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方法文章

打印型聚糖芯片：一种用于分析小型动物循环中抗碳水化合物抗体谱的灵敏技术

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DOI：

10.3791/57662

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2019年2月14日

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1Infectious Pathology and Transplantation Division, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Russian Academy of Sciences, 3Semiotik LLC, 4Auckland University of Technology, 5Intensive Care Department, Bellvitge University Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究展示了印刷糖阵列（PGA）技术在分析小型动物体内循环抗碳水化合物抗体方面的潜力。

摘要

特定个体循环系统中抗碳水化合物抗体的谱型通常与其免疫状态相关。个体的免疫状况不仅决定了其对抗内外潜在威胁信号的有效性，而且特定模式的循环抗糖抗体（及其血清水平的变化）也可能是某些病理状态发生与进展的重要标志物。本文介绍一种基于打印糖阵列（Printed Glycan Array, PGA）的技术方法，该方法具有极高灵敏度，可同时检测数百种糖类靶标，且仅需极少量样本，这对于使用小型动物（如大鼠、小鼠、仓鼠）时常见的样本量受限情况尤为适用。 等等。) 被用作研究人类疾病相关方面的模型。作为该方法的代表性示例，我们展示了对 BALB/c 小鼠中天然抗糖抗体库分析所得的结果。我们证明，参与研究的每只 BALB/c 小鼠，尽管基因相同且在相同条件下饲养，仍会形成独特的天然抗碳水化合物抗体模式。本研究旨在拓展 PGA 技术的应用，以研究循环中抗碳水化合物抗体的谱系（特异性）及其水平，无论是在健康状态还是在各种病理条件下。

引言

抗体在抵御入侵病原体的过程中发挥核心作用，可通过直接中和病毒1,2和细菌2,3、激活补体系统4,5以及增强吞噬作用6来实现免疫防御。此外，抗体在靶向癌症、清除恶性细胞7以及维持机体稳态8,9方面也是关键组分。

免疫系统疾病可导致自身免疫性疾病和炎症性疾病10以及癌症11。所有这些病理状况理想情况下都需要及时诊断，以便进行有效治疗。对于自身免疫性疾病而言，在大多数情况下，血清中自身抗体的存在是诊断自身免疫的重要预测指标10,12。这些抗体可与细胞表面及细胞外自身抗原发生反应，并且通常在自身免疫性疾病临床表现出现前多年就已存在于体内10,12。免疫缺陷和癌症的诊断也依赖血液检测，通过测定抗体等免疫成分的水平或其功能活性来进行11。

确定循环抗体的种类及其血清学水平对于设定预后并评估上述所有病理状况的进展至关重要。我们此前已证明了PGA技术在分析不同动物物种循环抗体方面的潜力13-16，该方法可最大限度减少血清样本的使用量，避免抗体交叉反应相关问题17，并实现对大量抗体谱系的高通量分析15。

基于聚糖的免疫测定主要受多种因素影响，其中碳水化合物的来源和制备方式尤为关键，这些因素决定了配体的亲和力与结合能力15,18,19,20,21。基于聚糖的免疫测定可在悬浮体系（如微球）15,21,22 或平面活化表面15,21,22,23,24 上进行。后者包括ELISA（这些方法中最常规的一种）和PGA。目前尚缺乏在相同实验条件下对这些方法进行系统比较的大量数据15,25,26,27。我们此前已比较了这些免疫测定方法在分析个体人血浆样本中抗聚糖抗体谱时的有效性与选择性15。对于某些抗体，例如针对ABO血型抗原的抗-A/B抗体，所有免疫测定方法均可在统计学上显著检测到，且结果之间呈正相关15,18,21。而抗-P1抗体则主要通过PGA检测，其分辨能力最强，且不同基于聚糖的免疫测定方法之间的检测结果无相关性15,18,21。这些方法间的差异主要与抗体/抗原比例及聚糖的空间取向有关15。ELISA和平面悬浮阵列比PGA更容易发生非特异性结合，因为这些方法中抗原通常过量于抗体15。此外，PGA中聚糖的空间取向比ELISA和平面悬浮阵列更为受限15。当研究仅涉及有限数量的聚糖组合时，ELISA较为便捷。ELISA与悬浮阵列在实验方案的重新配置方面具有更广泛的灵活性。PGA在探索性研究中具有显著优势15,18,21,28。尽管这三种免疫测定方法各有明显优缺点，但均可用于研究聚糖-抗体相互作用的不同方面。最终研究目标将决定最适合的方法选择。

