婆罗洲“爆炸蚁”（Formicidae）下颌腺囊腔内容物的分离及其通过气相色谱-质谱法与MetaboliteDetector进行挥发物组分析

摘要

蚂蚁物种中的小型工蚁 Colobopsis explodens 通过解剖以分离其肥大的下颌腺体储液囊中储存的类蜡质物质，随后进行溶剂萃取，并利用气相色谱-质谱联用技术分析。 使用开源软件 MetaboliteDetector 对挥发性成分进行注释和鉴定的方法也进行了描述。

摘要

本文旨在介绍一种针对婆罗洲“爆炸蚁”（属于 Camponotus 属）进行代谢组学分析的实验方案 Colobopsis cylindrica （COCY）组。为此，采用模式物种 C. explodens 被使用. 属于工蚁小工蚁品级的蚂蚁具有显著增大的下颚腺（MGs）。在领地争斗中，它们通过自愿破裂腹部体壁（自爆行为，autothysis），释放其膨大的下颚腺储器（MGRs）中黏稠的内容物，以特有的自杀式“爆炸”方式杀死竞争的节肢动物。本文展示了对该物种工蚁进行解剖以分离蜡状MGR内容物的腹部部分，并列出了提取其中所含挥发性化合物所需的溶剂萃取步骤，继而进行气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析及对提取物中代谢物的初步鉴定。解剖过程在低温条件下进行，且不使用任何解剖缓冲液，以最大限度减少MGR内容物化学成分的变化。在基于溶剂萃取其中所含挥发性代谢物后，本文进一步介绍了通过液体进样-GC-MS分析样品所需的各项步骤。最后，展示了利用开源软件MetaboliteDetector进行数据处理及代谢物初步鉴定的方法。通过该方法，可实现对属于COCY类群蚂蚁MGR中挥发性代谢物的GC-MS分析及利用MetaboliteDetector软件进行代谢物的定性与鉴定。

引言

本工作流程的总体目标是对昆虫分泌物中的化学成分进行系统性研究。主要目的是阐明分泌物整体或其中单个化合物的生态学功能。此外，我们还致力于探究这些分泌物中化合物所涉及的代谢途径。近年来，蚂蚁（膜翅目，蚁科）的腺体分泌物尤其受到关注，因为它们是迄今尚未充分探索的潜在生物活性化合物（如胶粘剂、抗菌物质）的重要来源。 等等。)^1,2属于COCY组某些物种的小型工蚁^3,4 可能提供其从口器延伸至腹部的肥大MGR中所含的这类化合物^5,6当受到假想敌威胁时，小型工蚁 C. explodens⁷ 一些相关物种能以一种特殊方式利用其后肠腺（MGR）内容物：它们通过破裂腹部外壁，将MGR中的黏性物质猛烈喷射到对手身上，从而困住潜在的敌害，甚至可能导致其死亡^5,6,8,9开发和使用本文所述方法的目的是帮助加深对这种蚂蚁分泌物的化学成分及其潜在毒性组分性质的理解。

为此，我们提供了一种解剖 C. explodens 工蚁的实验方案，以获取其蜡状蘑菇体腺（MGR）内容物的胃部部分，并通过溶剂萃取后进行气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析。

气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析是用于昆虫挥发性代谢物（挥发性代谢组）定性和鉴定的成熟方法之一。蚂蚁中常见的目标分析物包括表皮烃¹⁰、信息化学物质¹¹，以及通常具有生物活性的化合物¹²。样品可来源于完整的昆虫个体，也可通过 解剖获取昆虫的特定组织或体液^13,14。样品前处理技术包括使用溶剂提取其中含有的代谢物¹⁴，或采用顶空-固相微萃取（HS-SPME）方法¹⁵。

在代谢组学研究中，采样后必须立即将样品快速冷冻，以最大限度地减少化合物化学组成和含量的变化。本研究所用的蚂蚁通过在现场使用装有深度冷冻冷袋的冷藏袋进行快速冷冻致死。随后，样品利用发电机供电的-20 °C冰箱保存，之后用干冰运输至实验室。本文所述的解剖方法可实现分离MGR内容物，而无需像以往对不同COCY物种研究所做的那样，分析整只蚂蚁或整个腹部^16,17,18。此外，本方案还允许直接获取并分析周围腺体和组织，例如毒腺（VG）^5,8、杜氏腺（DG）⁸或肠道，可用于其他生物学研究，或检测在蚂蚁处理或解剖过程中可能引入的交叉污染。为了在解剖过程中最小化MGR内容物化学成分的变化（例如因样品解冻或使用化学试剂所致），解剖操作已优化为直接在-20 °C冷袋上进行，不使用任何额外缓冲液、洗涤液或溶剂。通过该方法获得的样品适用于回答定性和定量问题。

为进行代谢物的初步注释与鉴定，数据分析通过开源软件 MetaboliteDetector 完成¹⁹，该工具专为GC-MS代谢组学数据的自动分析而开发。它可检测色谱图中出现的单离子峰，执行去卷积步骤，并提取所分析样品中化学化合物的去卷积质谱。MetaboliteDetector对化合物的初步鉴定基于测定的保留指数（RI；软件可自动计算Kovats RI）以及去卷积质谱的相似性。可通过现有的参考谱库（若为通用NIST格式，则可导入）或已建立的内部谱库，对RI值和质谱匹配因子进行交叉验证。此方法符合所建议的（初步）化合物鉴定指南， 例如，由代谢组学标准倡议组织（Metabolomics Standards Initiative, MSI）的化学分析工作组（Chemical Analysis Working Group, CAWG）提出，在相同实验条件下，至少需要两个独立且正交的数据（此处指保留时间（RT）/保留指数（RI）和质谱）与标准品比对，以确认非新代谢物的鉴定²⁰.

