糖尿病小鼠慢性伤口造模方案

摘要

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在糖尿病小鼠模型中，通过在全层皮肤伤口后诱导高水平的氧化应激，使急性伤口发展为慢性伤口。通过使用过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶抑制剂处理伤口，导致皮肤微生物组中存在的细菌愈合受损并形成生物膜。

摘要

慢性伤口是由于参与正常愈合过程的一个或多个复杂的细胞和分子过程调控失常所致。仅在美国，慢性伤口影响约650万人，每年耗费约400亿美元。尽管人们已投入大量努力来理解人类慢性伤口的发生机制，但一些基本问题仍未得到解答。最近，我们开发了一种新型的小鼠糖尿病慢性伤口模型，该模型具有许多人类慢性伤口的特征。利用db/db^-/-小鼠，我们可通过一次性使用过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的特异性抑制剂处理，在伤口形成后立即在伤口组织中诱导高水平的氧化应激（OS），从而产生慢性伤口。这些伤口具有高水平的氧化应激，可自然形成生物膜，处理后20天内完全转为慢性状态，并可持续开放超过60天。这一新型模型具备人类糖尿病慢性伤口的多种特征，因此可显著推动对伤口慢性化机制的基础性理解。这一突破意义重大，因为人类的慢性伤口会给患者带来显著的疼痛与痛苦，若无法解决，可能导致截肢。此外，这些伤口治疗成本高昂且耗时，还会导致患者个人收入的重大损失。通过使用我们的慢性伤口模型推进该领域的研究，有望显著改善数百万受此衰弱性疾病困扰者的医疗保健水平。在本实验方案中，我们详细描述了使急性伤口转为慢性伤口的操作步骤，此前尚无此类方法报道。

引言

伤口愈合涉及复杂且在时间和空间上受到调控的细胞与分子过程，这些过程按顺序并部分重叠地进行，包含多种不同类型的细胞，包括但不限于免疫反应和血管系统¹。皮肤受到损伤后，立即有多种因子和血细胞聚集至伤口部位，启动凝血级联反应以形成血凝块。在实现稳态后，血管扩张，使氧气、营养物质、酶、抗体以及趋化因子进入伤口部位，趋化中性粒细胞至伤口床以清除异物碎片，并分泌蛋白水解酶²。活化的血小板释放多种生长因子，刺激伤口边缘的角质形成细胞，促进其重新上皮化。募集至伤口部位的单核细胞分化为巨噬细胞，吞噬细菌和已死亡的中性粒细胞，并分泌额外因子，以维持角质形成细胞的增殖和促迁移信号。在增殖阶段，随着重新上皮化的持续进行，由成纤维细胞、单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞和内皮细胞组成的新肉芽组织继续组织修复过程²。血管生成通过促进内皮细胞的增殖和迁移而被激活，从而形成新的血管。上皮化以及细胞外基质的重塑构建起抵御外界环境的屏障。随着伤口愈合，肉芽组织逐渐演变为瘢痕，细胞凋亡清除炎症细胞、成纤维细胞和内皮细胞，且不引起额外的组织损伤。成纤维细胞通过重塑细胞外基质的多种组分（如胶原蛋白），增强组织的抗张强度，使新生组织的强度和柔韧性几乎接近未受损皮肤²。

任何偏离这种高度协调的伤口闭合进程的情况都会导致愈合受损和/或形成慢性伤口³。慢性伤口的特征是伤口局部氧化应激增强、慢性炎症、微血管损伤以及胶原基质异常⁴。氧化应激，尤其是在伤口局部，可能延缓伤口闭合过程^2,5。在伤口愈合的第一阶段，当炎症期失去调控时，由于持续有炎症细胞浸润⁵，释放细胞毒性酶、活性氧自由基增加以及炎症介质失控，导致宿主组织遭受严重损伤，并引发细胞死亡^6,7。

