该蛋白活化的关键因素。本文提供了两种基本且简便的方法，用于检测多种Rho GTP酶的异戊二烯化及GTP结合活性。本论文逐步详细阐述了所采用技术操作的具体步骤。

引言

Rho GTPases 是一组小分子蛋白（21 - 25 kDa），在进化过程中高度保守，属于 Ras 超家族小 GTPases 中的一个独特亚家族。该超家族的每个亚家族均含有一个共同的 G 结构域核心，参与 GTPase 活性及核苷酸交换。¹Rho 家族与其他 Ras 亚家族的区别在于前者具有一个 "Rho 插入区" 在5以内^th β片层和4^th 小GTP酶结构域中的α螺旋².

根据最新的分类，Rho GTPases 被认为是一类属于 Ras GTPase 超家族的信号传导蛋白³哺乳动物Rho GTP酶根据其特定功能和总体特征共有22个成员⁴ 其中RhoA、Rac1和Cdc42是该家族中研究最为广泛的成员。Rho GTP酶与细胞内信号通路相关联 通过 一种依赖于分子开关的严密调控机制 通过 蛋白质翻译后修饰⁵.

GTP结合与水解是小Rho GTP酶激活/失活循环中的关键机制，并受到调控 通过 GTP酶激活蛋白（GAPs）。GAPs负责GTP的水解反应，并与鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）协同作用，后者介导GTP的加载反应。Rho GDP解离抑制因子（GDIs）对小Rho GTP酶提供进一步的调控作用 通过 与GDP结合的Rho GTP酶结合。这会抑制GDP解离，并促进将小型Rho GTP酶从活性细胞内膜位点隔离。此外，GDI的异戊二烯化还进一步调控Rho GTP酶蛋白，调节核苷酸的水解与交换，从而控制GDP/GTP循环。^1,6,7,8.

GTP结合和Rho GTP酶的异戊二烯化均通过改变这些蛋白质的亲脂性，参与Rho GTP酶在细胞质与细胞膜之间的转运^1,9。上述调控因子可与细胞膜的磷脂以及其他调节GDP/GTP交换活性的蛋白相互作用¹⁰。此外，GDI（解离抑制因子）可同时抑制GTP水解和GDP/GTP交换。GDI抑制非活性Rho蛋白与GDP的解离，从而阻止其与下游效应分子的相互作用。GDI还调控GTP酶在细胞质与细胞膜之间的循环。Rho GTP酶的活性在很大程度上依赖于其向细胞膜的转运；因此，GDI被视为关键的调控因子，可通过遮蔽GTP酶的疏水区域/结构域，将其封闭在细胞质中^11,12。

Rho GTP酶在其激活周期的各个阶段实现最佳信号传导和功能，依赖于GTP结合与GTP水解的动态循环。该过程中的任何改变都可能导致Rho GTP酶所调控的细胞功能发生继发性变化，例如细胞极性、增殖、形态发生、胞质分裂、迁移、黏附以及存活^13,14。

当前方案为读者提供了一种监测小分子RhoA GTP酶活化的详细方法 通过 对其异戊二烯化及GDP/GTP负载情况进行研究。该方法也可用于检测多种小GTP酶的异戊二烯化和GTP结合状态。GTP酶联免疫吸附测定可用于测量其他类型GTP酶的活化水平，例如Rac1、Rac2、Rac3、H-Ras、K-Ras或N-Ras、Arf以及Rho¹⁵以辛伐他汀作为药理学试剂的示例，因其最近被报道参与调控小Rho GTP酶的异戊二烯化及其活性^8,9,14,16.

