通过免疫荧光显微镜表征瞬时性和持久性DNA双链断裂中的DNA修复过程

摘要

双链DNA断裂的修复是一个动态过程，不仅需要在断裂位点形成修复复合物，还要求在损伤被处理后对这些复合物进行解聚。本文中，我们采用免疫荧光显微技术，针对瞬时性和持久性双链断裂，作为解析基因组维持机制的工具。

摘要

DNA 双链断裂（DSBs）的修复是一个高度协调的过程，需要多蛋白修复复合物的形成与解聚。该过程受到多种蛋白的调控，这些蛋白促进其他蛋白与损伤位点的结合或解离。很大程度上得益于对大量蛋白质文库进行功能筛选的能力，目前对双链 DNA 断裂修复所必需的基因有了更深入的认识。通常，基因敲除或化学抑制剂筛选通过检测毒性增加来识别参与修复过程的蛋白，以此作为该蛋白参与 DSB 修复的标志。尽管这种方法有助于发现参与维持基因组完整性的新细胞蛋白，但功能分析仍需进一步确定目标蛋白是否促进修复复合物的定位、形成或解聚。

通过免疫荧光显微镜可轻易检测到修复蛋白在细胞核内形成明显的焦点聚集。因此，可在诱导双链DNA断裂后的不同代表性时间点观察这些核内焦点，从而评估这些蛋白在DNA损伤位点的结合与解离情况。该方法还可用于鉴定修复因子蛋白的错误定位，前提是修复缺陷并非同时伴随修复延迟不完全的情况。在此情形下，可通过在细胞中表达一种罕见切割的内切核酸酶（例如，I-SceI），而该酶的识别位点已整合至细胞基因组中，从而人为构建持久存在的双链DNA断裂。由于准确修复会重新引入该酶的识别位点，导致再次发生切割，因此所产生的损伤极难彻底修复。这样一来，不同修复动力学的差异被消除。如果修复复合物未能形成，则表明蛋白定位受阻。本实验方案描述了识别修复动力学变化以及修复蛋白定位所需的方法学。

引言

每天，人体内的每个细胞都会遭受约 10,000 个 DNA 损伤¹。这种持续存在的威胁使我们面临突变、癌变以及细胞死亡的风险。为了维护基因组的完整性，哺乳动物细胞在进化过程中形成了一套复杂的蛋白质相互作用和修饰机制来应对 DNA 损伤。这一反应被组织成多个通路，统称为 DNA 损伤应答（DNA damage response, DDR）^2,3。DDR 的特征是在 DNA 损伤位点时空协调地富集 DNA 修复蛋白。DDR 常常会诱导细胞周期阻滞，以防止在受损 DNA 复制过程中造成损伤的传播或加剧^2,4,5。反过来，在 DNA 修复完成后，细胞也需要通过解离修复复合物来解除细胞周期阻滞，以维持细胞的存活能力。

在各种类型的DNA损伤中，双链断裂（DSB）是最具危害性的。若未能修复DSB，可能导致染色体重排或大规模缺失，例如整条染色体臂的丢失。DSB的修复分为两条通路^6,7,8。同源重组（HR）需要姐妹染色体作为DNA模板，因此仅限于细胞周期的晚S期和G2/M期^9,10。非同源末端连接（NHEJ）则无此限制，但在修复DSB时可能引起小片段的缺失^11,12。

DNA双链断裂（DSB）修复以及DNA损伤应答（DDR）整体是当前研究的热点领域。尽管这些通路在概念上可被划分为相互独立的途径，但实际上存在大量功能冗余。事实上，许多蛋白质（例如BRCA1、BRCA2和RPA复合物）参与了多个修复通路^13,14,15,16。某一通路对损伤位点的修复，可能产生需要由另一通路进一步修复的损伤中间产物¹⁴。这些通路之间相互交织，加之其复杂的功能——即在精确的时间内将正确的蛋白质招募到特定位置——需要一个多层级的调控机制来协调完成。

最近的一份报告通过证明修复复合物的形成、解聚和定位可分别受到独立影响，揭示了DNA损伤应答（DDR）的复杂性¹⁷。本实验方案的总体目标是明确解析细胞修复DNA双链断裂（DSB）的能力。通过免疫荧光显微技术，可在诱导DSB后具有代表性的多个时间点，观察修复蛋白在损伤位点的聚集情况。