在这种具有破坏性的微环境中，形成生物膜的细菌会利用宿主的营养物质，并导致宿主组织的损伤²。由于生物膜由蛋白质、DNA、RNA和多糖组成的水合胞外聚合物构成，寄居其中的细菌对抗生素治疗具有耐受性，且能够逃避免疫系统的先天性和适应性免疫应答，因此这类生物膜难以控制和清除^2,8,9。

研究慢性伤口至关重要，仅在美国，慢性伤口就影响约650万人，每年造成约400亿美元的医疗成本¹⁰。糖尿病患者发生慢性伤口的风险更高，且常需通过截肢来控制感染的扩散。这些患者在截肢后5年内的死亡率高达50%，这与糖尿病的病理生理机制密切相关¹¹。宿主免疫系统与伤口微生物组在伤口愈合过程中的相互作用是当前研究的重要课题，因为若慢性伤口无法得到有效治疗，其后果可能包括截肢甚至死亡¹²。

尽管人们已投入大量努力来理解人类慢性伤口的形成机制，但目前仍不清楚慢性伤口是如何以及为何形成的。在人体上开展研究愈合障碍机制的实验十分困难，伤口愈合专家通常只能见到那些伤口已经持续数周至数月并进入慢性状态的患者。因此，专家无法研究导致伤口发展为慢性的关键异常过程²。目前尚缺乏能够重现人类慢性伤口复杂性的动物模型。在我们的模型建立之前，尚不存在可用于慢性伤口研究的模型。

慢性伤口模型是在瘦素受体存在突变（db/db^-/-）的小鼠中建立的¹³。这些小鼠表现为肥胖、糖尿病，并伴有愈合能力受损，但不会自发形成慢性伤口¹⁴。其血糖水平平均约为200 mg/dL，最高可达400 mg/dL¹⁵。若在伤口形成后立即诱导伤口组织中产生高水平的氧化应激（OS），则伤口将发展为慢性状态¹⁶。db/db^-/-小鼠的伤口通常在20天时被认定为慢性伤口，并可持续开放60天或更长时间。伤口中细菌形成的生物膜在受伤后第3天开始出现；受伤后20天可观察到成熟的生物膜，并持续存在直至伤口闭合。我们在这些小鼠中发现的可形成生物膜的细菌，同样存在于人类糖尿病慢性伤口中。

通过使用两种抗氧化酶抑制剂——过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的抑制剂处理伤口，可诱导产生氧化应激。过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶均具有分解过氧化氢的能力。过氧化氢是一种活性氧，可通过氧化蛋白质、脂质和DNA引起细胞损伤。过氧化氢酶可催化过氧化氢分解为危害较小的氧气和水。3-氨基-1,2,4-三唑（ATZ）通过特异性且共价结合于过氧化氢酶的活性中心，抑制该酶并使其失活^17,18,19. ATZ 已被用于研究氧化应激的影响 体外 和 体内 通过抑制过氧化氢酶^{20,21,22,23,24}谷胱甘肽过氧化物酶通过抗氧化剂谷胱甘肽催化过氧化氢的还原反应，是保护细胞免受氧化应激损伤的重要酶类。²⁵巯基琥珀酸（MSA）通过其巯基与谷胱甘肽过氧化物酶的硒代半胱氨酸活性位点结合，从而抑制该酶并使其失活。²⁶. MSA 已被用于研究氧化应激的影响 体外 和 体内 以及^20,27,28.

