本文介绍了一种研究Rho GTP酶法呢基化及鸟苷-5'-三磷酸（GTP）负载的实验方案。该方案包含两种详细方法，即膜组分分离和GTP酶联免疫吸附测定。本方案可用于检测其他多种小GTP酶的法呢基化状态及GTP结合情况。
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本文内容
摘要
摘要
Rho GTP酶家族属于Ras超家族，在人类中包含约20个成员。Rho GTP酶在调控多种细胞功能中具有重要作用，包括细胞骨架动态、细胞运动、细胞极性、轴突导向、囊泡运输以及细胞周期调控。Rho GTP酶信号通路的改变在多种病理状态下发挥关键调控作用，例如 癌症、中枢神经系统疾病以及免疫系统相关疾病。Rho GTP酶的翻译后修饰（即由甲羟戊酸途径中间产物介导的异戊二烯化）以及GTP结合是影响该蛋白活性的关键因素。本文提供了两种基本且简便的方法，用于检测广泛范围的Rho GTP酶异戊二烯化修饰和GTP结合活性。本文逐步详细阐述了所采用技术操作的具体步骤。
引言
Rho GTPases 是一组小分子蛋白质（21 - 25 kDa），在进化过程中高度保守，属于 Ras 超家族小 GTPases 中的一个独特亚家族。该超家族的每个亚家族均含有一个共同的 G 结构域核心，参与 GTPase 活性及核苷酸交换。1Rho 家族与其他 Ras 亚家族的区别在于其存在一个 "Rho 插入区" 在5以内th β片层和4th 小GTP酶结构域中的α螺旋2.
根据最新的分类，Rho GTPases 被认为是一类属于 Ras GTPase 超家族的信号传导蛋白3哺乳动物Rho GTP酶根据其特定功能和总体特征共有22个成员4 其中RhoA、Rac1和Cdc42是该家族中研究最为广泛的成员。Rho GTP酶与细胞内信号转导通路相关联 通过 一种依赖于分子开关的严格调控机制 通过 蛋白质翻译后修饰5.
GTP结合与水解是小Rho GTP酶激活/失活循环中的关键机制，并受到调控 通过 GTP酶激活蛋白（GAPs）。GAPs负责GTP的水解反应，并与鸟嘌呤核苷酸....
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方案
1. 使用膜/胞质分级分离法确定 RhoA 的定位
- 细胞培养与辛伐他汀处理
- 在100 mm培养皿中接种50,000个U251细胞，并在杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（高糖，10%胎牛血清[FBS]）中培养。
- 当细胞汇合度达到30%时，移除培养基，加入含辛伐他汀的培养基（10 µM辛伐他汀溶于二甲基亚砜[DMSO]中），在37 °C下孵育36小时8仅使用DMSO作为溶剂对照。
注意：细胞质和细胞膜组分分离需要 1000 万细胞。
- 细胞收集
- 从37 °C培养箱中取出细胞，在显微镜下观察以确认细胞汇合度。
注意：细胞汇合度应为 70% - 80%。 - 吸弃培养基，用冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞1次。加入5 mL乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液（KCl：400 mg/L，NaCl：6800 mg/L，NaHCO₃：2200 mg/L，NaH2PO4.2O₂：140 mg/L，D-葡萄糖：1,000 mg，EDTA 二钠：373 mg/L）每平板，并将细胞放回37 °C培养箱中孵育5 min。
- 孵育5分钟后，将含有细胞的EDTA收集到一个15 ....
- 从37 °C培养箱中取出细胞，在显微镜下观察以确认细胞汇合度。
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结果
膜分级分离：
采用超速离心法对膜组分和胞质组分进行分离。如图1所示，上清液含有胞质组分，沉淀物含有膜组分。使用辛伐他汀处理U251细胞后，通过免疫印迹检测了胞质和膜组分中RhoA的丰度。膜组分和胞质组分的纯度及上样量控制分别通过pan-Cadherin和GAPDH进行验证。如图2所示，辛伐他汀处理减少了膜结合型RhoA GTP酶的含量，同时增加了其在胞质中的含量。该结果与他汀类药物通过抑制RhoA的异戊二烯化修饰而影响GTP酶转位的已知作用机制一致。辛伐他汀抑制RhoA GTP酶的异戊二烯化，因此未修饰的RhoA无法锚定于细胞质膜，导致其在胞质中浓度升高。
RhoA.......