该技术相较于常用方法具有多项优势。通常情况下，DNA修复研究仅在单个时间点进行观察，无法反映修复复合物动态组装与解离的全过程。通过观察从初始激活到完全修复结束的整个修复过程，可确保不会将修复延迟误判为完全抑制；反之，也可确保不会将无法失活的修复反应错误地识别为正常或过度激活。

然而，通过该方法可能难以明确区分蛋白质复合物形成延迟与修复蛋白的错误定位。为了确定修复蛋白是发生错误定位还是仅在其定位过程中出现延迟，可通过酶切细胞DNA的方式引入一个"持久存在"的双链断裂（DSB）。该损伤在每次被修复后都会被重新切割，从而形成一个明显的大型核内修复焦点，并消除修复蛋白招募过程中的时间限制。这一目标可通过改进现有方法实现，即利用一种罕见切割的内切酶（e.g.，I-SceI）来诱导持久性DSB。DSB的长期存在使得通过免疫荧光显微镜观察难以检测的修复蛋白成为可能。其丰度的增加也有助于改善因抗体质量不佳而导致检测困难的情况，这一特性在发现功能尚未充分研究的蛋白参与DNA修复时尤为有用。

值得注意的是，我们提供了免费图像处理与分析软件（例如，ImageJ）的详细使用说明。这消除了图像分析中的主要经济障碍，使更广泛的受众能够开展DNA损伤修复的研究。

方案

请注意，本实验方案适用于含有 I-SceI 识别位点的 U2OS 细胞¹⁸细胞不必须为U2OS，但必须含有I-SceI位点。该方案可能需要进行调整（例如，接种的细胞数量和培养时间）根据所使用的细胞类型而定。