这种慢性伤口的新模型是一种强大的研究工具，因为它具有与人类糖尿病性慢性伤口相似的多种特征，包括因氧化应激（OS）增加导致的持续性炎症以及由皮肤微生物组自然形成的生物膜。这些伤口表现出表皮-真皮相互作用受损、基质沉积异常、血管生成能力差以及血管结构损伤。雄性和雌性小鼠均可形成慢性伤口，因此两种性别均可用于慢性伤口的研究。因此，该慢性伤口模型可显著促进人们对慢性伤口发生机制的基础性理解。利用此慢性伤口模型，可以回答关于慢性状态如何通过受损的伤口愈合生理过程及宿主微生物组的共同作用而启动和维持等基本科学问题。

方案

所有实验均按照联邦法规以及加州大学的政策和程序进行，并已获得加州大学河滨分校动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 动物

1. 使用糖尿病和肥胖的 B6.BKS(D)-Lepr^db/J 小鼠建立慢性伤口模型。可选择购买杂合子用于繁育，或直接购买纯合子用于实验。
2. 将杂合子雄鼠与雌鼠交配以产生后代。从统计学上看，仅四分之一的仔鼠会发育为糖尿病和肥胖型（db/db^-/-）。
3. 仔鼠出生后 3 周断奶，并将 db/db^-/- 小鼠与其同窝仔鼠共同饲养。出生后 5 周时，将 db/db^-/- 小鼠从同窝仔鼠中分离，与其他 db/db^-/- 小鼠同笼饲养，直至其达到 5–6 个月龄，可用于慢性伤口模型。在此期间，可形成成熟且复杂的皮肤微生物组。
   注意：db/db^-/- 小鼠在出生后 3–5 周龄期间可通过外观与同窝仔鼠明显区分。db/db^-/- 小鼠表现为肥胖和糖尿病，体型显著大于野生型和杂合子同窝仔鼠，外形更圆胖，腹部可能略呈粉红色，臀部更宽大。手术前应确认其体重增加。此外，可通过检测血液中高水平的葡萄糖以及对小鼠进行基因分型，以确认其瘦素受体基因存在突变。

2. 动物饲养设施与饲养管理

1. 将 db/db^-/- 小鼠饲养在普通动物房（非屏障/无特定病原体设施）中，以便在 db/db^-/- 小鼠皮肤上建立正常菌群。为了特异性模拟人类慢性伤口患者的情况，无需采取特殊措施防止病原体暴露。
2. 使用微型隔离器盖保护鼠笼，以尽量减少动物房内感染的传播。每周更换两次笼具，并添加新垫料，使用普通动物房饲料喂养小鼠。垫料和饲料均无需高压灭菌。
3. 将室温设定在 21 至 24 °C 之间，根据季节略有波动。湿度因气候和地理位置而异，范围在 19% 至 70% 之间。

3. 慢性伤口形成的要求

1. 用于慢性伤口模型构建的小鼠应为表型肥胖、糖尿病且年龄至少为5-6个月的雄性和雌性小鼠。这些小鼠的体重应在40-80 g之间，平均约为60 g。
2. 不应使用虽被认定为肥胖但体重低于50 g的小鼠。
   注：本方案中提及的所有小鼠均符合上述标准，除非另有说明。