整个实验以COCY模型物种C. explodens的后胸腺（MGR）内容物为研究对象，但解剖步骤也可经适当调整后用于分离蚂蚁腹部中其他存在的腺体。此外，尽管我们提供了一套针对MGR内容物挥发性成分进行全面分析的实验方案，该流程中关于提取、气相色谱-质谱联用（GC-MS）检测及数据分析等更具通用性的部分，也可广泛应用于挥发性代谢物的分析及（初步）鉴定。

由于本论文中描述的实验是在昆虫上进行的，因此不需要伦理审批。野外工作、蚂蚁的采样以及将其用于发表均符合文莱达鲁萨兰国 Universiti Brunei Darussalam、文莱研究与创新中心及文莱林业局为本项目制定的相关规定。

方案

1. 蚂蚁的采集

1. 使用吸虫器采集小型工蚁（图1）。
2. 取样后立即通过快速冷冻至-20 °C固定蚂蚁，并在此温度或更低温度下保存，直至进行分析。

2. 蚂蚁MGR内容物和DG的分离

1. 在解剖蚂蚁之前，准备好以下物品：
   1. 使用甲醇-水混合液（MeOH/H₂O）清洁玻璃培养皿和解剖器械₂O；1+1 体积比）和组织。
      警告：甲醇对人体有毒。操作时务必佩戴合适的手套、实验服和护目镜，并在通风橱内进行清洗。
   2. 将冰袋和玻璃培养皿冷冻至 -20 °C。
   3. 确定质量 1.5 mL 螺口小瓶（含带硅胶/聚四氟乙烯（PTFE）隔垫的螺帽），并立即将其置于显微镜旁的冰上。
      注意：样品瓶的选择是可选的。此处，将 MGR 内容物直接放入预冷的 1.5 mL 离心管中 由玻璃制成的小瓶。塑料可能含有化合物（例如， 邻苯二甲酸盐）可能引起干扰目标代谢物信号的伪影。
   4. 将冷冻的冰袋放入由挤塑聚苯乙烯泡沫制成的盒子中。将培养皿置于冰袋上方，并将一只冷冻的蚂蚁放入培养皿内。将盒子固定在体视显微镜下，调节放大倍数（20–40X）并调焦，直至蚂蚁整体清晰可见。
2. 检查冷冻蚂蚁的腹部体节完整性。解剖时，仅选用腹部区域完整的蚂蚁（图2A，B）。排除腹部扁平或体表有硬化MGR内容物痕迹的蚂蚁，不再进行后续分析（图2C，D).
3. 用一对精细尖头镊子夹住所选蚂蚁的并胸腹节（第一腹节），另一对镊子夹住腹柄节（第二腹节），轻轻将腹部（gaster）区域从蚂蚁其余身体部分拉下。图3A).
4. 用精细镊子夹住第4腹板，固定已分离的蚂蚁腹部。用另一把精细镊子夹住第1腹板（位于柄后腹节附近），轻轻剥离取下图 3B）。同样对第2和第3背板重复此操作（图3C，D）直至MGRs的胃部区域（呈黄色） C. explodens 工蚁的腺体内容物通常可见，但在其他物种中，其颜色可能从白色、黄色到红色不等。
   注意：去除外骨骼的同时，MGR 的膜也会部分被移除。
5. 使用解剖针轻轻刮除胃部腔室中成对MGRs内的蜡状内容物图3E）。仅移除蚁腹中能够分离而不破坏其他腺体的MGR内容物。若需施加更大的力或更多操作才能完整获取MGR内容物，则可接受其不完全移除（图4).
6. 用解剖针尖轻轻接触MGR内容物，直至其粘附在针尖上，然后将MGR内容物转移至已知皮重的预冷1.5短螺纹离心管中。
   1. 为去除解剖针尖上粘附的MGR内容物，将针尖移至样品管管壁并将其涂抹在管壁上。盖紧管盖，将样品管置于冰上，待后续分离其他MGR内容物时使用。
7. 为后续检测MGR内容物样本是否可能受到相邻DG来源化合物的交叉污染（第6节），还需采集DG仍保持完整的蚂蚁中的DG图4）并放入一个单独的HPLC小瓶中。
8. 始终用甲醇/水（MeOH/H₂O）清洁培养皿和解剖器械_­2O (1+1 体积比)，在更换腺体或蚂蚁个体时。
9. 对于一个分析样品，合并多只蚂蚁的贮液囊内容物或腺体。
   注意：用于一个分析样品的腺体数量或其内容物可能因实验设计而异。此处，将五只蚂蚁的MGR内容物或DG合并，以获得一个分析样品。

3. 分离腺体内容物的溶剂萃取

1. 确定质量 分析样本（此处为五只蚂蚁的MGR内容物或相邻腺体的混合样本）。
2. 加入冰冻的高纯度乙酸乙酯（EtOAc），按1:14 w/v的恒定比例进行，于冷却条件下涡旋振荡样品5分钟；此处操作在恒温实验室中7 °C条件下进行。
3. 在7 °C、3,820 × g条件下离心样品10分钟，将上清液（来自五只蚂蚁的MGR含量提取物约55–75 µL）转移至预冷的1.5 mL短螺纹小瓶中，内含 0.1 mL 微型插件。用带孔的螺旋盖和红色橡胶/聚四氟乙烯隔垫将小瓶严密密封。
   注意：如果无法立即进行分析，应将提取物保存在 -80 °C 直至分析；但建议在样品制备完成后立即进行分析，以尽量减少冻融循环过程中发生化学变化的风险。

