双链DNA断裂的修复是一个动态过程，不仅需要在断裂位点形成修复复合物，还要求在损伤被处理后对这些复合物进行解聚。本文中，我们采用免疫荧光显微技术，针对瞬时性和持久性双链断裂，作为解析基因组维持机制的工具。
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方法文章
通过免疫荧光显微镜表征瞬时性和持久性DNA双链断裂中的DNA修复过程
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
DNA 双链断裂（DSBs）的修复是一个高度协调的过程，需要多蛋白修复复合物的形成与解聚。该过程受到多种蛋白的调控，这些蛋白促进其他蛋白与损伤位点的结合或解离。很大程度上得益于对大量蛋白质文库进行功能筛选的能力，目前对双链 DNA 断裂修复所必需的基因有了更深入的认识。通常，基因敲除或化学抑制剂筛选通过检测毒性增加来识别参与修复过程的蛋白，以此作为该蛋白参与 DSB 修复的标志。尽管这种方法有助于发现参与维持基因组完整性的新细胞蛋白，但功能分析仍需进一步确定目标蛋白是否促进修复复合物的定位、形成或解聚。
通过免疫荧光显微镜可轻易检测到修复蛋白在细胞核内形成明显的焦点聚集。因此，可在诱导双链DNA断裂后的不同代表性时间点观察这些核内焦点，从而评估这些蛋白在DNA损伤位点的结合与解离情况。该方法还可用于鉴定修复因子蛋白的错误定位，前提是修复缺陷并非同时伴随修复延迟不完全的情况。在此情形下，可通过在细胞中表达一种罕见切割的内切核酸酶（例如，I-SceI），而该酶的识别位点已整合至细胞基因组中，从而人为构建持久存在的双链DNA断裂。由于准确修复会重新引入该酶的识别位点，导致再次发生切割，因此所产生的损伤极难彻底修复。这样一来，不同修复动力学的差异被消除。如果修复复合物未能形成，则表明蛋白定位受阻。本实验方案描述了识别修复动力学变化以及修复蛋白定位所需的方法学。
引言
每天，人体内的每个细胞都会遭受约 10,000 个 DNA 损伤1。这种持续存在的威胁使我们面临突变、癌变以及细胞死亡的风险。为了维护基因组的完整性，哺乳动物细胞在进化过程中形成了一套复杂的蛋白质相互作用和修饰机制来应对 DNA 损伤。这一反应被组织成多个通路，统称为 DNA 损伤应答（DNA damage response, DDR）2,3。DDR 的特征是在 DNA 损伤位点时空协调地富集 DNA 修复蛋白。DDR 常常会诱导细胞周期阻滞，以防止在受损 DNA 复制过程中造成损伤的传播或加剧2,4,5。反过来，在 DNA 修复完成后，细胞也需要通过解离修复复合物来解除细胞周期阻滞，以维持细胞的存活能力。
在各种类型的DNA损伤中，双链断裂（DSB）是最具危害性的。若未能修复DSB，可能导致染色体重排或大规模缺失，例如整条染色体臂的丢失。DSB的修复分为两条通路6,7,
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方案
请注意，本实验方案适用于含有 I-SceI 识别位点的 U2OS 细胞18细胞不必须为U2OS，但必须含有I-SceI位点。该方案可能需要进行调整（例如，接种的细胞数量和培养时间）根据所使用的细胞类型而定。
1. 定义 DSB 修复复合物形成的动力学
- 在10 cm的组织培养皿中培养U20S-DRGFP细胞，直至细胞融合度达到85–90%。
- 吸去培养基，在室温（RT）下加入3 mL EDTA孵育2分钟。
- 用1 mL胰蛋白酶替代EDTA，于37 °C孵育5分钟。在显微镜下观察，确保细胞已从培养板表面脱落。加入5 mL含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）以中和胰蛋白酶。
- 使用血细胞计数板和台盼蓝排染法测定该悬液中细胞的浓度。
- 接种 6 × 103 细胞/孔，置于200 µL玻璃底96孔板中。或者，接种4 x 106 8 mL 培养基于 10 cm 培养皿中的 12 mm 盖玻片上培养细胞。
注意：每个孔或盖玻片代表一个单独的时间点，包括对照组。 - 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下过夜培养细胞2.
- 诱导DSB ....
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结果
图1 展示了使用 ImageJ 进行最大值/焦点定量分析时正确噪声 Discrimination 的选择。左侧面板为 DAPI 与目的修复蛋白的合并图像。 图1A 显示90的噪声区分度，并标记出正确的焦点数量。在定量过程中，位于边缘的细胞核（以粉红色箭头指示）以及细胞核外的焦点（以黄色箭头指示）不计入统计。 图1B 显示低噪声容限为50，核外和核内均识别出多个极大值。 图1C 显示出高达220的高噪声耐受性。仅检测到一个焦点（白色箭头）。为了使读者了解“阳性”和“阴性”结果的表现，我们还汇总了代表性结果 图2具体而言， 图 2A 显示了γ-H2AX焦点（绿色）与目的修复蛋白（红色）之间.......
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讨论
DNA损伤修复的研究，尤其是双链DNA断裂的修复，是一个活跃的研究领域，因其影响范围从肿瘤发生到基础生物学6,20。本文详细描述了一种方法，可准确解析RAD51和γ-H2AX蛋白在通过同源重组（HR）修复双链断裂（DSBs）过程中的作用。展望未来，该方法可用于阐明修复蛋白在DSBs位点的其他功能14。通过比较对照细胞与目标蛋白敲除细胞中修复动力学以及修复机器在I-SceI诱导的DSBs位点的招募情况，可明确该蛋白在修复因子向DSBs招募、定位及最终修复过程中的作用。
与常用方法相比，可视化修复动力学具有多项优势。通常，修复过程仅在单个时间点进行检测，无法反映修复复合物动态组装与解离的全过程。观察从初始激活到完全修复的整个过程，可确保不会将修复延迟误判为完全抑制；反之，也可避免将无法关闭的修复反应误认为是正常或过度激活。这些改进主要基于对现有方法的应用优化，而利用罕见切割内切酶诱导持久性DNA双链断裂（DSB）则是一种新.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢堪萨斯州立大学兽医学院资助的共聚焦显微镜核心实验室的Joel Sanneman和Philine Wangemann博士对本技术开发工作的支持。pCBASceI由Maria Jasin惠赠（Addgene质粒# 26477）30。U2OS DR-GFP细胞由Maria Jasin惠赠18。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 12 mm 盖玻片 | VWR | 89015-725 | |
| 16% 多聚甲醛（PFA） | 赛默飞世尔科技 | 28908 | |
| 24孔板 | VWR | 82050-892 | |
| 96孔玻璃底板 | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| 抗-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| 抗 Rad51（D4B10） | 细胞信号技术 | 8875S | |
| ImageJ 的 Bio-formats 插件 | 美国国立卫生研究院（NIH） | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | 赛默飞世尔科技 | D1306 | |
| DMEM，高糖 | 赛默飞世尔科技 | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| 胎牛血清（FBS） | VWR | 89510-194 | |
| 山羊抗兔IgG Alexa594 | 赛默飞世尔科技 | A-11012 | |
| 过氧化氢 | sigma-奥德里奇 | 216763-100ML | |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院（NIH） | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI 表达载体 | Addgene | 26477 | |
| 指甲油 - 快干型 | Sally 和 Hansen | 清晰快速（103） | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂 | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect 转染试剂 | 赛默飞世尔科技 | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
参考文献
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
- Ciccia, A., Elledge, S. J.
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重印与许可