4. 剃毛与脱毛乳液的使用

注意：在造伤前去除小鼠背部不需要的毛发。以下操作在手术前一天对未麻醉的活体 db/db^-/- 小鼠进行。需采取预防措施，避免对动物造成应激和伤害。

1. 剃毛
   1. 将小鼠放置在干净的表面上，用拇指和食指捏住小鼠尾部基部以固定其位置。小鼠可能会跳跃或突然移动；若发生此情况，应迅速反应并收回电推剪，以防造成伤害。
   2. 使用电推剪剃除小鼠体毛（图1A、1B）。将刀头与小鼠皮肤保持平行，从颈部至尾部剃除整个背部的毛发，包括尾部周围区域，以便留出足够大的表面积用于贴敷透明薄膜敷料（见材料表）。为达到最高效的剃毛效果，应轻柔地逆着毛发生长方向推动刀头（图1B）。
      1. 切勿将刀头用力压入皮肤，以免造成皮肤挫伤或割伤。
2. 涂抹脱毛膏
   注：使用脱毛膏以获得非常光滑的皮肤，确保透明敷料能够牢固粘附。
   1. 为防止化学灼伤，用浸湿的纸巾轻轻按压已剃毛的皮肤，施加适当压力使被剪短的毛发紧贴皮肤并充分湿润。
   2. 在皮肤湿润状态下，取少量脱毛膏（见材料表），轻柔涂抹于小鼠皮肤上15–20秒（图1C、1D）。将脱毛膏完全覆盖所有已剪短毛发的区域。若小鼠体型较大，可适量增加脱毛膏用量。
   3. 切勿将脱毛膏涂抹于小鼠耳朵、尾巴或面部附近区域。若脱毛膏不慎接触耳朵或尾巴，可用湿纸巾擦拭直至冲洗干净。若脱毛膏接触面部，应立即用流动自来水或去离子水冲洗小鼠，以防眼睛、鼻子和口腔受到损伤。
   4. 涂抹后，让脱毛膏与毛发继续反应20–45秒。
   5. 冲洗前，用戴手套的手指或薄金属刮刀在多个部位轻拭皮肤以去除部分脱毛膏，检查脱毛反应是否完成（图1E）。若皮肤呈粉红色且无黑色毛发残留，则表明反应已完成。建议在冲洗前快速确认毛发是否已完全去除，避免过早冲洗导致需重复使用脱毛膏。
3. 冲洗
   注：确认脱毛反应完成后，应使用流动自来水或去离子水清洗小鼠，以去除残留脱毛膏并防止化学灼伤。
   1. 将小鼠置于左手戴手套的手掌上，用左手拇指将尾部基部压在掌心，防止小鼠移动。其余左手手指应并拢伸直，以防小鼠咬伤。
   2. 调整小鼠位置，使其头部区域避开水流，温水应从头部后方流下，仅接触背部区域。用右手戴手套的手轻柔而迅速地揉搓小鼠背部，以彻底清洗脱毛膏。 
   3. 待小鼠皮肤上脱毛膏完全清除后，立即用纸巾快速擦拭小鼠以吸干大部分水分（图1F）。
4. 剃毛与脱毛后的护理
   1. 用湿纸巾检查并清洁可能残留在耳朵和尾巴上的脱毛膏。
   2. 将小鼠放回单独的笼子中，并将笼子置于加热垫（40–45 °C）上约30分钟。小鼠应在数分钟内恢复正常行为，如四处活动和自我理毛。
   3. 在整个实验期间，每只小鼠均应单独饲养。由于小鼠皮肤已失去毛发保护，易被其他小鼠抓伤或咬伤。
   4. 由于脱毛膏可能产生轻微刺激作用，干扰或改变伤口愈合过程，建议在手术前等待18–24小时，使小鼠皮肤恢复平静，并适应背部无毛状态。
5. 去除深色皮肤区域的毛发
   注：部分db/db^-/-小鼠皮肤可能出现深色斑块，这些区域的毛发生长速度和强度可能高于无斑块区域（图2A）。这些皮肤区域颜色较深是由于处于中晚期生长期（anagen）的毛囊和/或色素失禁所致^29,30。
   1. 若发现深色斑块，仅在这些区域再次涂抹脱毛膏，并重复步骤4.2和4.3（图2B、2C）。
      注：在整个实验过程中，这些深色皮肤区域的毛发生长速度较快，必要时应每3–5天修剪一次毛发。伤口预定位置附近存在一两处斑块可接受。若小鼠背部被此类深色斑块大面积覆盖，则不应将其用于慢性伤口模型。

5. 试剂配制

注意：通过使用过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的特异性抑制剂——3-氨基-1,2,4-三唑（ATZ）和巯基琥珀酸（MSA）处理，可在db/db^-/-小鼠中建立慢性伤口模型¹⁶。以下操作步骤根据小鼠体重详细说明镇痛剂及抑制剂的剂量与给药方法。

