Method Article

电穿孔对小鼠膀胱 Urothelium 质粒 DNA 传递的新方法

DOI:

10.3791/57649

⸱

May 3rd, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Santa Cruz

In This Article

Summary

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我们描述了一种新的方法, 通过尿道插管和电穿孔将 DNA 质粒传送到小鼠膀胱的尿囊细胞中,体内。为小鼠膀胱疾病模型的产生提供了一种快速便捷的方法。

Abstract

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基因工程鼠模型 (GEMMs) 是非常宝贵的, 揭示了新的生物洞察到人类疾病的启动和进展机制, 如癌症。转基因和条件敲除小鼠经常被用于基因过度表达或消融在特定组织或细胞类型的在体内。但是, 生成生殖鼠标模型可能会耗费大量时间和成本。最近在基因编辑技术方面的进展和通过病毒感染提供 DNA 质粒的可行性, 使许多器官的非生殖的本土小鼠癌症模型得以快速生成。膀胱是一个器官, 这是一个很困难的病毒载体进入, 由于存在的多糖层覆盖的 urothelium。在这里, 我们描述了一个新的方法开发的实验室, 以有效地交付 DNA 质粒到老鼠膀胱 urothelium体内。通过 pCAG-GFP dna 质粒的膀胱灌注和手术暴露膀胱的电穿孔, 表明该 dna 质粒可以具体地传递到膀胱尿失禁细胞中进行瞬态表达。本方法为小鼠膀胱内基因的过度表达和击倒提供了一种快速便捷的方法, 可用于构建膀胱癌及其他泌尿外科疾病的 GEMMs。

Introduction

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基因工程小鼠模型 (GEMMs) 在扩大我们对动物发育、基因功能的体内以及疾病进展的机制1、2等方面发挥了重要作用。生殖 GEMMs 传统上以两种方式发展。首先是通过显微注入 DNA 质粒, 然后将受精卵移植到 pseudopregnant 雌性中, 建立转基因小鼠。二是胚胎干细胞的同源重组和合体的发展, 产生的敲出/敲鼠。特定组织或细胞类型中的基因有条件的剔除, 涉及多代培养和 flox 的基因基因工程等位基因的育种。整个过程可能是昂贵和耗时的, 特别是如果目标是针对多个基因组织-具体。最近, 基因编辑技术, 如聚簇定期 interspaced 短回文重复 (CRISPR) 已被应用于几个小鼠器官, 以诱导组织特异性基因改变的本土癌症建模3, 4,5,6,7或正确的疾病突变原位8,9。在这些研究中, gRNA 载体的传递通常是通过腺病毒或慢....

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Protocol

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这里描述的所有程序都是按照加州大学圣克鲁斯学院动物保育和使用委员会 (IACUC) 的指导方针和条例进行的。

1. 质粒和工具的制备

  1. 每个膀胱染, 准备至少20µL 的 DNA 质粒 (1 µg/µL)。
  2. 在1.5 毫升离心管中添加1µL 的台盼蓝到20µL 质粒溶液中。吸管搅拌良好。
  3. 高压釜所有手术器械, 用70% 乙醇消毒工作室。在执行以下步骤时, 经常用70% 乙醇喷雾手术器械和手套, 或使用玻璃珠灭菌器, 以保持灭菌条件。

2. 麻醉动物

  1. 使用表顶麻醉系统麻醉的动物与异氟醚。打开 O2油箱, 并将氧气流量计调整为1升/分钟。
  2. 在感应腔内放置一只成年雌性 C57BL/6J 老鼠。打开并调整异氟醚蒸发器为3% 的诱导。小鼠应在2分钟内麻醉, 在从诱导室取出小鼠的同时, 对丁丙诺啡镇痛 (0.1 毫克/千克) 进行先发制人镇痛。
    注意: 在这个协议中, 雌性老鼠被使用, 因为它们在尿道插管过程中更容易使用。该协议也适用于雄性小鼠, 但在执行步骤3时需要格外小心。
  3. 在动物的眼睛上涂抹眼药膏以防止干燥。将麻醉鼠标置于一个加热垫上, 其鼻子位于鼻锥中。转动空气回路开关让异氟醚通过鼻锥。
  4. 用胶带抑制头部和鼻锥。将异氟醚蒸发器调整为2% 以进行维护。<....

