糖尿病小鼠慢性伤口造模方案

摘要

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在糖尿病小鼠模型中，通过在全层皮肤伤口后诱导高水平的氧化应激，使急性伤口发展为慢性伤口。通过使用过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶抑制剂处理伤口，导致皮肤微生物组中存在的细菌愈合受损并形成生物膜。

摘要

慢性伤口是由于参与正常愈合过程的一个或多个复杂的细胞和分子过程调控失常所致。仅在美国，慢性伤口影响约650万人，每年耗费约400亿美元。尽管人们已投入大量努力来理解人类慢性伤口的发生机制，但一些基本问题仍未得到解答。最近，我们开发了一种新型的小鼠糖尿病慢性伤口模型，该模型具有许多人类慢性伤口的特征。利用db/db^-/-小鼠，我们可通过一次性使用过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的特异性抑制剂处理，在伤口形成后立即在伤口组织中诱导高水平的氧化应激（OS），从而产生慢性伤口。这些伤口具有高水平的氧化应激，可自然形成生物膜，处理后20天内完全转为慢性状态，并可持续开放超过60天。这一新型模型具备人类糖尿病慢性伤口的多种特征，因此可显著推动对伤口慢性化机制的基础性理解。这一突破意义重大，因为人类的慢性伤口会给患者带来显著的疼痛与痛苦，若无法解决，可能导致截肢。此外，这些伤口治疗成本高昂且耗时，还会导致患者个人收入的重大损失。通过使用我们的慢性伤口模型推进该领域的研究，有望显著改善数百万受此衰弱性疾病困扰者的医疗保健水平。在本实验方案中，我们详细描述了使急性伤口转为慢性伤口的操作步骤，此前尚无此类方法报道。

引言

伤口愈合涉及复杂且在时间和空间上受到调控的细胞与分子过程，这些过程按顺序并部分重叠地进行，包含多种不同类型的细胞，包括但不限于免疫反应和血管系统¹。皮肤受到损伤后，立即有多种因子和血细胞聚集至伤口部位，启动凝血级联反应以形成血凝块。在实现稳态后，血管扩张，使氧气、营养物质、酶、抗体以及趋化因子进入伤口部位，趋化中性粒细胞至伤口床以清除异物碎片，并分泌蛋白水解酶²。活化的血小板释放多种生长因子，刺激伤口边缘的角质形成细胞，促进其重新上皮化。募集至伤口部位的单核细胞分化为巨噬细胞，吞噬细菌和已死亡的中性粒细胞，并分泌额外因子，以维持角质形成细胞的增殖和促迁移信号。在增殖阶段，随着重新上皮化的持续进行，由成纤维细胞、单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞和内皮细胞组成的新肉芽组织继续组织修复过程²。血管生成通过促进内皮细胞的增殖和迁移而被激活，从而形成新的血管。上皮化以及细胞外基质的重塑构建起抵御外界环境的屏障。随着伤口愈合，肉芽组织逐渐演变为瘢痕，细胞凋亡清除炎症细胞、成纤维细胞和内皮细胞，且不引起额外的组织损伤。成纤维细胞通过重塑细胞外基质的多种组分（如胶原蛋白），增强组织的抗张强度，使新生组织的强度和柔韧性几乎接近未受损皮肤²。

任何偏离这种高度协调的伤口闭合进程的情况都会导致愈合受损和/或形成慢....

方案

所有实验均按照联邦法规以及加州大学的政策和程序进行，并已获得加州大学河滨分校动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 动物

1. 使用糖尿病和肥胖的 B6.BKS(D)-Lepr^db/J 小鼠建立慢性伤口模型。可选择购买杂合子用于繁育，或直接购买纯合子用于实验。
2. 将杂合子雄鼠与雌鼠交配以产生后代。从统计学上看，仅四分之一的仔鼠会发育为糖尿病和肥胖型（db/db^-/-）。
3. 仔鼠出生后 3 周断奶，并将 db/db^-/- 小鼠与其同窝仔鼠共同饲养。出生后 5 周时，将 db/db^-/- 小鼠从同窝仔鼠中分离，与其他 db/db^-/- 小鼠同笼饲养，直至其达到 5–6 个月龄，可用于慢性伤口模型。在此期间，可形成成熟且复杂的皮肤微生物组。
   注意：db/db^-/- 小鼠在出生后 3–5 周龄期间可通过外观与同窝仔鼠明显区分。db/db^-/- 小鼠表现为肥胖和糖尿病，体型显著大于野生型和杂合子同窝仔鼠，外形更圆胖，腹部可能略呈粉红色，臀部更宽大。手术前应确认其体重增加。此外，可通过检测血液中高水平的葡萄糖以及对小鼠进行基因分型，以确....