1. 手术前约30分钟，以无菌PBS配制，按0.05 mg/kg剂量经腹腔注射镇痛剂Buprenex；对于60 g小鼠，注射体积约为120 µL。术后6小时追加一次给药，必要时可额外给予一剂。
2. 手术前约20分钟，以无菌PBS配制，按1 g/kg剂量经腹腔注射ATZ；对于60 g小鼠，注射体积为480 µL，其中一半体积注射至腹部左侧，另一半注射至右侧。
3. 术后10分钟内，将MSA以150 mg/kg剂量溶于无菌PBS中，局部施用于透明敷料与伤口组织之间的创面；对于60 g小鼠，给药体积为60 µL。

6. 手术

注意：慢性伤口模型的成功依赖于非无菌条件。这些小鼠并非无菌动物，饲养于常规动物房中。皮肤中存在的细菌微生物组对于使用抗氧化酶抑制剂处理后慢性伤口的后续启动和发展至关重要。因此，不建议进行传统的术前手术部位准备。

1. 腹腔注射
   1. 将小鼠固定在笼架的倾斜部分，用手握住尾巴，使小鼠舒适站立，头部低于身体。这可确保我们尽量将内脏器官远离注射部位。 
   2. 将针头插入腹部右下象限，以避免刺入膀胱或其他腹腔器官。 
   3. 注射前回抽针芯确认位置。 
2. 处理与麻醉
   1. 按照步骤5.1和5.2所述，在手术前30分钟给予布托啡诺（Buprenex），20分钟前给予ATZ。
   2. 将小鼠置于一个小型塑料容器中，并将其放在加热垫上（如图3A所示），持续约15–20分钟。手术前提供热支持可防止潜在的死亡风险。
   3. 在小容器顶部覆盖一张纸巾或纸巾以更好地保持热量。随着温度升高，小鼠应逐渐安静下来。图3B显示了手术所需材料。
   4. 若使用开放式系统，将小鼠放入连接至化学通风橱中异氟烷蒸发器的密闭容器内。
   5. 在开放式系统中，以2–3.5 L/min的气流速率给予5%异氟烷，持续1–2分钟。持续监测小鼠状态。
      1. 一旦小鼠失去意识或不再活动，将其放置于白色手术垫上，并为其头部连接固定于蒸发器的鼻罩，以便在手术期间持续给予异氟烷。
   6. 在开放式系统中，手术期间以相同气流速率给予2–3%异氟烷，并根据需要调节异氟烷流量以维持麻醉深度。
   7. 尽量减少手术期间异氟烷的浓度和暴露时间。db/db^-/-小鼠对麻醉极为敏感，因此应尽可能减少异氟烷暴露。如果小鼠在5%异氟烷下2分钟后仍存在反应，固定鼻罩后可短暂给予3–5%异氟烷15–30秒，再开始手术。
      1. 在造伤前确认麻醉效果。麻醉深度通过物理刺激（如强力夹趾）无反应来确认。吸入麻醉总时间少于5分钟，因此无需在眼部涂抹兽用眼膏。
3. 造伤
   1. 用70%乙醇喷洒纸巾或使用临床乙醇擦拭巾清洁小鼠背部，以清洁伤口区域。应清洁皮肤表面，以便透明敷料能够牢固粘附，因为垫料、食物或皮肤上的灰尘可能影响敷料的粘附性（图4A）。不要过度擦拭，以免杀死皮肤表面的细菌。
   2. 确定伤口位置。最佳造伤部位为小鼠背部中央区域，避开色素沉着较深的皮肤区域。
      注意：根据经验，这些小鼠仅能耐受一个伤口的负担。
   3. 使用7 mm皮肤活检打孔器、镊子和手术剪在30–45秒内创建伤口。轻压活检打孔器至目标位置，并轻轻旋转，深度以刚好在皮肤上留下轻微压痕为宜（图4B）。用镊子提起打孔中心部位，再用手术剪沿边缘剪除标记区域的皮肤（图4C–4E）。
   4. 用一片透明薄膜敷料（6 cm × 3.5 cm）的一半牢固覆盖伤口。
   5. 停止向小鼠输送2%异氟烷（图4F）。

