颅内蛛网膜下腔感染途径用于研究功能 猪链球菌 小鼠感染模型中脑膜炎的生物膜研究

摘要

本文描述了通过颅内蛛网膜下腔途径感染小鼠，以研究生物膜在猪链球菌（Streptococcus suis）性脑膜炎中的作用。该感染模型也适用于研究其他细菌性脑膜炎的发病机制以及新型药物对抗细菌性脑膜炎的疗效。

摘要

Streptococcus suis 不仅是全球猪群中重要的细菌性病原体，也是一种新发的人畜共患致病菌。在人类和猪中，脑膜炎是 S. suis 感染的主要临床表现之一。建立合适的感染模型是研究病原体致病机制的重要工具。目前已建立多种小鼠感染途径用于研究 S. suis 的致病过程。然而，腹腔、鼻腔和静脉感染途径并不适用于直接研究 S. suis 表面组分（如生物膜中的细胞外基质）在脑组织中对脑膜炎发生的作用。尽管已有研究采用小脑延髓池接种 S. suis，但其精确的注射位点尚未明确描述。本文介绍了一种小鼠颅内蛛网膜下腔感染模型，用于研究生物膜在 S. suis 脑膜炎中的作用。将 S. suis 浮游状态细胞或生物膜状态细胞通过位于前囟前方 3.5 mm 的注射位点直接注入小鼠蛛网膜下腔。对注射生物膜状态细胞的小鼠脑组织进行组织病理学分析，并检测到 TLR2 及细胞因子 mRNA 表达水平显著升高，结果明确表明 S. suis 生物膜在 S. suis 脑膜炎中发挥着确定性作用。该感染途径相较于其他途径具有明显优势，可有效用于研究宿主与细菌之间的相互作用；此外，它还能直接评估细菌组分对脑内宿主免疫应答的影响，并模拟细菌侵入中枢神经系统的过程。该感染模型可进一步推广用于研究其他细菌引起脑膜炎的机制，也可用于评估抗细菌性脑膜炎药物的疗效。

引言

猪链球菌 (S. suis是一种全球范围内猪的主要细菌性病原体，可引起脑膜炎、肺炎、败血症、心内膜炎和关节炎等严重疾病¹它也是一种新出现的动物源性病原体。迄今为止，已有九种血清型被报道可引起人类感染，包括血清型2、4、5、9、14、16、21、24和31^2,3,4在人类和猪中，脑膜炎是主要的临床症状之一 S. suis 感染。在越南和泰国， S. suis 是成人脑膜炎的主要病因⁵微生物生物膜是相互黏附并集中于界面的微生物群落，对细菌的致病性、在多种环境中的存活以及抗生素耐药性具有重要作用。⁵生物膜通常被一种细胞外基质包裹，该基质通常含有多糖、蛋白质和DNA⁶后者能够引发宿主的炎症反应和细胞因子产生⁷已有研究表明，生物膜的形成与链球菌性脑膜炎相关。生物膜有助于 无乳链球菌 在罗非鱼模型中发现脑膜炎以及脑组织内和脑膜表面周围的生物膜形成 体内 通过腹腔内接种⁸....

方案

小鼠感染实验已获得中国江苏省实验动物管理委员会的批准，并在南京农业大学实验动物中心进行（许可证号：SYXK (苏) 2017-0007）。

1. 细菌的制备

注意：S. suis 2型强毒株P1/7分离自患脑膜炎的病猪¹⁹。P1/7菌株在Todd-Hewitt液体培养基（THB，每升THB配方：心浸液，3.1 g；新胨，20.0 g；葡萄糖，2.0 g；氯化钠，2.0 g；磷酸氢二钠，0.4 g；碳酸钠，2.5 g）中培养，并接种于Todd-Hewitt琼脂培养基（THA，每升THA配方：心浸液，3.1 g；新胨，20.0 g；葡萄糖，2.0 g；氯化钠，2.0 g；磷酸氢二钠，0.4 g；碳酸钠，2.5 g；琼脂，15.0 g）上，在37 °C、5% CO₂条件下培养。

1. 收集浮游状态的 P1/7 菌株细胞
   1. 从对数中期培养物（OD₆₀₀=0.6）中收集 5 mL 浮游细胞，以 8000 × g 离心 3 分钟，然后用 PBS 洗涤 3 次。
   2. 用 5 mL 含 25% 甘油的 THB 重悬细胞，分装至 5 支试管中，于 -80 °C 保存。
2. 收集生物膜状态的 P1/7 菌株细胞

结果

采用扫描电镜分析在实验条件下生物膜的形成情况。如图1所示，浮游状态细胞（图1A）与生物膜状态细胞（图1B）在生物膜形成方面存在显著差异。扫描电镜分析显示，生物膜中的细菌以团块状和多层结构存在，并被包裹在胞外基质中；而浮游细菌密度较低，主要呈单个分散状态。