4. 气相色谱-质谱联用（GC-MS）

1. 完成一次完整的气相色谱-质谱（GC-MS）测量序列时，需在1.5 mL短螺纹 样品瓶中分别配制以下溶液：
   1. 使用正己烷将市售烷烃标准溶液稀释至每种化合物终浓度为8 mg/L，配制成保留指数（RI）校准混合物。
   2. 配制一份由纯乙酸乙酯（EtOAc）组成的溶剂空白样。
2. 将含有以下样品的样品瓶：1）溶剂空白样，2）RI校准混合物，3）MGR含量提取物，以及4）DG含量提取物，放入与气相色谱仪（GC）联用的自动进样器的冷却托盘（10 °C）中。
   注意：建议尽量缩短各样品瓶在进样前于自动进样器中的存放时间。对于关键样品（如MGR含量样品），可在分析前立即放入自动进样器。
3. 对每个样品，取1 µL等分试样注入GC-MS系统，在适用于目标化合物的色谱柱上进行色谱分离（本实验使用HP-5MS UI色谱柱）。
   1. 设置适当的GC参数，示例如下：
      1. 以氦气作为载气，设定恒定柱流速为1 mL/min。设置程序升温：起始温度40 °C，保持2 min，随后以10 °C/min升温至330 °C，再保持7 min。进样口温度设为270 °C。
      2. 选择并根据需要调整GC-MS进样的分流比，以获得目标化合物适宜的峰形和信号强度（图5）。
         注意：在本示例中，DG提取物需以2:1的分流比测定，RI校准混合物则需在不分流模式下测定。MGR含量提取物分别以2:1和50:1两种分流比进行了两次分析。
      3. 辅助温度设为350 °C。
   2. 将质谱仪（MS）参数设置如下：离子源温度230 °C，四极杆温度150 °C，扫描范围从低质量数30至高质量数500，溶剂延迟时间分别为4.1 min（适用于溶剂空白样和实验样品）或6.1 min（适用于RI校准混合物）。扫描速率设为约3次扫描/秒。
      注意：质谱参数，特别是MS扫描速率、采样率和循环时间，可能影响峰识别和谱图解卷积，在选择参数设置时需考虑MetaboliteDetector软件对数据的正确解析需求。
4. 测量完成后，将数据导出为.AIA项目文件（此处使用GC配套的数据分析软件完成），并保存至便携式存储设备。
   1. 选择 文件 | 导出数据为AIA格式…，勾选 创建新目录，点击 确定。选择目标存储位置（例如，U盘），点击 打开。选择要导出的文件，点击 ---> 图标，最后点击 处理 确认导出。 