7. 术后治疗与恢复

1. 在完成手术并按照步骤5.3所述贴上透明敷料后，给予MSA治疗。将MSA滴加至敷料下的伤口区域。
2. 将小鼠放回加热垫上的小容器中，持续30分钟以促进恢复。待小鼠体温回升后，将其放回笼中。异氟烷的麻醉效果是暂时性的，之后小鼠应很快恢复活动能力。
3. 在小鼠恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得让其无人看管，也不得将其送回动物房。
   注意：对这些小鼠进行操作时，首选麻醉剂为异氟烷，正是由于其起效迅速且麻醉后苏醒较快。
   1. 术后小鼠应单独饲养，以避免一只小鼠干扰另一只小鼠的慢性伤口。如上所述，小鼠在完全恢复前不得返回动物房。
4. 术后6小时给予第二剂布托啡诺（Buprenex）。
5. 术后前48小时内需密切观察小鼠状况。
   注意：手术结合抑制剂以建立慢性伤口的过程对已患有糖尿病和肥胖症的小鼠而言具有极大的应激性。若小鼠能存活过术后最初几天，通常即可完成整个实验周期。

8. 数据采集、生存策略、伤口处理后的小鼠管理及其他提示

1. 数据采集
   1. 手术后应尽早拍照。生物膜可在伤口形成后5至10天内观察到，最早可在第3天出现。
   2. 若分析重点为细菌，可用无菌棉签在伤口周围轻压滚动10–15秒。将棉签置于适当的冷冻保存液中用于培养，或不加任何保存液直接干燥后用于无需培养的测序分析，并于-80 °C保存。使用无菌金属刮刀收集胞外聚合物质至微量离心管中，分析前于-80 °C保存。
   3. 在采集生物膜或拍照过程中，不要对小鼠实施麻醉。在这些操作期间，可在小鼠前方放置食物以安抚其情绪并防止其逃窜。大多数小鼠会爬到食物上方，坐在上面且保持不动。
2. 若小鼠活动不当或敷料使用不当，可能引发继发感染或意外的慢性伤口或溃疡，因此需定期检查小鼠活动情况及腹侧是否有溃烂。若笼具未频繁更换，皮肤与潮湿垫料之间的摩擦（db/db^-/-小鼠多尿）可能损伤皮肤。
   注意：敷料下积液可能导致粘合剂失去黏性，进而引起液体渗漏。死皮细胞、垫料和粪便可能附着于皮肤并硬化。皮肤上形成的这些干燥斑块和聚集体应及时清除，以防继发感染。
3. 若小鼠站立或用后肢坐立，应将其转移至食物和饮水位置较低的笼具中。若笼内食物和饮水位置过高，小鼠可能通过站立或用后肢坐立来取食。大多数小鼠在术前能正常进食饮水的，术后通常也不会有问题，但部分小鼠可能会翻转至背部朝上。这些被称为"翻转者"的小鼠可能难以自行翻身，需给予协助并加强监测。
4. 若皮肤无碎屑、脱屑或毛发，可将透明敷料保留最多20天。若皮肤出现上述任何情况，应移除旧敷料并更换新的敷料。
   1. 移除敷料时，轻轻捏住头部正后方的皮肤，然后以平稳动作将敷料从头部方向拉离。
   2. 为确保敷料牢固贴合，应尽量使小鼠保持静止。务必确保皮肤清洁，无脱屑的死皮细胞、垫料粉尘或食物残渣。将敷料贴合于伤口周围皮肤后，按压固定。
   3. 若在小鼠前方放置食物仍无法限制其活动，可将小鼠置于金属笼网上方。待小鼠抓住笼条后，尽可能靠近身体处握住其尾部，并施加最小力度牵拉。当小鼠向前移动时，背部会伸展并变直，此时便于敷料贴合；应在此刻牢固地贴上敷料。
   4. 切勿重复使用旧敷料。为获得最佳黏附效果，始终应使用新敷料贴于背部。