方案

1. 使用膜/胞质分级分离法确定 RhoA 的定位

1. 细胞培养与辛伐他汀处理
   1. 在100 mm培养皿中接种50,000个U251细胞，并在杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（高糖，10%胎牛血清[FBS]）中培养。
   2. 当细胞汇合度达到30%时，移除培养基，加入含辛伐他汀的培养基（10 µM辛伐他汀溶于二甲基亚砜[DMSO]中），在37 °C下孵育36小时⁸仅使用DMSO作为溶剂对照。
      注意：细胞质和细胞膜组分分离需要 1000 万细胞。
2. 细胞收集
   1. 从37 °C培养箱中取出细胞，在显微镜下观察以确认细胞汇合度。
      注意：细胞应达到 70% - 80% 汇合度。
   2. 吸弃培养基，用冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞1次。加入5 mL乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液（KCl：400 mg/L，NaCl：6800 mg/L，NaHCO₃：2200 mg/L，NaH₂PO₄.₂O₂：140 mg/L，D-葡萄糖：1,000 mg，EDTA 二钠：373 mg/L）每平板，并将细胞放回37 °C培养箱中孵育5 min。
   3. 孵育5分钟后，将含有细胞的EDTA收集到一个15 mL离心管中，管中加入与EDTA等体积的培养基。
      注意：管中的培养基可中和EDTA，防止对细胞膜的进一步消化。
   4. 将试管放入冰盒中，然后进行离心。
   5. 将离心机设置为 1,500 x g 在 4 °C 下离心细胞 5 分钟。
   6. 移除上清液，注意不要扰动沉淀，加入1 mL冷的PBS。充分混匀细胞。
   7. 将细胞混合液（溶液）转移至新的1.5 mL离心管中，于1,500 x g 在 4 °C 下离心细胞 5 分钟。
   8. 检查沉淀物大小（以估算下一步所需缓冲液体积）。将样品置于冰上。彻底弃去上清液，注意不要扰动沉淀物。
   9. 加入预冷的缓冲液 I（10 mM Tris-HCl [pH 7.5]，0.1 mM EDTA，0.1 mM EGTA，1 mM 二硫苏糖醇，以及蛋白酶抑制剂混合物），用移液器上下吹打充分混匀样品，随后进行超声处理。
3. 超声处理
   1. 将超声波破碎仪设置为5个循环，每个循环5秒，重复3次。
   2. 在冰上进行超声处理。随后进行超速离心。
      注意：冰和低温条件可保护蛋白质，使实验结果更加可靠。
4. 超速离心
   1. 使用超速离心机将细胞匀浆分离为细胞质和膜组分。将离心机转速设定为 100,000 x g 4 °C 下孵育 35 分钟。如图所示 图1，检查沉淀物的大小。
      注意：膜组分位于管底最下方，其余为其他细胞质组分。
   2. 小心操作，完全收集上清液，避免扰动沉淀。上清液即为胞质组分。将上清液转移至新标记的离心管中。
   3. 向沉淀物（含有膜组分）中加入 300 µL 裂解缓冲液（缓冲液 II）（50 mM Tris-HCl [pH 7.5]、0.15 M NaCl、1 mM 二硫苏糖醇、1% SDS、1 mM EDTA、1 mM EGTA 和蛋白酶抑制剂混合物）。用移液器反复吹打充分混匀。
   4. 进行蛋白质定量及蛋白质印迹（免疫印迹分析）样品制备。
5. 免疫印迹法
   1. 在裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl [pH 7.5]、0.5 mM PMSF、0.5% 非离子去垢剂-40、100 µM β-甘油磷酸、0.5% 蛋白酶抑制剂混合物）中制备分离组分的细胞蛋白提取物。
   2. 使用Lowry法测定蛋白质浓度⁸ 并计算裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl [pH 7.5]，0.5 mM PMSF，0.5% 非变性去污剂octylphenoxypolyethoxyethanol，100 µM β-甘油磷酸，0.5% 蛋白酶抑制剂混合物）的体积，以使各样本间的蛋白质浓度保持一致。
   3. 将样品在 90 °C 下加热 5 分钟，取 15–20 µL 加样至 15% SDS-PAGE 凝胶中以分离蛋白质。
      注意：每个样品上样量为 1 µg 蛋白质。根据此量计算相应的上样体积。
   4. 在还原条件下（500 nM 甘氨酸、50 mM Tris-HCl 和 20% 甲醇），于室温（RT）以 100 V 将分离的蛋白质转移至尼龙膜上，持续 2 小时。
      注意：为确认蛋白质转膜成功，可使用丽春红染色或在膜上观察蛋白质分子量标记。
   5. 用含5%脱脂奶粉和1×含0.01%非离子去垢剂的Tris缓冲盐溶液（TBS/0.01%非离子去垢剂；TBST）在4 °C封闭过夜或室温封闭1小时，以阻断非特异性抗体结合。
   6. 加入一抗进行免疫印迹分析，于 4 °C 下孵育过夜。
      注意：本实验中，Rac1/2/3、cdc42、RhoA、GAPDH 和 pan-Cadherin 均以 1:1,000 的比例溶于含 1% 脱脂奶粉的 1×TBST 中。分别使用 pan-Cadherin 和 GAPDH 确认膜组分和胞质组分的纯度。
   7. 用1×TBST洗涤缓冲液洗涤膜3次，每次20分钟。
   8. 将膜与相应的抗兔辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗在室温下孵育1小时。
   9. 将印迹膜洗涤3次，每次20分钟，然后使用增强化学发光（ECL）检测法显影。