结果

图5展示了一个未经抑制剂治疗而趋向愈合的伤口示例，以及一个经抑制剂治疗后趋向慢性化的伤口示例。慢性伤口上保留了透明敷料，以便观察生物膜和液体积聚情况。

慢性伤口的启动发生在6小时之内，伤口边缘因氧化应激而出现明显改变。组织学证据显示，该伤口边缘组织已发生坏死，无法参与伤口愈合过程。伤口中形成生物膜的细菌随后可利用这些坏死组织作为营养来源和结构组分，以生成生物膜。慢性伤口是指持续开放、较初始伤口扩大的伤口，其内含有生物膜（即人类慢性伤口中发现的胞外多糖基质及致病菌），且愈合时间长达数月甚至数年，具体时长取决于阻碍伤口正常愈合的生物膜的数量与成分。在慢性伤口模型中，完全慢性状态被设定为 > 术后20天，因为未使用抑制剂处理的伤口在此时已经愈合（图5）。愈合通常需要 > 60天，具体时间取决于伤口中主要的致病菌种类。当存在更具侵.......

讨论

在小鼠身上建立慢性伤口后，该模型可用于研究与慢性化启动相关的受损伤口愈合过程。该模型还可用于测试多种化学物质和药物在逆转慢性伤口发展及促进伤口闭合与愈合方面的有效性。可研究慢性化发生后的不同时间点：例如，创伤后第1至5天用于研究慢性化的早期阶段，第20天及以后用于研究完全形成的慢性伤口。

慢性伤口模型也是研究伤口愈合各个方面以及诸如生物负荷和恶病质等并发症的有力模型。在此模型中可研究的慢性伤口特征之一便是生物负荷，因为生物负荷同样影响人类的慢性伤口。我们的操作流程和动物使用方案明确指出了需要监测的症状以及具体的监测时间表。根据IACUC批准的标准被判定为病态的动物将被实施安乐死，以避免其遭受严重痛苦。此外，当出现特定症状时，还会咨询校园兽医和动物健康技术人员，以获得关于评估标准的支持性指导。

方案中的关键步骤包括饲养 db/db^-/- 在常规动物房中饲养小鼠，使用脱毛膏去除毛发，并在给予异氟烷前进行加热处理。慢性伤口模型中慢性伤口的形成依赖于非无菌的环境与操作条件。这些.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B6.BKS(D)-Leprdb/	杰克逊实验室	00697	可提供纯合子和杂合子
含舒缓芦荟和羊毛脂的Nair脱毛乳液	Nair		一种化学脱毛剂
布托啡诺（盐酸布托啡诺）	亨利·斯坦动物健康	059122	0.3 mg/ml，3类
3-氨基-1,2,4-三唑（ATZ）	TCI	A0432
巯基琥珀酸（MSA）	Aldrich	88460
磷酸盐缓冲液（PBS）			高压灭菌消毒
异氟烷	Henry Schein Animal Health	029405	NDC 11695-6776-2
氧气			储液罐必须与汽化系统兼容
异氟烷蒸发器	JA Baulch & Associates
Wahl 理发剪	Wahl		锂离子
Acu Punch 7mm 皮肤活检穿孔器	Acuderm Inc.	P750
Tegaderm	3M	编号：1624W	透明薄膜敷料（6 cm x 7 cm）
加热垫	Conair		湿润干热敷垫
胰岛素注射器	BD	329461	0.35 mm（28G）× 12.7 mm（1/2）")
70% 乙醇
Kimwipes
镊子
锋利的手术剪刀
细金属刮刀
导管
小鼠鼻罩
手套
小型塑料容器