结果

图5展示了一个未经抑制剂治疗而趋向愈合的伤口示例，以及一个经抑制剂治疗后趋向慢性化的伤口示例。慢性伤口上保留了透明敷料，以便观察生物膜和液体积聚情况。

慢性伤口的形成在6小时之内即开始，伤口边缘因氧化应激而发生明显改变。组织学证据显示，该伤口边缘组织已发生坏死，无法参与伤口愈合过程。伤口中形成生物膜的细菌随后可利用这些坏死组织作为营养来源和结构组分，以生成生物膜。慢性伤口是指伤口持续开放，且较初始伤口扩大，含有生物膜（即在人类慢性伤口中发现的胞外多糖基质及致病菌），并根据生物膜的数量和成分不同，需数月甚至数年才能愈合。在慢性伤口模型中，慢性状态的完全建立定义为术后>20天，因为未使用抑制剂处理的伤口将在该时间内闭合（图5）。通常情况下，愈合过程需要>60天，具体时间取决于伤口中主要存在的致病菌种类。当更具侵袭性的生物膜形成...

讨论

在小鼠身上建立慢性伤口后，该模型可用于研究与慢性化启动相关的受损伤口愈合过程。该模型还可用于测试多种化学物质和药物在逆转慢性伤口发展及促进伤口闭合与愈合方面的有效性。可研究慢性化发生后的不同时间点：例如，创伤后第1至5天用于研究慢性化的早期阶段，第20天及以后用于研究完全形成的慢性伤口。

慢性伤口模型也是研究伤口愈合各个方面以及诸如生物负荷和恶病质等并发症的有力模型。在此模型中可研究的慢性伤口特征之一便是生物负荷，因为生物负荷同样影响人类的慢性伤口。我们的操作流程和动物使用方案明确指出了需要监测的症状以及具体的监测时间表。根据IACUC批准的标准被判定为病态的动物将被实施安乐死，以避免其遭受严重痛苦。此外，当出现特定症状时，还会咨询校园兽医和动物健康技术人员，以获得关于评估标准的支持性指导。

方案中的关键步骤包括饲养 db/db^-/- 在常规动物房中饲养小鼠，使用脱毛膏去除毛发，并在给予异氟烷前进行加热处理。慢性伤口模型中慢性伤口的形成依赖于非无菌的环境与操作条件。这些...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B6.BKS(D)-Leprdb/ J	杰克逊实验室	00697	可提供纯合子和杂合子
含舒缓芦荟和羊毛脂的Nair脱毛乳液	Nair		一种化学脱毛剂
布托啡诺（盐酸布托啡诺）	亨利·斯坦动物健康	059122	0.3 mg/ml，III类
3-氨基-1,2,4-三唑（ATZ）	TCI	A0432
巯基丁二酸（MSA）	Aldrich	88460
磷酸盐缓冲液（PBS）			高压灭菌消毒的
异氟烷	Henry Schein 动物健康	029405	NDC 11695-6776-2
氧气			储液罐必须与汽化系统兼容
异氟烷蒸发器	JA Baulch & Associates
Wahl 理发剪	Wahl		锂离子
Acu Punch 7mm 皮肤活检穿孔器	Acuderm 公司	P750
Tegaderm	3M	参考文献：1624W	透明薄膜敷料（6 cm × 7 cm）
加热垫	Conair		湿润干热敷垫
胰岛素注射器	BD	329461	0.35 mm（28G）× 12.7 mm（1/2）")
70% 乙醇
Kimwipes
镊子
锋利的手术剪
薄金属刮刀
导管
小鼠鼻锥
手套
小型塑料容器