本研究旨在扩展聚糖阵列（PGA）技术的应用，用于分析小型动物循环系统中抗糖类抗体的谱型。作为代表性结果，本文提供了一项详细方案，通过聚糖阵列技术评估成年BALB/c小鼠体内天然抗碳水化合物抗体的谱型。

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方案

1. 糖芯片制备

  1. 芯片制备
    1. 使用非接触式机器人点样仪（液滴体积约900 pL），将糖类（50 mM）和多糖（10 µg/mL）溶于300 mM磷酸盐缓冲液（PBS，pH 8.5）中，以每种6个重复的模式点样至N-羟基琥珀酰亚胺修饰的玻片上。每张玻片包含4个不同的子阵列区块（图1A，以不同颜色表示），每个区块重复6次。每个子阵列由112种不同的糖类点样点组成，包括对照（8行×14列）（图1B）。
      注：糖类相关信息见补充表1。用于打印微芯片的糖类文库是IBCh团队长期合成工作的成果；相关合成示例见已发表文献29,30,31,32,33,34,35,36,37,38。该糖类文库包括血型抗原、最常见的末端寡糖、哺乳动物N-和O-连接糖蛋白及糖脂的核心结构、肿瘤相关糖类抗原，以及来自致病菌的多糖。
    2. 将玻片置于湿度盒中（相对湿度约70%），在室温（25 °C）下孵育1小时。
    3. 封闭微阵列：在室温下用封闭缓冲液孵育玻片1.5小时（100 mM硼酸，25 mM乙醇胺，0.2% (v/v) Tween-20，溶于超纯水中）。
    4. 用超纯水清洗糖芯片，并通过空气干燥。
  2. 糖芯片质量控制
    1. 从每批微阵列中选取两张芯片进行分析，使用1 mg/mL的复合免疫球蛋白制剂溶液（CIP，含IgG、IgM和IgA），再使用10 µg/mL的生物素化山羊抗人免疫球蛋白溶液作为二抗（IgM + IgG + IgA），随后使用1 µg/mL的相应荧光标记链霉亲和素偶联物溶液（具体操作见下文步骤2）。
    2. 扫描并分析糖芯片（见步骤3，糖阵列分析）。
    3. 选择芯片内和芯片间相关性高于0.9的微阵列批次用于后续实验。