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讨论
本文介绍了一种精确测定小GTP酶法呢基化和GTP结合的方法，通过检测小GTP酶的亚细胞定位（膜相versus胞质）以及Rho GTP的负载状态来实现。小GTP酶在真核细胞中表达，在细胞增殖、运动性和结构维持中发挥关键作用。法呢基化和GTP结合均参与调控GTP酶的活性，因此，评估这些蛋白法呢基化和GTP结合状态的实验方法是细胞生物学家的重要工具1,8。
根据最近一项研究的结果，Rho 蛋白的 GTP 负载具有细胞类型特异性8，因此在不同细胞类型之间存在差异。此外，Rho 蛋白的亚细胞定位及其法呢基化（GGT）是调控其功能的关键步骤。这一过程还受到主要 GTP 酶的效应蛋白 GEF、GAP 和 GDI 相互作用的进一步调控。
已知辛伐他汀可增加THP-1单核细胞中Rac GTP的负载，能在淀粉样蛋白β刺激存在的情况下降低Rac的异戊二烯化修饰，并减轻.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Saeid Ghavami 获得了健康科学中心运营拨款、CHRIM 运营拨款以及曼尼托巴研究会新研究者运营拨款的支持。Javad Alizadeh 获得了曼尼托巴研究会研究生奖学金的支持。Shahla Shojaei 获得了健康科学基金会运营拨款以及 MITACS 加速博士后奖学金的支持。Adel Rezaei Moghadam 获得了由 Joseph W. Gordon 持有的加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）运营拨款的支持。Amir A. Zeki 获得了美国国立卫生研究院/国家心肺血液研究所 K08 奖项（1K08HL114882-01A1）的支持。Marek J. Los 感谢 LE STUDIUM 高等研究所（法国中央-卢瓦尔河谷大区）通过其智能卢瓦尔河谷综合计划提供的支持，该计划同时获得玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里行动计划资助（项目编号 #665790）。Simone da Silva Rosa 获得了 UMGF 研究生奖学金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM 高糖 | VWR (加拿大) | VWRL0101-0500 | |
| 胎牛血清 | VWR (加拿大) | CA45001-106 | |
| 青霉素/链霉素 | VWR (加拿大) | 97062-806 | |
| EDTA（乙二胺四乙酸） | VWR (加拿大) | CA71007-118 | |
| EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸） | VWR (加拿大) | CAAAJ60767-AE | |
| DTT（DL-二硫苏糖醇） | VWR (加拿大) | CA97061-340 | |
| 过硫酸铵 | VWR (加拿大) | CABDH9214-500G | |
| Tris-羟甲基氨基甲烷 | VWR (加拿大) | CA71009-186 | |
| 30% 丙烯酰胺/Bis 溶液 | Biorad (加拿大) | 1610158 | |
| TEMED | Biorad (加拿大) | 1610801 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma/Aldrich (加拿大) | P8340-5ML | 1:75 稀释 |
| Rho-GTPase 抗体试剂盒 | Cell Signaling (加拿大) | 9968 | 1:1000 稀释 |
| 泛钙黏蛋白抗体 | Cell Signaling (加拿大) | 4068 | 1:1000 稀释 |
| GAPDH 抗体 | Santa Cruz Biotechnology (美国) | sc-69778 | 1:3000 稀释 |
| RhoA G-LISA 活化检测试剂盒（发光法） | Cytoskeleton Inc. (美国) | BK121 | Cytoskeleton I. G-LISA 活化检测技术指南. 2016. |
| RhoA 抗体 | Cell Signaling | 2117 | |
| ECL | Amersham-Pharmacia Biotech | RPN2209 | |
| 抗兔 IgG（全分子）过氧化物酶抗体 | Sigma | A6154-1ML | |
| SpectraMax iD5 多功能微孔板读板仪 | Molecular Devices | 1612071A | 分光光度计 |
| Nonidet P-40 | Sigma | 11332473001 | 非变性去垢剂，辛基苯氧基聚乙氧基乙醇 |
| DMSO | Sigma | D8418-50ML | |
| PBS | Sigma | P5493-1L | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Sigma | P5726-5ML | 1:75 稀释 |
参考文献
- Yeganeh, B., et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease. Pharmacology & Therapeutics. 143 (1), 87-110 (2014).
- Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., Sander, C.
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