1. 定义 DSB 修复复合物形成的动力学

1. 在10 cm的组织培养皿中培养U20S-DRGFP细胞，直至细胞融合度达到85–90%。
2. 吸去培养基，在室温（RT）下加入3 mL EDTA孵育2分钟。
3. 用1 mL胰蛋白酶替代EDTA，于37 °C孵育5分钟。在显微镜下观察，确保细胞已从培养板表面脱落。加入5 mL含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）以中和胰蛋白酶。
4. 使用血细胞计数板和台盼蓝排染法测定该悬液中细胞的浓度。
5. 接种 6 × 10³ 细胞/孔，置于200 µL玻璃底96孔板中。或者，接种4 x 10⁶ 8 mL 培养基于 10 cm 培养皿中的 12 mm 盖玻片上培养细胞。
   注意：每个孔或盖玻片代表一个单独的时间点，包括对照组。
6. 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下过夜培养细胞₂.
7. 诱导DSB
   1. 将 96 孔板/10 cm 培养皿中的培养基更换为 H₂O₂ 用含10% FBS的DMEM稀释至浓度为25 µM，于37 °C孵育1小时。
   2. 用1× PBS洗涤细胞3次，更换为含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的新鲜DMEM培养基。将细胞在37 °C孵育0、1、4、8、24和48小时。确保H的稀释液新鲜配制₂O₂ 每次实验均使用上述材料。
      注意：为避免在 H 阶段杀死细胞₂O₂ 此处使用的浓度应确保损伤剂量足够低，以使大多数细胞避免发生凋亡和衰老。观察细胞的恢复过程至关重要。这可通过检测一系列剂量下的细胞敏感性来最佳实现。进行 MTT 实验或其他细胞活力实验，以确定可使用的最低过氧化氢浓度。
8. 固定与透化细胞
   1. 用1×PBS洗涤细胞3次。每个时间点从10 cm培养皿中取出一张盖玻片，放入24孔板的单个孔中用于固定。使用针头和镊子小心取出盖玻片，避免刮伤盖玻片表面的细胞。
   2. 在H处理1小时后的指定时间，用4%多聚甲醛（PFA）孵育15分钟以固定细胞₂O₂ 暴露后新鲜DMEM更换（0、1、4、8、24和48 h）。
   3. 用 PBS 清洗固定后的盖玻片 3 次。使用 0.5% 非离子型去垢剂（溶于 1x PBS）对细胞进行透化处理，在室温孵育 15 分钟，随后用 PBS 洗涤 3 次。
      注意：透化处理后，盖玻片可在 4 °C 的 PBS 中保存至少一周。
9. 修复复合体可视化
   1. 在室温下，用含3%牛血清白蛋白（BSA）和0.1%非离子型去垢剂的1×PBS溶液（3% BSA溶液）封闭96孔板/盖玻片，孵育1小时。
   2. 在室温下，用含3% BSA的溶液按制造商说明书稀释针对目标修复蛋白的一抗，孵育1小时，随后用1×PBS洗涤3次。
   3. 将96孔板或盖玻片与按照制造商说明书用3% BSA溶液稀释的二抗共同孵育。确认二抗的荧光染料不存在重叠的激发光或发射光光谱。
   4. 用 PBS 洗涤细胞 3 次后，加入按照制造商说明书用 1×PBS 稀释的 DAPI，室温孵育 5 分钟。
   5. 用一滴封片剂将盖玻片封固在载玻片上，确保细胞面朝下。小心按压盖玻片，并用擦纸吸去多余的封片剂。
   6. 用快干透明指甲油密封盖玻片，并确保盖玻片与载玻片完全密封。
   7. 在采集其他通道（来自目的DNA修复基因信号）的图像之前，应先聚焦DAPI通道以获取共聚焦显微镜图像，以避免实验引入偏差。
   8. 或者，可以通过对目标区域进行Z轴层扫，并将图像压缩至单一平面，以观察所有可检测到的焦点。
      注意：如果在选定的时间点未观察到双链断裂（DSB）的修复或目标蛋白，应通过在双链断裂诱导后选择较宽范围的时间点（0–48 小时）来确定 DSB 的修复时间。具体关注的时间点将因 DSB 诱导方法和目标修复蛋白的不同而有所差异。
10. 使用免费的 ImageJ 软件在免疫荧光显微镜图像中定义细胞核。
    注意：要打开显微镜图像，必须在 ImageJ 中安装 Bio-Formats 插件。
    1. 通过将图像文件拖入 ImageJ 窗口，或通过选择打开共聚焦图像（.czi 或 .tif） "Bio-Formats 导入器" 来自 "插件" ImageJ 中的工具栏
       注意： "Bio-Formats 导入选项" 窗口将出现。
    2. 选择 "拆分通道" 将图像拆分为构成性的 DAPI 图像和荧光图像 "Bio-Formats 导入选项" 窗口
    3. 选择 "彩色的" 在 "颜色选项" 从下拉菜单中选择 "好的" 分别打开DAPI和组蛋白H2AX（H2AX）图像窗口，并选择DAPI图像。
    4. 选择 "图像" 工具栏和 "调整阈值" 选择细胞核的选项。
       注意：A "阈值" 窗口将出现。
    5. 通过滑动底部的滑块来调整图像阈值 "阈值" 将窗口完全移至右侧。调节顶部工具栏，直至细胞核呈现完全红色且轮廓清晰，背景为黑色。切勿选择“应用”。关闭 "调整阈值" 窗口
    6. 选择 "分析" 工具栏和 "分析颗粒" 选项。参见一个 "分析颗粒" 屏幕上出现的窗口。
    7. 输入细胞核的最小尺寸。
       注意：小于输入尺寸的颗粒将不被计为细胞核。
    8. 从 "显示" 下拉菜单，选择 "大纲". 选择 "添加到管理器" 选项。单击 "好的" 打开一个 "ROI 管理器" 窗口。
       注意：细胞核轮廓将在单独的窗口中显示。
    9. 为可选的细胞核分配编号 "ROI 管理器" 窗口
11. 使用 ImageJ 对免疫荧光显微镜图像中的 H2AX 焦点进行定量分析。
    1. 选择 "H2AX" 荧光标记的二抗染色的焦点区域窗口。然后，选择 "过程" 工具栏并选择 "寻找最大值" 在细胞核内寻找焦点。
       注意：A "寻找最大值" 窗口将打开。
    2. 选择 "单点" 选项从 "输出类型" 下拉菜单并选择 "预览点选择" 以可视化最大值/焦点。输入一个 "噪声耐受性" 根据图像的荧光强度而定的值（图1）。检查是否出现带有小黑点的白色窗口。
       注意：这些点代表已检测到的H2AX焦点/最大值。在分析所有图像时，必须保持噪声容差值恒定。噪声容差过低或过高将导致细胞核内显示过多或过少的最大值（焦点），无法准确反映细胞核内焦点的真实情况。
    3. 选择需要进行H2AX焦点定量的细胞核 "ROI 管理器" 窗口。通过勾选来选中所有细胞核 "显示全部" 选项
    4. 选择 "测量" 测量所选细胞核内极大值/焦点的数量。
       注意：最大值/焦点的数量以255的倍数出现， 即，其中一个最大值具有 "RawIntDen" 255（积分密度）读数
    5. 复制 "RawIntDen" 数值并将其粘贴到数据分析软件中。