2. 使用小G蛋白激活检测试剂盒测定RhoA GTP负载量

1. 计数至10,000个细胞/mL，将U251细胞接种于100 mm培养皿中进行培养。
2. 当细胞汇合度达到30%时，按照步骤1.1.2所述用辛伐他汀处理细胞。
3. 将培养皿从培养箱中取出，于显微镜下观察细胞，确认汇合度。确保细胞汇合度为70%–80%。将培养皿置于冰上，吸除培养基，用预冷的PBS（pH 7.2）洗涤细胞3次。
4. 吸除 PBS。将培养皿倾斜置于冰上额外一分钟，以彻底去除残留的 PBS。
   注意：残留的 PBS 会对本实验产生不利影响。
5. 在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的700 µL冰浴裂解缓冲液中裂解细胞。
   注意：700 µL 通常足以用于一个 100 mm 的培养皿。参见 表1 以确定每种培养容器的合适体积。
6. 使用细胞刮刀收集细胞裂解液。采用此技术时，将培养板倾斜。
7. 将裂解液转移至预冷并标记好的冻存管中，并置于冰上保存。
8. 使用涡旋振荡器充分混匀。取10 µL裂解液用于蛋白定量检测，以测定样品中的蛋白浓度。
9. 将剩余的细胞裂解液在液氮中速冻。
   注意：在速冻细胞裂解液之前，应预先分装成多个 aliquot，以避免反复冻融，否则可能导致 RhoA GTPase 活性丧失。
10. 将速冻的冻存管转移至-80 °C冰箱中，用于储存GTPase联免疫吸附测定样品。
    注意：样本存放时间不得超过14天。操作应迅速，样本置于冰上不得超过10分钟。切勿同时处理所有培养皿。
11. 使用Lowry法测定蛋白质浓度⁸ 并计算裂解缓冲液体积，以使各样品间的蛋白质浓度归一化。
    注：最佳浓度通常为 1 mg/mL；然而，0.3 - 2 mg/mL 也可被检测到。
12. 通过向微量离心管中加入60 µL裂解缓冲液和60 µL结合缓冲液，制备空白对照。
    注意：空白对照包含所有试剂，唯独不含抗原，用于扣除背景值。
13. 通过加入12 µL Rho对照蛋白、48 µL裂解缓冲液和60 µL结合缓冲液来制备阳性对照。
    注意：阳性对照包含所有试剂以及经确认的 Rho-A-GTP 抗原。
14. 将Rho亲和板从袋中取出，置于冰上。
15. 将粉末用 100 µL 冰蒸馏水溶解于孔中。将板置于冰上。
16. 将速冻的细胞裂解液在25 °C水浴中解冻。
17. 将计算好的冰冻裂解缓冲液体积（来自步骤2.11）加入各样品中，以标准化蛋白浓度。
    注意：洗涤细胞后（使用真空管吸液器）应去除 PBS，以避免影响裂解缓冲液的成分。在 GTPase 活化检测中，为确保样品间的准确比较，需将样品蛋白浓度调整至 0.8 至 2 mg/mL 之间。 表 2 提供本实验所用缓冲液的详细信息。
18. 将60 µL经标准化的冰冻样品转移至微量离心管中，加入60 µL结合缓冲液；充分混匀样品，并置于冰上保存。
19. 用力甩动微孔板以彻底去除其中的水/溶液，随后在实验台垫上用力敲击五至七次。
20. 将50 µL的标准化样品、空白对照和阳性对照分别以复孔加入各孔中。