生物膜的细胞外基质组分（如DNA）能够引发宿主的炎症反应和细胞因子产生。根据先前的研究，TLR2以及细胞因子CCL2、IL-6和TNF-α参与了与脑膜炎相关的脑部炎症反应^{10,11,2.......}

讨论

本文所述的颅内蛛网膜下腔感染途径相较于其他感染途径具有明显优势。该方法可使研究人员直接在脑内研究宿主与细菌之间的相互作用，以及细菌组分对宿主免疫反应的影响，从而模拟细菌进入中枢神经系统的过程。因此，该感染途径可进一步用于研究其他细菌引起脑膜炎的机制。此外，该方法还可用于评估药物对细菌性脑膜炎的治疗效果。

为了使用该模型获得良好的实验结果，需明确以下关键步骤。生物膜的形成必须在实验条件下进行检测。在本研究中，采用扫描电子显微镜分析进行检测。其他方法也可用于检测生物膜的形成，例如组织培养板法和试管法²¹。感染前一天，需将浮游状态细胞和生物膜状态细胞的冻存样品从-80 °C解冻，以测定CFU。次日，应根据CFU将细菌稀释至适当的感染剂量。实验中需设置注射PBS的模拟感染对照组，该组小鼠在整个感染实验期间应无任何异常表现。不同菌株的感染剂量可能不同，因此强烈建议先进行预实验以确定合适的感染剂量。在本研究中，根据预实验结果采用3 × 10⁷ CFU作为感染剂量。在预实验中，该剂量的生物膜细菌可在感染后48小时导致全部5只小.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Todd Hewitt 肉汤（THB）	Becton, Dickinson and Company	DF0492078	将 30 g 粉末溶解于 1 L 纯化水中。121° 下高压灭菌 15 分钟。
琼脂	DSBIO	16C0050	将 15 g 粉末溶解于 1 L THB 中。121° 下高压灭菌 15 分钟。
Milli-Q Reference 水纯化系统	Merck KGaA	Z00QSVCUS	无 Dnase/Rnase
NaCl	天津科密欧化学试剂有限公司	10019318	将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.42 g Na2HPO3 和 0.27 g KH2PO4 溶解于 1 L 纯化水中。121° 下高压灭菌 15 分钟。用 KOH 调节 pH 至 7.4。
Na2HPO3	西陇科学股份有限公司	9009012-01-09	将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.42 g Na2HPO3 和 0.27 g KH2PO4 溶解于 1 L 纯化水中。121° 下高压灭菌 15 分钟。用 KOH 调节 pH 至 7.4。
KCl	西陇科学股份有限公司	9009017-01-09	将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.42 g Na2HPO3 和 0.27 g KH2PO4 溶解于 1 L 纯化水中。121° 下高压灭菌 15 分钟。用 KOH 调节 pH 至 7.4。
KH2PO4	西陇科学股份有限公司	9009019-01-09	将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.42 g Na2HPO3 和 0.27 g KH2PO4 溶解于 1 L 纯化水中。121° 下高压灭菌 15 分钟。用 KOH 调节 pH 至 7.4。
KOH	西陇科学股份有限公司	9009014-01-09	将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.42 g Na2HPO3 和 0.27 g KH2PO4 溶解于 1 L 纯化水中。121° 下高压灭菌 15 分钟。用 KOH 调节 pH 至 7.4。
甘油	西陇化学试剂有限公司	10010618	与等体积纯化水稀释后，121° 下高压灭菌 15 分钟
4% 多聚甲醛	西陇化学试剂有限公司	80096675
25% 戊二醛	西陇化学试剂有限公司	30092436	用纯化水稀释 10 倍用于固定。
乙醇	西陇化学试剂有限公司	10009218
氯仿	西陇化学试剂有限公司	10006818
分光光度计	DeNovix Inc.	DS-11+
超声波细胞破碎仪	宁波新芝生物科技股份有限公司	JY96-IIN
离心机	日立工机株式会社	CT15RE
冰箱	澳柯玛股份有限公司	DW-86L500
扫描电子显微镜	蔡司	EVO-LS10
FastRNA Pro Green 试剂盒	MP Biomedicals	#6045-050
FastPrep-24 仪器	MP Biomedicals	116005500
PCR 仪	SensoQuest GmbH	1124310110
QuantStudio 6 Flex	赛默飞世尔科技	4485689
SYBR Premix Ex Taq II	宝日医生物技术（北京）有限公司	RR820A
含 gDNA 消除剂的 PrimeScript RT 试剂盒	宝日医生物技术（北京）有限公司	RR047A
全封闭组织处理仪	Leica Biosystems Nussloch GmbH	ASP200S
加热式石蜡包埋模块	Leica Biosystems Nussloch GmbH	EG1150H
半自动旋转切片机	Leica Biosystems Nussloch GmbH	RM2245
石蜡切片水浴	Leica Biosystems Nussloch GmbH	HI1210
自动染色机 XL	Leica Biosystems Nussloch GmbH	ST5010
Agilent 2100	安捷伦科技	G2939A
光学显微镜	奥林巴斯	BX51