5. 使用 MetaboliteDetector 软件进行代谢物检测与鉴定

1. 在开始分析数据文件之前，打开 MetaboliteDetector，选择 工具 | 设置，并按如下要求设置参数（MetaboliteDetector 的各个工作表以粗体标出）：
   1. 在薄层中 外观将时间尺度设置为“分钟”，并启用坐标轴标签选项。
   2. 在薄层中 去卷积设置峰检测参数：峰阈值：10，最小峰高（噪声单位）：10。取消勾选基线校正。设置代谢物检测参数：每扫描分箱数：10，解卷积宽度（扫描数）：5，所需强度（基峰百分比）：0，所需峰数量：10。
   3. 在表格中 鉴定，将文库搜索选项设置为：化合物文库：“CalibrationLibrary_Alkanes”以及NIST（NIST sqlite文库可包含在.lbr格式中）。参数设置如下：最大保留指数（RI）差异：10，截断分数：0.9，纯/不纯组分比：0.5，碎片数量：2，相同碎片的最小数量：1。使用缩放文库：勾选；相似度评分：谱图相似度；质量过滤器：m/z 207、221、281、355 和 1147（用于排除来自气相色谱柱固定相的已知污染物）。
   4. 在薄层中 定量分析 设置参数如下：定量离子数量：3，相邻离子间的最小间距：5，最低所需质量指数：1。排除定量离子 207、221、281、355 和 1147。
      注意：对于高分辨率质谱数据，还需在工作表中设置以下参数 质心 阈值起点：10，阈值终点：-5，最大基线距离：30，半高全宽：0.5。
2. 通过选择将生成的 .AIA 项目文件中包含的 .CDF 格式文件作为 .NetCDF 导入 MetaboliteDetector 软件中 文件 | 导入 | NetCDF 导入. 选择文件夹形状的图标，然后选取要导入和处理的样本类别的文件：1) 溶剂空白，2) 折光率校准物，3) MGR含量提取物，以及4) DG含量提取物。确认后 好的 开始数据处理。处理完成后，选择 关闭 在弹出的窗口中。
3. 用于MGR提取物中化合物的折射率校准及折射率值测定，选择 文件 | 打开 并选择包含RI校准物数据的文件。
   1. 打开RI校准文件后，选择 放大镜 图标。用弹出窗口进行确认 好的.
   2. 为正确进行示差检测器校准，请检查示差校准品文件中可检测烷烃的范围。
      1. 为此，选择第一个烷烃（保留时间最短）峰的第一个峰顶下方出现的三角形， 图6）通过单击即可检测到。
      2. 检查与烷烃数据库条目相比具有最高谱图相似性（“Spec. sim.”，最高得分为1）的匹配项图6).
      3. 为验证所推测的烷烃化合物的结构，将其质谱图与文献中提供的质谱图进行比对， 例如， NIST 化学网书²².
      4. 通过计数色谱图中出现的最后一个烷烃峰，确定RI校准混合物中可检测到的最后一种烷烃。
   3. 用于相对强度校准，请选择 工具 | RI-校准向导选择 下一步.
   4. 单击文件夹形状的图标，选择包含RI校准混合物色谱图的文件。选择 下一步.
   5. 在弹出的窗口中选择包含烷烃校准物条目的数据库。
   6. 选择RI校准文件中可检测到的所有烷烃的谱库条目，然后单击 >> 图标。选择后 >>，选择 下一步.
   7. 检查出现表格中每种可检测烷烃所列的保留时间（RT）。为此，可通过点击相应三角形，查看主窗口中每种烷烃所显示的保留时间（RT）。图7）。如有必要（图8)，通过双击校准表中相应字段，打开下拉菜单并选择推荐的正确保留时间，手动校正保留时间。或者，可使用键盘输入保留时间（图9).
   8. 当每种烷烃的保留时间（RT）正确时，选择 下一步. 点击 下一步 在显示RI校准表的弹出窗口中。
   9. 选择绿色 + 出现的符号 色谱图选择 窗口中，选择溶剂空白的数据文件以及腺体提取物的文件，然后选择 下一步在弹出的窗口中设置参数如下：取消基线校正，峰阈值：5，最小峰高：5，每扫描分箱数：10，解卷积宽度：5。点击 下一步 然后 开始 用于计算所选样本文件中化合物的折射率（RI）。
4. 对于 对MGR提取物中选定代谢物进行注释与鉴定，通过选择打开已测MGR含量提取物的数据文件，其中保留指数（RIs）已按上述步骤（5.3.9）计算完成 文件 | 打开 并选择所需的数据文件。
   1. 选择 工具 | 设置 | 去卷积 并将峰阈值和最小峰高（噪声单位）均更改为5。选择 放大镜 图标，并再次确认弹出的警告窗口 好的.
   2. 单击位于目标峰最大值下方出现的三角形，并通过选择与 NIST 谱库中存储的质谱图进行比对 NIST 图标。
   3. 选择NIST搜索结果中的第一个匹配项图10).
   4. 如果目标化合物的谱图相似度与NIST数据库中的条目相比高于所选的谱图相似度阈值（此处为≥0.9），图10），查阅文献中针对该化合物（在气相色谱柱固定相相似、液膜厚度和柱内径相同条件下）给出的保留指数（RI）例如， NIST 化学网书²²).
   5. 计算实验测得的折射率（RI）与NIST标准参考RI（当提供多个RI值时取其平均值）之间的相对差异。若该差异等于或小于用户设定的最大容许值（此处为≤±1%），则将该化合物标记为“已注释”。
   6. 对 MGR 样品文件中包含的所有目标化合物重复执行步骤 5.4.2–5.4.5。
   7. 对于 化合物鉴定，比较标准溶液的保留指数（RI）和质谱图例如， 2–100 mg/L）在第4节所述相同条件下测得的结果进行比较 标注的化合物。
   8. 按照第4节所述分析标准品，并按照4.4和5.2步骤中所述方法处理所得的烷烃和MGR含量腺体数据。
   9. 通过选择标准品获取的数据进行校准 工具 | RI校准向导 | 下一步 并选择之前使用过的相同RI校准文件。选择 下一步，然后再次 下一步 并点击绿色按钮，选择包含从标准溶液获得的数据的文件 + 符号。点击 下一步 然后 开始 用于计算标准化合物的RI值。
      注意：若在样品分析后无法立即进行标准品的分析，建议重新分析折射率（RI）校准物，并对标准品重新进行RI校准和计算。
   10. 打开标准品对应的文件，并通过将其谱图与NIST谱库进行比对（如步骤5.4.2所述）来确认其身份。
   11. 在确认标准品的身份后，将该标准品的质谱图和保留指数（RI）添加到内部数据库中。为此，请点击绿色 + 符号并输入库条目的首选名称。确认以 好的 将标准化合物的质谱图和保留指数（RI）添加至数据库。如果新的 条目在库中不可见，请激活该条目 刷新 按钮。
       注意：如果折射率（RI）校准成功，则 MetaboliteDetector 确定的 RI 值将显示在相应的谱库条目中。在为标准品创建谱库条目后，即可基于 RI 和质谱相似性的组合，对 MG 提取物中的该代谢物进行鉴定。
   12. 再次打开 MGR 内容数据文件。选择 工具 | 设置 | 识别现在，随着标准化合物的保留指数（RI）被计算并添加至数据库条目中，更改 相似性评分 从 光谱相似性 到 综合评分.
   13. 点击 放大镜 图标，然后选择步骤 5.4.5 中已标注化合物下方的三角形。
   14. 点击命中结果，查看“总体相似性评分”（OSS，Metabolite Detector 简写为“Overall simil.”）的数值，该评分综合考虑了质谱相似性和保留指数（RI）相似性评分图11).
       注意：如果在内部文库中发现阳性结果，它将显示在主窗口的右侧。
   15. 如果OSS高于用户定义的阈值（此处为≥0.9，也由三角形的绿色表示），则将该化合物标记为“已鉴定”图11).

6. 检测 MGR 内容提取物中是否被 DG 内容污染

1. 打开已使用 MetaboliteDetector 计算出化合物保留指数（RI）的 DG 样品的校准文件（步骤 5.3.9）。
2. 为了叠加测量得到的 MG 含量样品与 DG 样品的色谱图，请选择 工具 | 色谱图叠加，然后通过绿色的 + 图标选择对应的两个文件，并点击确定进行确认。
3. 要查看叠加结果，请在窗口底部选择出现的 色谱图叠加 工作表。
4. 检查 MGR 含量提取物（图 12）与 DG 含量提取物中化合物的重叠情况，并将重叠的化合物从后续的 MGR 含量分析中排除。