21. 将培养板置于4 °C、300 rpm的摇床上振荡30分钟。
    注意：振荡步骤非常重要，建议使用300 rpm的轨道式平板摇床。
22. 轻弹洗去板中的样品，于室温下用 200 µL 洗涤缓冲液洗涤 2 次。每次洗涤后，通过轻弹并随后轻拍的方式彻底去除孔中的洗涤缓冲液，将酶标板置于室温台面上。
23. 每孔加入 200 µL 室温抗原呈递缓冲液，室温孵育 2 分钟。
24. 轻弹将孔中溶液弃去，于室温下用 200 µL 洗涤缓冲液洗涤孔 3 次。
25. 每孔加入 50 µL 新鲜配制的 1/250 稀释抗 RhoA 一抗。
26. 将培养板置于摇床上，25 °C、300 rpm 振荡孵育 45 分钟。轻弹微孔，弃去孔内溶液。
27. 重复洗涤步骤2次（步骤2.24）。
28. 每孔加入 50 µL 新鲜配制的 1/250 稀释的抗 RhoA 二抗。
29. 将培养板置于摇床中，在25 °C、300 rpm条件下振荡孵育45分钟。
30. 通过等体积混合试剂A和试剂B来配制HRP检测试剂。
31. 轻弹去除各孔中的溶液，于室温下用 200 µL 洗涤缓冲液洗涤孔 3 次。
32. 每孔加入 50 µL 新鲜配制的 HRP 检测试剂。
33. 在3至5分钟内读取发光信号以获得最大信号，并使用适当的软件包分析结果。
    注意：必须在3 - 5分钟内读取数据，以获得最大信号。运行一个 "测试板" 以确认用于细胞裂解液的裂解缓冲液体积适当，从而使蛋白浓度足以检测RhoA GTPase活性。（测试板是指用于确定蛋白浓度是否处于可接受范围，以及所用裂解缓冲液体积是否合适的细胞培养板。）若处于线性范围内，阳性对照的读数应比空白孔高出4至10倍。若不符合此标准，则应参照仪器制造商的说明调整化学发光仪。化学发光仪的设置参数如下所示 表3.
34. 在标题为“输入原始数据”的列中输入原始数据 样本, 平均值, 标准差, rep1, rep2, rep3，以及 rep4，用于显示每个样本进行的重复次数。
35. 下 平均值，输入公式 =average(Xn:Yn) 其中 X = 列标识符 rep1，Y = 列标识符 rep4，其中 n 为当前正在处理的行的行标识符。
36. 在下方 标准差，输入公式 =stdev (Xn:Yn) 其中，X = 列标识符 rep1，Y 为列标识符 rep4，其中 n 为当前正在处理的行的行标识符。
37. 将重复实验数据输入 rep1, rep2, 等等。
38. 输入数据后，使用单击并拖动的方法选择 样本, 平均值，以及 标准差.
39. 然后，在数据分析软件中，选择用于制图的函数，该函数图标为一个内部带有微型柱状图的方块。
    注意：这将启动图表创建过程，可根据输入的数据设计图表。
40. 选择 柱状图 以及，对于输入值，指定 平均值 数字
    注意：该图表的 平均值 首先进行数字的设定，然后， 标准差 y轴误差线的对应列已指定。操作方法为：双击图表中的柱状条，选择 Y轴误差 点击标签， 自定义 选项，并在工作表中选择区域以输入位置信息 标准差 数据。在生成所需的图表后，可以观察到需要比较的各组之间的差异。