2. 聚糖芯片技术

  1. 配制以下水溶液（使用超纯水），并在室温（25 °C）下保存：
    • 缓冲液-1：含1% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液，含1% (v/v) Tween-20 和 0.01% (w/v) NaN3
    • 缓冲液-2：含1% (w/v) BSA的PBS溶液，含0.1% (v/v) Tween-20 和 0.01% (w/v) NaN3。
    • 缓冲液-3：含0.1% (v/v) Tween-20 的PBS溶液。
    • 缓冲液-4：含0.001% (v/v) Tween-20 的PBS溶液。
  2. 糖芯片与样品准备
    1. 将装有载片的储存盒置于实验台上，待其恢复至室温（25 °C）。
      注意：使用无粉乳胶手套。操作糖芯片时应仅接触玻片底部（即条形码所在位置）。条形码有助于识别正确的一面，避免触碰印有糖链的表面。
    2. 打开盒子，取出糖芯片并放入已预先放置湿滤纸以维持恒定湿度的孵育室中（25 °C）。
    3. 同时，在1.5 mL离心管中用缓冲液-1按1:20比例稀释小鼠血清。使用涡旋混合器均质化血清溶液（5秒）。
      注意：完全覆盖单个糖芯片表面所需的体积约为1 mL。
    4. 均质化后，将稀释后的血清在37 °C水浴中孵育10分钟，以防止免疫球蛋白聚集。随后在10,000 × g、25 °C条件下离心3分钟，收集上清液，并弃去任何沉淀物质。
    5. 小心将糖芯片放入孵育室中。加入1 mL缓冲液-3，在25 °C下孵育15分钟，以去除糖芯片表面的任何残留物质。
    6. 将糖芯片垂直持握，使用塑料巴斯德吸管滴加数滴缓冲液-3进行重洗。用滤纸小心吸除糖芯片表面的缓冲液。
  3. 反应：抗体结合
    1. 将糖芯片放入孵育室中。使用微量移液器将稀释后的血清样品均匀铺展在糖芯片表面。在37 °C下以30 rpm轨道振荡孵育1.5小时。使用移液器吸头确保糖芯片表面所有干燥区域均被稀释血清样品覆盖。
    2. 去除多余样品，将糖芯片浸入25 °C的缓冲液-3中5分钟。然后将糖芯片转移至盛有缓冲液-4的容器中（5分钟），最后用超纯水清洗糖芯片（5分钟）。在175 × g、25 °C条件下离心1分钟以去除液体。
  4. 检测：二抗结合
    1. 将糖芯片放入孵育室中。在糖芯片表面铺展含有生物素标记的山羊抗小鼠（IgG + IgM）抗体的溶液（5 µg/mL，溶于缓冲液-2）。在37 °C下以30 rpm轨道振荡孵育1小时。
    2. 去除未结合的组分，并重复洗涤步骤。
    3. 离心后，在避光条件下将糖芯片与相应荧光染料标记的链霉亲和素溶液（2 µg/mL，溶于缓冲液-2）在25 °C下孵育45分钟（30 rpm）。
    4. 在避光条件下，去除未结合的组分，并重复洗涤步骤。
    5. 通过空气干燥使糖芯片干燥。
      注意：糖芯片应尽快进行扫描。但如果染色后无法立即扫描，可将糖芯片置于阴凉干燥避光处保存。

3. 糖芯片阵列分析

  1. 扫描芯片
    1. 将糖芯片置于暗处桌面上，直至其达到室温。同时，打开载片扫描仪和激光器（激发波长为633 nm）。
    2. 握住微阵列，将糖芯片滑入槽中，直至其接触背面。
    3. 扫描糖芯片（"运行快速扫描"），并将扫描结果保存为 ".TIFF" 文件。
  2. 阵列定量
    1. 使用 ScanArray 分析系统对芯片进行定量分析。通过点击打开先前扫描的图像 "文件" 在 "配置 & 文件组" 主窗口上（图1B- D)
    2. 以GAL格式加载相应的阵列文件模板（玻璃载片上印制的糖链布局）图1C).
    3. 通过仔细对齐阵列（网格）与图像中的斑点来调整GAL模板，并启动定量分析（图1D).
    4. 选择定量参数：
      • 定量类型：运行 Easy Quant。
      • 定量方法：固定圆圈
      • 自动查找斑点：取消勾选所有选项
      • 标准化方法：LOWESS（局部加权散点图平滑法）。
    5. 将定量数据保存为 ".CSV" 文件（图1D将这些数据导入 Microsoft Excel 或其他合适的应用程序中的通用电子表格文件。
    6. 使用四分位距（IQR）作为主要统计方法：计算每种配体所有信号的中位数（第二四分位数）以及四分位距（第75百分位数和第25百分位数，即上四分位数Q3和下四分位数Q1）。
    7. 使用层次聚类探索器应用程序对数据进行交互式探索。
    8. 使用聚类参数：平均连接法（UPGMA）和欧氏距离作为相似性距离度量。对行进行层级聚类分析，不进行标准化。

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结果

在此，我们总结了对20只BALB/c小鼠群体中天然抗糖抗体库进行定量分析所获得的代表性结果。本研究使用的糖芯片包含419种不同的糖类结构。大多数糖类被合成为-CH2CH2CH2NH2 间隔臂式 O-糖苷，在某些情况下为-CH2CH2NH2 或 -NHCOCH2NH2 糖苷。所有糖链结构均通过高分辨率（700 或 800 MHz）核磁共振波谱进行表征，并经高效液相色谱纯化和检测，表明其 >纯度为95%。由于小鼠血清用量受限，我们同时检测了IgM和IgG类抗糖类抗体。在PGA实验中，我们将荧光信号值高于4,000 RFU判定为抗体结合阳性信号（该数值约为最高糖类信号RFU值的10%）。本研究所呈现的结果遵循了糖芯片数据报告的大部分指南。39只有17%的碳水化合物结构在PGA中显示出≥4,000 RFU