结果

C. explodens 腺体分泌物中推定代谢物鉴定的实验步骤示意图见图13。此外，提供了用于本实验的COCY工蚁最重要身体部位的示意图，见补充图S1 A、B。补充图S2展示了从蚂蚁解剖到MGR内容物中推定代谢物鉴定的主要步骤。

为分离适合进行挥发物组分析的MGR内容物，在运输、储存以及解剖过程中均需保持低温状态。为此，使用昆虫吸虫器在原地采集蚂蚁后立即将其冷冻（第1节及图1）in situ。蚂蚁样本在-20 °C冰箱中储存2天后，用干冰运输至奥地利，并立即置于-80 °C保存，直至进一步分析。适合用于MGR内容物分离的蚂蚁应具有圆形且完整的腹部（gaster）区域（图2A），在最佳情况下，其MGR内容物充足，可通过背板之间的可见MGR判断（图2B）。不适合进一步分析的蚂蚁腹部如图2C、D所示。从COCY蚂蚁中分离MGR内容物的主要步骤（步骤2.3–2.6）如图3所示。分离得到的MGR内容物（在C. explodens中呈黄色，但在COCY类群的其他物种中颜色可从白色到红色不等）如图14所示。

在解剖蚂蚁以获取其MGR内容物时，应注意避免刺破或损伤其他腺体或肠道（步骤2.5）。图4显示了一只已解剖的蚂蚁腹部，其中两个其他腺体（DG和VG）仍保持完整，MGR内容物已被分离。图15展示了蚂蚁肠道内容物污染的可见示例。由于位于MGR下方的DG内容物交叉污染无法完全避免，本方案中包含了一部分用于分析这些腺体的步骤，以便将所得信号与MGR内容物提取物的信号进行比较（第6节）。若解剖操作得当，每只蚂蚁可获得约0.75–1.2 mg的MGR内容物。在本方案中，将五只蚂蚁的MGR内容物合并，以获得每份3.9–5.9 mg的重复样品。

分离的腺体储液内容物用乙酸乙酯（EtOAc）进行萃取（第3节），并采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）进行分析（第4节）。对 C. explodens 工蚁的蜜腺（MG）内容物提取物进行检测，得到的色谱图包含数十种假定蜜腺储液（MGR）内容物化合物的色谱峰及其质谱图（图5）。蜜腺内容物提取物中的两种主要代谢物——1-(2,4,6-三羟基苯基)-乙酮（ID 4）和5,7-二羟基-2-甲基色原-4-酮（ID 5）——导致色谱柱过载，因此同一样品在更高的分流比（50:1）下再次进行分析（图5，插图）。若蜜腺储液内容物被后胸腺（DG）成分交叉污染，则会在GC-MS色谱图中表现为从约29分钟开始出现额外的晚保留时间（RT）峰（图12）。排除溶剂空白、GC色谱柱固定相、蚂蚁腹部中后胸腺内容物来源的化合物所对应的色谱峰和质谱信号后，再结合MetaboliteDetector软件处理，共获得约110种信号噪声比（S/N）≥10的蜜腺储液内容物化合物。为后续使用MetaboliteDetector软件对代谢物进行注释和鉴定，对色谱图进行了校准，并测定各样品文件的保留指数（RI）值（步骤5.3及子步骤，图6、图7、图8、图9）。检测到的假定蜜腺储液内容物代谢物基于其质谱与NIST谱库的相似性进行注释，该谱库是本示例中MetaboliteDetector软件的组成部分（步骤5.4及子步骤，图10）。此外，在化合物注释过程中还参考了文献中报道的、在相同或类似色谱柱固定相、膜厚和内径条件下测得的保留指数（RI）值（步骤5.4.4和5.4.5）。在设定严格的匹配标准，并通过标准品对RI值和质谱图进行验证后（如实验方案部分对一种标准化合物所述，步骤5.4.7–5.4.15及图11），最终确认了约10%检测到的代谢物的身份。由于关于 C. explodens 蜜腺储液挥发性代谢组的详细研究报告将另文发表，本研究重点分析了Jones et al.¹⁷ 之前已报道的代谢物（本研究中该物种编号为KB02-108；另见Cook et al.²³）。表1 汇总了这些已鉴定的化合物。

图1：昆虫吸虫器的示意图。 在密封小瓶或容器的瓶盖上制作两个孔，将两根柔性管穿过孔。其中一根管子（T1）朝向瓶内的一端用细网密封，网孔足够小以阻挡昆虫通过。此外，在管壁上还打若干小孔以促进空气交换。另一根管子T2的末端靠近昆虫，通过T1吸气，可将昆虫吸入采样瓶中。请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：完整与破损的后腹节。 （A）适合解剖的完整后腹节。（B）后腹节几乎完全充满MGR内容物，同样适合解剖。（C）和（D）为破损的蚂蚁后腹节，其MGR内容物（黄色）已排出并硬化，可能在取样过程中因后腹节表皮破裂所致。这些蚂蚁将被排除在解剖、提取及后续分析之外。T：背板。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：解剖过程中的主要步骤。（A）将腹柄后部（gaster）区域与蚂蚁身体其余部分分离。（B）剥离外骨骼：第一背板（tergite 1）、第二背板（tergite 2）（C），以及第三背板（tergite 3），此后成对的黄色MGR内容物几乎完全可见（D）。（E）使用解剖针去除黏性的MGR内容物。T：背板（tergite）。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：分离MGR内容物后的蚂蚁腹部。 可见腹部中存在的另外两个腺体（VG：毒腺，DG：杜氏腺）。在移除MGR内容物后（可见黄色残留物为分离后剩余物质），这两个腺体结构应仍保持完整。这些腺体可采用与MGR内容物相同的方法进行分析。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：MGR内容物提取物的代表性总离子流（TIC）色谱图。 当采用较高的分流比（50:1）而非常规的2:1分流比时，两个最显著的GC-MS峰呈现出更为对称的色谱峰形（见插图）。请点击此处查看此图的放大版本。