结果

膜分级分离：

采用超速离心法对膜组分和胞质组分进行分离。如图1所示，上清液含有胞质组分，沉淀物含有膜组分。通过免疫印迹法检测了经辛伐他汀处理后从U251细胞中获得的胞质和膜组分中RhoA的含量。膜组分和胞质组分的纯度及上样量控制分别通过pan-Cadherin和GAPDH进行验证。如图2所示，辛伐他汀处理减少了膜结合型RhoA GTP酶的含量，同时增加了其在胞质中的含量。这一结果与他汀类药物通过抑制RhoA的异戊二烯化修饰而影响GTP酶转位的已知作用机制一致。辛伐他汀抑制RhoA GTP酶的异戊二烯化，因此未修饰的RhoA无法锚定于细胞质膜，导致其在胞质中的浓度升高。

讨论

本文介绍了一种精确测定小GTP酶法呢基化和GTP结合的方法，表现为小GTP酶的亚细胞定位（膜相 versus 胞质溶胶）以及Rho GTP的负载情况。小GTP酶在真核细胞中表达，在细胞增殖、运动性和结构维持中发挥关键作用。法呢基化和GTP结合均参与调控GTP酶的活性，因此，评估这些蛋白法呢基化和GTP结合状态的实验方法是细胞生物学家的重要工具^1,8。

根据最近一项研究的结果，Rho 蛋白的 GTP 负载具有细胞类型特异性⁸，因此在不同细胞类型之间存在差异。此外，Rho 蛋白的亚细胞定位及其法呢基化（GGT）是调控其功能的关键步骤。这一过程还受到主要 GTP 酶的效应蛋白 GEF、GAP 和 GDI 相互作用的进一步调控。

已知辛伐他汀可增加THP-1单核细胞中Rac GTP的负载，能在淀粉样蛋白β刺激存在的情况下降低Rac的异戊二烯化，并减少这些...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM 高糖	VWR (加拿大)	VWRL0101-0500
胎牛血清	VWR (加拿大)	CA45001-106
青霉素/链霉素	VWR (加拿大)	97062-806
EDTA（乙二胺四乙酸）	VWR (加拿大)	CA71007-118
EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸）	VWR (加拿大)	CAAAJ60767-AE
DTT（DL-二硫苏糖醇）	VWR (加拿大)	CA97061-340
过硫酸铵	VWR (加拿大)	CABDH9214-500G
Tris-羟甲基氨基甲烷	VWR (加拿大)	CA71009-186
30% 丙烯酰胺/Bis 溶液	Biorad (加拿大)	1610158
TEMED	Biorad (加拿大)	1610801
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma/Aldrich (加拿大)	P8340-5ML	1:75 稀释
Rho-GTPase 抗体试剂盒	Cell Signaling (加拿大)	9968	1:1000 稀释
泛钙黏蛋白抗体	Cell Signaling (加拿大)	4068	1:1000 稀释
GAPDH 抗体	Santa Cruz Biotechnology (美国)	sc-69778	1:3000 稀释
RhoA G-LISA 活化检测试剂盒（发光法）	Cytoskeleton Inc. (美国)	BK121	Cytoskeleton I. G-LISA 活化检测试剂盒技术指南. 2016.
RhoA 抗体	Cell Signaling	2117
ECL	Amersham-Pharmacia Biotech	RPN2209
抗兔 IgG（全分子）过氧化物酶抗体	Sigma	A6154-1ML
SpectraMax iD5 多功能微孔板读板仪	Molecular Devices	1612071A	分光光度计
Nonidet P-40	Sigma	11332473001	非变性去垢剂，辛基苯氧基聚乙氧基乙醇
DMSO	Sigma	D8418-50ML
PBS	Sigma	P5493-1L
磷酸酶抑制剂混合物	Sigma	P5726-5ML	1:75 稀释