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Results

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为了证明基因传递到膀胱 urothelium 的成功, 我们使用了 pCAG-GFP15质粒进行电穿孔。采用尿道注射20µL 质粒和台盼蓝溶液, 5 电脉冲。48小时后, 我们对小鼠膀胱进行解剖, 在解剖荧光显微镜下观察 gfp 荧光斑块, 而没有进行电穿孔的阴性对照膀胱则没有显示 GFP 信号 (图 1A)。当我们用角蛋白 (CK) 5、CK18 和 GFP 抗体对切片膀胱组织进行免疫荧光染色时, 我们发现 gfp 信号存在于伞、中间体和基底细胞中, 但不在肌肉层 (图 1B) 中,表明质粒在 urothelium 中的优良特异性。大约15% 的尿细胞为 GFP+, 这种克隆性质应该是癌症模型的理想选择, 因为肿瘤通常是从单个细胞开始的。

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Discussion

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电穿孔增强细胞膜通透性, 是基因 electrotransfer16的一项强大技术。通过电穿孔将基因传递到活体啮齿动物中, 在神经生物学领域经常使用17,18,19,20,21。它在许多其他机构中的潜在应用尚未得到广泛探讨。根据我们的知识, 我们这里描述的方法是第一个报告成功的基因传递的电穿孔到膀胱 urothelium。它为腺病毒/慢病毒北疆的感染方法提供了一些优势。首先, 电穿孔方法更容易、更安全、更便宜, 因为使用非病毒遗传载体, 并且将 DNA 质粒交付给特定的器官站点在体内相对简单。其次, 它避免了不受欢迎的宿主免疫应答, 这些响应通常与病毒载体22的传递相关。第三, 在膀胱的情况下, 它否定.......

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Disclosures

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作者声明没有相互竞争的兴趣。

Acknowledgements

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我们感谢 Kendy 教授、悦张博士和他的帮助建立电穿孔系统。这项工作得到了圣克鲁斯癌症福利小组和 NIH 对 Z.A.W. 的赠款的支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BD 1mL TB 注射器Fisher148232E
丁丙诺啡SigmaB9275-50MG
Dumont 镊子Roboz 外科导管RS-5005手术前用 70% 乙醇处理
ECM830 SQ 波电穿孔仪哈佛仪器450052
Exel International 一次性 Safelet 静脉导管FisherScientific14-841-2124G，2.11 厘米长，0.045 厘米外径
超细显微解剖剪刀Roboz 外科手术装置RS-5135手术前用 70% 乙醇处理
异氟醚Vet 一501017
K&H 加热小动物休息垫，9 x 12 英寸亚马逊n/a用纸巾盖住加热垫
眼药膏FisherNC0849514
PBS，pH7.4Life Technologies10010049
移液器吸头 200 µLUSA Scientific1111-0206
移液器吸头，通用型;0.1 至 10 和微量;LFisher02707438（CS）
PIPETMAN NEO P2GilsonF144561
PIPETMAN NEO P200NGilsonF144565
质粒 CAG-GFPAddgene16664
铂镊子 5 mm哈佛仪器450489直径 5 mm
Roboz 外科仪器RS-5880治疗手术前使用 70% 乙醇
绳亚马逊n/a曼陀罗工艺品 150D 210D 0.8mm 1mm 皮革缝纫缝合 平蜡线绳
绳子 胶带，苏格兰费舍尔19047257
Therio-gel 兽用润滑剂PBS 动物保健353-736
台盼蓝Stain Life Technologies15250061
V-1 桌面系统麻醉VetEquip901806
薇乔线紫罗兰缝合线 18" FS-2 切割 5-0FisherNC0578475
Walgreens 聚维酮碘 10%Walgreens953982
伤口夹Fisher018045
伤口夹涂抹器Fisher01804
剪刀 索

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  2. Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mo....

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Plasmid DNA DeliveryBladder UrotheliumElectroporation TechniqueMouse Bladder CancerGene OverexpressionIntravesical InstillationGFP ExpressionImmunofluorescent StainingSurgical ExposureUrothelial Cells

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