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讨论

聚糖微阵列已成为研究蛋白质-聚糖相互作用不可或缺的工具40。本研究描述了一种基于PGA技术的实验方案，用于分析BALB/c小鼠循环系统中抗碳水化合物抗体的谱系。由于PGA技术能够对大量生物学意义尚未明确的聚糖进行筛选，因此是一种极为便捷的发现工具13,15,28。该方法可在同一实验条件下，利用少量血清样本（50 µL）同时检测数百种聚糖结构。这一点在实验动物体积较小（循环血量有限）或需要对同一实验动物多次采血的情况下尤为重要。

我们展示了代表性结果：基因完全相同的小鼠不应被视为免疫学上的等同个体，因为它们会产生不同的天然抗碳水化合物抗体模式（仅有12种糖链特异性是保守的）。在其余天然抗碳水化合物抗体的血清水平方面，被检测动物之间存在显著差异。对近交系动物肠道微生物群的分析4

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披露

Nailya Khasbiullina 和 Alexey Nokel 是 Semiotik LLC 的员工，该公司是本研究中所用糖芯片的供应商。

致谢

本工作得到以下资助： "卫生研究基金" 由西班牙卫生部 Carlos III 卫生研究所资助的项目（FIS）基金 PI13/01098。DB-G 受益于欧洲联盟第七框架计划（FP7/2007-2013）资助协议 603049（TRANSLINK）支持的博士后研究职位。NK、NS 和 NB 的工作得到俄罗斯科学基金会项目 #14-50-00131 的资助。DB-G 谨向 Marta Broto、J. Pablo Salvador 和 Ana Sanchis 致以感谢，感谢他们提供的出色技术协助，并感谢 Alexander Rakitko 在统计分析方面的帮助。 在……的支持下 "加泰罗尼亚自治区企业与知识部大学与研究秘书处工业博士计划（资助编号 2018 DI 021）。感谢 CERCA 计划 / 加泰罗尼亚自治区政府提供的机构支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗体
生物素标记的山羊抗人免疫球蛋白Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA货号：31782
生物素标记的山羊抗小鼠IgM + IgGThermo Fisher Scientific货号：31807
设备
sciFLEXARRAYER S5 机器人点样仪 Scienion AG, Berlin, Germanyhttp://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
染色缸（载玻片孵育室）Simport, Beloeil, QC, Canada货号：M920-2
离心机Eppendorf, Hamburg, Germany 货号：5810 R
移液器Gilson, Middleton, WI, USAhttp://www.gilson.com/en/Pipette/
载玻片扫描仪 PerkinElmer, Waltham, MA, USAScanArray GX Plus 
摇床孵育器Cole-Parmer, Staffordshire, UK货号：SI50
生物样本
BALB/c小鼠血清本文N/A
复合免疫球蛋白制剂（CIP）Immuno-Gem, Moscow, Russiahttp://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
化学品、试剂和糖链 
糖链文库莫斯科俄罗斯科学院生物有机化学研究所（IBCh）N/A
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 货号：A9418
乙醇胺Sigma-Aldrich货号：411000
Tween-20Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain货号：655204
磷酸盐缓冲液（PBS）VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain货号：E404
叠氮化钠Sigma-Aldrich货号：S2002
链霉亲和素Alexa Fluor 555偶联物 Thermo Fisher Scientific货号：S21381
链霉亲和素Cy5偶联物GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK货号：PA45001
材料
N-羟基琥珀酰亚胺衍生物修饰的玻璃载片 H Schott-Nexterion, Jena, Germany货号：1070936
Whatman滤纸 Sigma-Aldrich货号：WHA10347509
1.5 mL离心管Eppendorf 货号：0030120086
软件与算法
ScanArray Express 微阵列分析系统PerkinElmerhttp://www.per
kinelmer.com/microarray
层级聚类浏览器（Hierarchical Clustering Explorer）应用程序美国马里兰大学，MD，USAhttp://www.cs.umd.edu/hcil/hce/

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