图6：RI校准物色谱图中首个可检出烷烃的确定。 选择第一个烷烃峰峰顶下方的三角形标记。该烷烃在6.31分钟时洗脱，且与数据库条目“Alkane_C09”的质谱相似度（此处为“Spec. sim.”）最高。为确认烷烃的身份，需将其质谱与数据库（例如，NIST Chemistry WebBook²²）进行比对。在本示例中，壬烷通过其分子离子（m/z值为128）得以鉴定。请点击此处查看该图的放大版本。

图 7：使用正构烷烃标准混合物进行 RI 校准。 已打开 RI 校准数据文件，并选择“RI-Calibration-Wizard”功能。应检查保留时间与校准表中所示 RI 值的正确匹配情况。表中正确显示了烷烃_C09（壬烷）的保留时间为 6.31 分钟。 请点击此处查看该图的放大版本。

图8：校准表中显示了错误的保留时间（RT）。 保留时间未正确显示（表现为保留时间数值错误，或以-1表示缺失的保留时间值）。请点击此处查看该图的放大版本。

图9：校准表中错误保留时间的手动校正。 可通过为相应烷烃输入正确的保留时间来手动校正错误值，此处以Alkane_C39为例进行说明。 请点击此处查看该图的放大版本。

图10：所选化合物质谱图与NIST谱库条目的比较。 选择在6.16分钟（RI 891）洗脱的峰顶点并激活“NIST搜索”功能（红色圆圈）后，显示2-庚酮的谱图相似度为0.99。 请点击此处查看此图的放大版本。

图11：MGR内容物提取物中的代谢物鉴定。 将样品色谱图中在保留指数（RI）891处洗脱的化合物所产生的质谱及其RI值，与内部数据库中包含的标准化合物实测质谱和RI值条目进行比对。如果待测样品中某化合物与内部数据库中某化合物之间的“总体相似性评分”（OSS，在Metabolite Detector中简称为“Overall simil.”，综合了质谱和RI信息）≥ 0.9，则该化合物被认定为“已鉴定”。此处，内部数据库中2-庚酮条目与在RI 891处洗脱的化合物之间的OSS为0.96，因此判定MGR内容物提取物中存在2-庚酮。 请点击此处查看该图的放大版本。

图12：DG内容物提取物（红色）与MGR内容物提取物（蓝色）的TIC色谱图片段（29分钟至35分钟）叠加图。 对应于重叠（推测）化合物的峰面积在DG内容物提取物中高于MGR内容物提取物；这些化合物可能来源于DG，因此被视为MGR内容物提取物中的（次要）污染物。对于 C. explodens 的MGR内容物提取物，源自推测DG污染的色谱峰大约出现在29分钟处，该部分色谱图可在MGR内容物的进一步分析中予以排除。请点击此处查看该图的放大版本。

图13：从蚂蚁样品到GC-MS分析后腺体储库内容物提取物中代谢物注释/鉴定的示意图工作流程。 本文所述方案详细说明了从蚂蚁解剖分离MGR内容物开始，经GC-MS分析及数据评估的全部实验步骤（以黑色表示）。作为替代方法，昆虫分泌物也可在原位（in situ）生成并收集（以灰色表示）。请点击此处查看该图的放大版本。

图14：提取前分离的蜡质MGR内容物。（A）两个MGR的内容物粘连在一起，但（B）在分离后也可分开。在C. explodens中，MGR内容物的颜色为橙黄色，但在COCY组的其他物种中，颜色可从白色到红色不等。请点击此处查看该图的放大版本。

图15：被昆虫肠道成分（棕色）交叉污染的分离MGR分泌物示意图。 此类MGR分离物将被排除在提取及后续分析之外。 请点击此处查看该图的放大版本。

编号	代谢物		俗名		InCHI 字符串					分子式
1	庚烷-2-酮				InChI=1S/C7H14O/c1-3-4-5-6-7(2)8/h3-6H2,1-2H3					C7H14O
2	正十一烷				InChI=1S/C11H24/c1-3-5-7-9-11-10-8-6-4-2/h3-11H2,1-2H3					C11H24
3	正十七烷				InChI=1S/C17H36/c1-3-5-7-9-11-13-15-17-16-14-12-10-8-6-4-2/h3-17H2,1-2H3					C17H36
4	1-(2,4,6-三羟基苯基)-乙酮		单乙酰基间苯三酚		InChI=1S/C8H8O4/c1-4(9)8-6(11)2-5(10)3-7(8)12/h2-3,10-12H,1H3					C8H8O4
5	5,7-二羟基-2-甲基色原酮-4-酮		去甲丁香酮		InChI=1S/C10H8O4/c1-5-2-7(12)10-8(13)3-6(11)4-9(10)14-5/h2-4,11,13H,1H3					C10H8O4

表1：从 C. explodens 小型工蚁的MGR内容物乙酸乙酯提取物中鉴定出的代谢物。 列出了部分选定的代谢物。

补充图 S1。本文所述COCY蚂蚁（小型工蚁）最重要身体部位的概览。（A）MGRs 以黄色显示，其腹部部分用于挥发物组分析。（B）MGRs 的腹部部分位于第1至第3腹板下方。T：腹板。请点击此处下载该文件。

补充图 S2：本实验的示意图概述。 图示从蚂蚁解剖到初步鉴定MGR内容物中代谢物的主要步骤。 请点击此处下载该文件。

讨论

本文提供了一套完整的实验方案，用于分析C. explodens小型工蚁肥大性后胸腺（MGR）内容物中的挥发性成分。由于本研究所用蚂蚁在被镊子触碰时可能“爆炸”并不可控地释放其MGR内容物，因此建议使用昆虫吸虫器进行“轻柔”的采集方法（图1）。对于包括COCY蚂蚁在内的某些蚂蚁种类，每个50 mL样品瓶中蚂蚁数量应限制在最多五只，否则可能发生蚂蚁自体中毒（例如，顶空环境中甲酸积累所致）。在野外冷冻蚂蚁时，可使用装有深度冷冻冷敷包的保温袋。样品应迅速冷冻并在低温条件下储存（例如，-20 °C，最佳为-80 °C）；但不建议使用液氮杀死并储存蚂蚁，因为该方法已被观察到会导致其腺体损伤加剧。