2. 分析定位至持久性双链DNA断裂位点

1. 按照第1.1和1.2节所述，将细胞接种于96孔板/盖玻片上。
2. 诱导DNA双链断裂
   1. 使用基于脂质的转染试剂，按照制造商的说明将细胞转染I-SceI表达载体。转染后等待24–72小时，以最大化内切酶的表达。通过寻找具有单个大型核内γ-H2AX焦点的细胞，判断转染是否成功。
3. 图像采集
   1. 按照第1.8节所述，对96孔板/盖玻片进行固定、通透、封闭和洗涤。
   2. 将细胞与抗γ-H2AX抗体以及目标修复蛋白的一抗（此处使用抗RAD51的一抗）共同孵育，抗体用3% BSA溶液按制造商说明稀释。
   3. 用1× PBS洗涤96孔板/盖玻片3次。将96孔板/盖玻片与二抗在3% BSA溶液中孵育，二抗按制造商方案稀释。确认二抗的荧光染料激发光谱和发射光谱无重叠。
   4. 识别具有大型核内γ-H2AX焦点的细胞。仅对这些细胞进行拍照，以避免偏差。
4. 分析持久性I-SceI诱导焦点
   1. 通过手动分析持久性焦点，统计具有大型γ-H2AX焦点以及目标修复蛋白共定位焦点的细胞数量。

结果

图1 展示了使用 ImageJ 进行最大值/焦点定量时正确噪声 Discrimination 的选择。左侧面板为 DAPI 与目标修复蛋白的合并图像。 图1A 显示90的噪声 discrimination，并标记出正确的焦点数量。在定量分析过程中，位于边缘的细胞核（以粉红色箭头指示）以及细胞核外的焦点（以黄色箭头指示）不计入统计。 图1B 显示低噪声容限为50，核外和核内均识别出多个极大值。 图1C 显示出高达220的高噪声耐受性。仅检测到一个焦点（白色箭头）。为了使读者了解“阳性”和“阴性”结果的表现，我们还汇总了代表性结果 图2具体而言， 图 2A 显示了γ-H2AX焦点（绿色）与...

讨论

DNA损伤修复的研究，尤其是双链DNA断裂的修复，是一个活跃的研究领域，因其影响范围从肿瘤发生到基础生物学^6,20。本文详细描述了一种方法，可准确解析RAD51和γ-H2AX蛋白在通过同源重组（HR）修复双链断裂（DSBs）过程中的作用。展望未来，该方法可用于阐明修复蛋白在DSBs位点的其他功能¹⁴。通过比较对照细胞与目标蛋白敲除细胞中修复动力学以及修复机器在I-SceI诱导的DSBs位点的招募情况，可明确该蛋白在修复因子向DSBs招募、定位及最终修复过程中的作用。

与常用方法相比，可视化修复动力学具有多项优势。通常，修复过程仅在单个时间点进行检测，无法反映修复复合物动态组装与解离的全过程。观察从初始激活到完全修复的整个过程，可确保不会将修复延迟误判为完全抑制；反之，也可避免将无法关闭的修复反应误认为是正常或过度激活。这些改进主要基于对现有方法的应用优化，而利用罕见切割内切酶诱导持久性DNA双链断裂（DSB）则是一种新...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 mm 盖玻片	VWR	89015-725
16% 多聚甲醛（PFA）	赛默飞世尔科技	28908
24孔板	VWR	82050-892
96孔玻璃底板	Cellvis	P96-1.5H-N
抗-H2AX Alexa488	EMD Millipore	05-636-AF488
抗 Rad51（D4B10）	细胞信号技术	8875S
ImageJ 的 Bio-formats 插件	美国国立卫生研究院（NIH）		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
牛血清白蛋白（BSA）	VWR	97061-416
DAPI	赛默飞世尔科技	D1306
DMEM，高糖	赛默飞世尔科技	12100046
EDTA	Invitrogen	15576-028
胎牛血清（FBS）	VWR	89510-194
山羊抗兔IgG Alexa594	赛默飞世尔科技	A-11012
过氧化氢	sigma-奥德里奇	216763-100ML
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院（NIH）		https://imagej.nih.gov/ij/
I-SceI 表达载体	Addgene	26477
指甲油 - 快干型	Sally 和 Hansen	清晰快速（103）
磷酸盐缓冲液（PBS）	Bio Basic	PD8117
ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂	Life Technologies	P36930
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
胰蛋白酶-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049-500ML
TurboFect 转染试剂	赛默飞世尔科技	R0531
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500