本研究所述的无缓冲液和无溶剂解剖方法适用于获取冷冻工蚁中蜡状的下颌腺储器内容物以及其他腺体组织。针对 C. explodens 下颌腺储器（MGR）内容物的挥发物组分析，在解剖过程中需重点关注两个方面：持续保持蚂蚁的低温状态（步骤 2.1.4），以及尽量减少下颌腺样品与其他存在于蚂蚁腹部的腺体内容物或体液之间的交叉污染（步骤 2.5、 图4 和 图15）。相当一部分冷冻蚂蚁可能已经受损，原因可能是采样时蚂蚁“爆炸”，或在从采样地点用干冰运输至实验室的过程中受到损伤。若蚂蚁腹部结构破裂，则该样本不适用于后续分析（图2C、D）。但如果仅缺失或损坏触角和足，则仍可用于提取 MGR 内容物并进行后续分析。由于经冷却处理的 C. explodens 蚂蚁其 MGR 内容物呈蜡状质地，因此使用解剖针即可直接分离（步骤 2.5、图3E 和 图14）。操作黏性较强的 MGR 内容物时需格外小心，因其易附着于任何与其发生物理接触的物体表面，并常会黏附在解剖镊上，从而增加样本间交叉污染的风险。因此，必须仅使用解剖针接触 MGR 内容物 ，并立即将其转移至用于提取的玻璃小瓶中（步骤 2.5 和 2.6）。此外，建议在更换不同蚂蚁个体或不同腺体类型时，使用甲醇/水（MeOH/H₂O）混合液清洁解剖器械（步骤 2.8）。

其他蚂蚁物种的腺体分泌物即使在使用冰袋冷却时也可能呈液态。此时，可先完整分离包括膜在内的整个腺体，随后再刺破以获取其内容物。液态分泌物也可借助细口径毛细移液管进行收集。弓背蚁属COCY类群中的C. explodens工蚁体长平均约为4-5 mm（不含触角），属于该类群中体型较小的物种。其常见膨大的腹部长度约为2-2.5 mm，宽约1-1.5 mm。迄今为止已知COCY类群中体型最大的工蚁体长可达约8 mm，腹部大小约为长3 mm、宽2.5 mm。由于本实验方案适用于解剖和研究不同COCY物种中该尺寸范围的个体蚂蚁及其腹部，因此所使用的解剖器械和显微镜可能需要根据更小型的蚂蚁或更小器官的情况进行相应调整。此外，每个分析样本所需的蚂蚁数量也可能需要相应增加。

在解剖蚂蚁以获取MGR内容物时，关键是要避免损伤其他腺体或肠道——其内容物可能会交叉污染样品（步骤2.5、图4 和 图15）。理想情况下，在提取MGR内容物后，背腺（DG）以及毒腺（VG）应明显保持完整（图4）。由于DG位于MGR下方，因此很难完全避免其内容物的污染。造成这种情况的原因也可能包括在从采样地点用干冰运输至实验室的过程中，腺体完整性部分受损。此外，我们已在多种被研究的蚂蚁中观察到，DG可能在采样过程中或蚂蚁爆裂过程中受到损伤。由于DG内容物可采用与MGR内容物相同的方法进行分析（第3和第4节），因此分析结果可与MGR内容物样品的分析结果进行比较（第6节）。对于从C. explodens蚂蚁获得的MGR内容物提取物，DG中也含有的化合物会在色谱图后期开始洗脱（图12）。为避免将DG化合物误认为MGR组分，可在后续分析中排除相应的代谢物。已有对其他蚂蚁物种的研究表明，DG也可能含有（高度）挥发性化合物^1,24，这些化合物通常在气相色谱（GC）色谱图的早期洗脱。

在以往关于COCY蚂蚁MGR内容物化学成分的研究中，分析对象为整只蚂蚁或其完整的腹部^16,17,18,23，而本研究则通过解剖蚂蚁直接获取其MGR内容物进行分析。

分析解剖后的MGR内容物可使研究人员开展多种生化研究，包括鉴定其中所含的代谢物。由于本研究重点在于鉴定C. explodens MGR中所含的挥发性成分，因此选择气相色谱-质谱联用法（GC-MS）进行分析（第4节）。为此，提取物最好在制备后立即进行检测，或在-80 °C下保存至分析前。需注意的是，（长期）储存可能导致提取物发生化学变化（见步骤3.3和4.2后的说明）。由于MGR内容物的浓度可能跨越多个数量级，因此可能需要在不同的GC分流比下分析MGR提取物。由于本方案示例所用蚂蚁MGR提取物中的两种主要化合物在使用2:1分流比时导致色谱柱过载，因此该样品在更高的50:1分流比下再次进行了分析（步骤4.3.1.2及图5）。第4节中列出的GC-MS参数设置适用于在材料表中指定的GC-MS设备所产生的数据。除RI校准物（步骤4.1.1）外，还应分析溶剂空白样（步骤4.1.2），以便在后续数据分析中识别非生物来源的干扰峰和污染物。对于 代谢物鉴定，还应在与样品提取物相同的GC-MS条件下，测定所标注化合物的真实标准品（步骤5.4.7及后续步骤）。为提高最终数据的准确性和可靠性，建议在同一检测序列中分析所有样品类别（溶剂空白、RI校准物、样品提取物和标准品）。此外，标准品的浓度应与样品提取物中观察到的浓度相近。这有助于提高保留指数（RI）值的准确性，并增强样品与标准物质质谱图之间的相似性，从而实现更充分且更有意义的代谢物注释/鉴定。为此，可使用不同的分流比对标准品进行多次重复测定。

对于 代谢物鉴定采用先进的软件 MetaboliteDetector 进行质谱解卷积，并将保留指数（RI）和质谱图与内置的 NIST 谱库以及已建立的内部谱库进行比对（第 5 节）。建议在基于 64 位的 LINUX 操作系统上运行 MetaboliteDetector例如， KUBUNTU）系统，并将便携式存储设备中生成的 *.CDF 数据文件（步骤 4.4）复制到本地硬盘驱动器上。MetaboliteDetector 能够导入以 centroid 或 profile netCDF 格式存储的原始 GC-MS 数据。大多数 GC-MS 仪器的配套软件应具备将记录的原始数据转换为此格式的功能。¹⁹在开始数据分析之前，强烈建议阅读有关之前 MetaboliteDetector 软件版本的文献，以熟悉其功能和图形用户界面。^19,25,26.

用于样品提取物中化合物峰的保留指数（RI）校准及后续RI值计算时，需使用包含RI校准物（此处为正构烷烃）的保留指数与质谱信息的谱库。该谱库可自行建立，也可下载现有的谱库（'CalibrationLibrary_Alkanes'）²⁷提供的默认校准剂库包含正构烷烃（C09至C39）的保留指数（RI）和质谱图，这些数据是根据第4节所述方法分析获得的。该库使使用Metabolite Detector的用户能够直接开始数据的校准过程。如有需要，还可向该库中添加更多烷烃的条目以扩展其内容。根据参考值与实验测得的保留指数及质谱图的相似性（见步骤5.3及其子步骤）， 图7, 图8, 图9), 化合物的注释或鉴定可按步骤5.4及子步骤进行， 图11）。此外，在使用 MetaboliteDetector 进行自动化数据处理后，用户必须通过检查每个目标化合物对应“三角形”下方的质谱图，手动核实峰提取和谱图解卷积的正确性。同时，根据所使用的 GC-MS 仪器及数据采集时的参数设置，可能需要对本文所述的 MetaboliteDetector 参数设置进行相应调整。MetaboliteDetector 软件具备多种本文未详述但极具实用价值的功能， 例如， 提取离子流（EIC）色谱图的显示、色谱图导出为.csv格式、化合物的自动批量定量，以及更多功能。

本文所述方案可为其他研究人员开展相关实验提供参考，这些实验包括昆虫腺体或腺体内容物的分离、挥发物组分析以及代谢物鉴定。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 ml 离心管，115 x 28 mm，平底/锥底，聚丙烯材质	Sarstedt	62,559,001	见稿件中图1
PVC 管路	Rehau	290 4489	见稿件中图1
不锈钢筛网，孔径 0.63 mm	Antstore	1000378	见稿件中图1
冷冻柜	Severin	KS 9890	-20 °C 或更低
聚苯乙烯泡沫箱，内径尺寸 155 mm x 100 mm x 45 mm	Thorsten Koch	4260308590481
玻璃培养皿，100 mm x 15 mm	Aldrich	BR455742
冷敷包，150 mm x 100 mm	Elite Bags	1998	冷冻至 -20 °C
装有碎冰的容器
1.5 mL 短螺纹小瓶，32 x 11.6 mm，透明玻璃，一级水解玻璃，宽口	La-Pha-Pack	11090500
1.5 mL 短螺纹小瓶用螺口盖，封闭式，白色硅胶/红色聚四氟乙烯隔垫，硬度 55° shore A，厚度 1.0 mm	La-Pha-Pack	9151799
体视显微镜	Bresser	5806100
镊子，超细尖头，弯曲型	Medizinische Instrumente May, Norman May	PI-0005B
镊子，超细尖头，直型	blueINOX	BL-3408
解剖针，140 mm，尖头，直型	Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH	1110301
甲醇，LC-MS CHROMASOLV，Honeywell Riedel-de Haën	fisher scientific	15654740
蒸馏水
Rotizell-Tissue-Tücher	Carl Roth GmbH + Co.KG	0087.2
乙酸乙酯 ROTISOLV ≥99.8%	Carl Roth GmbH + Co.KG	4442.1	冷冻至 -20 °C
Vortex Genie 2 涡旋振荡器	neoLab	7-0092
1.5 mL 短螺纹小瓶用 0.1 mL 微量插入管，31 x 6 mm，透明玻璃，一级水解玻璃，尖端长 15 mm	La-Pha-Pack	06090357
1.5 mL 短螺纹小瓶用螺口盖，带孔，红色橡胶/聚四氟乙烯隔垫， 硬度 45° shore A，厚度 1.0 mm	La-Pha-Pack	9151819
烷烃标准溶液 C8-C20	Sigma-Aldrich	04070
烷烃标准溶液 C21-C40	Sigma-Aldrich	04071
正己烷 SupraSolv	Merck	104371
气相色谱自动进样器，例如 MPS2XL-Twister	Gerstel
Agilent 气相色谱仪 6890 N	Agilent
鹅颈不分流衬管	Restek	22406
氦气 (5.0 - F50)	Messer	102532501
GC 毛细管柱 HP-5MS UI 30 m × 0.25 mm × 0.25 µm	Agilent	19091S-433UI
Agilent 质量选择性检测器 5975B	Agilent
MSD ChemStation 数据分析应用软件	Agilent
MetaboliteDetector 软件 (3.1.Lisa20170127Ra-Linux)	Hiller K		下载地址：http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
MetaboliteDetector 校准库	Hiller K		下载地址：http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
NIST 谱库的 MD 转换工具	Hiller K		下载地址：http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10