打印型聚糖芯片：一种用于分析小型动物循环中抗碳水化合物抗体谱的灵敏技术

摘要

本研究展示了印刷糖阵列（PGA）技术在分析小型动物体内循环抗碳水化合物抗体方面的潜力。

摘要

特定个体循环系统中抗碳水化合物抗体的谱型通常与其免疫状态相关。个体的免疫状况不仅决定了其对抗内外潜在威胁信号的有效性，而且特定模式的循环抗糖抗体（及其血清水平的变化）也可能是某些病理状态发生与进展的重要标志物。本文介绍一种基于打印糖阵列（Printed Glycan Array, PGA）的技术方法，该方法具有极高灵敏度，可同时检测数百种糖类靶标，且仅需极少量样本，这对于使用小型动物（如大鼠、小鼠、仓鼠）时常见的样本量受限情况尤为适用。 等等。) 被用作研究人类疾病相关方面的模型。作为该方法的代表性示例，我们展示了对 BALB/c 小鼠中天然抗糖抗体库分析所得的结果。我们证明，参与研究的每只 BALB/c 小鼠，尽管基因相同且在相同条件下饲养，仍会形成独特的天然抗碳水化合物抗体模式。本研究旨在拓展 PGA 技术的应用，以研究循环中抗碳水化合物抗体的谱系（特异性）及其水平，无论是在健康状态还是在各种病理条件下。

引言

抗体在抵御入侵病原体的过程中发挥核心作用，可通过直接中和病毒^1,2和细菌^2,3、激活补体系统^4,5以及增强吞噬作用⁶来实现免疫防御。此外，抗体在靶向癌症、清除恶性细胞⁷以及维持机体稳态^8,9方面也是关键组分。

免疫系统疾病可导致自身免疫性疾病和炎症性疾病¹⁰以及癌症¹¹。所有这些病理状况理想情况下都需要及时诊断，以便进行有效治疗。对于自身免疫性疾病而言，在大多数情况下，血清中自身抗体的存在是诊断自身免疫的重要预测指标^10,12。这些抗体可与细胞表面及细胞外自身抗原发生反应，并且通常在自身免疫性疾病临床表现出现....

方案

1. 糖芯片制备

1. 芯片制备
   1. 使用非接触式机器人点样仪（液滴体积约900 pL），将糖类（50 mM）和多糖（10 µg/mL）溶于300 mM磷酸盐缓冲液（PBS，pH 8.5）中，以每种6个重复的模式点样至N-羟基琥珀酰亚胺修饰的玻片上。每张玻片包含4个不同的子阵列区块（图1A，以不同颜色表示），每个区块重复6次。每个子阵列由112种不同的糖类点样点组成，包括对照（8行×14列）（图1B）。
      注：糖类相关信息见补充表1。用于打印微芯片的糖类文库是IBCh团队长期合成工作的成果；相关合成示例见已发表文献^{29,30,31,32,33,34,35,36}

结果

在此，我们总结了对20只BALB/c小鼠群体中天然抗糖抗体库进行定量分析所获得的代表性结果。本研究使用的糖芯片包含419种不同的糖类结构。大多数糖类被合成为-CH₂CH₂CH₂NH₂ 间隔臂式 O-糖苷，在某些情况下为-CH₂CH₂NH₂ 或 -NHCOCH₂NH₂ 糖苷。所有糖链结构均通过高分辨率（700 或 800 MHz）核磁共振波谱进行表征，并经高效液相色谱纯化和检测，表明其 >纯度为95%。由于小鼠血清用量受限，我们同时检测了IgM和IgG类抗糖类抗体。在PGA实验中，我们将荧光信号值高于4,000 RFU判定为抗体结合阳性信号（该数值约为最高糖类信号RFU值的10%）。本研究所呈现的结果遵循了糖芯片数据报告的大部分指南。³⁹只有17%的碳水化合物结构在PGA中显示出≥4,000 RFU

讨论

聚糖微阵列已成为研究蛋白质-聚糖相互作用不可或缺的工具⁴⁰。本研究描述了一种基于PGA技术的实验方案，用于分析BALB/c小鼠循环系统中抗碳水化合物抗体的谱系。由于PGA技术能够对大量生物学意义尚未明确的聚糖进行筛选，因此是一种极为便捷的发现工具^13,15,28。该方法可在同一实验条件下，利用少量血清样本（50 µL）同时检测数百种聚糖结构。这一点在实验动物体积较小（循环血量有限）或需要对同一实验动物多次采血的情况下尤为重要。

我们展示了代表性结果：基因完全相同的小鼠不应被视为免疫学上的等同个体，因为它们会产生不同的天然抗碳水化合物抗体模式（仅有12种糖链特异性是保守的）。在其余天然抗碳水化合物抗体的血清水平方面，被检测动物之间存在显著差异。对近交系动物肠道微生物群的分析⁴

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗体
生物素标记的山羊抗人免疫球蛋白	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	货号：31782
生物素标记的山羊抗小鼠IgM + IgG	Thermo Fisher Scientific	货号：31807
设备
sciFLEXARRAYER S5 机器人点样仪	Scienion AG, Berlin, Germany	http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
染色缸（载玻片孵育室）	Simport, Beloeil, QC, Canada	货号：M920-2
离心机	Eppendorf, Hamburg, Germany	货号：5810 R
移液器	Gilson, Middleton, WI, USA	http://www.gilson.com/en/Pipette/
载玻片扫描仪	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	ScanArray GX Plus
摇床孵育器	Cole-Parmer, Staffordshire, UK	货号：SI50
生物样本
BALB/c小鼠血清	本文	N/A
复合免疫球蛋白制剂（CIP）	Immuno-Gem, Moscow, Russia	http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
化学品、试剂和糖链
糖链文库	莫斯科俄罗斯科学院生物有机化学研究所（IBCh）	N/A
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,	货号：A9418
乙醇胺	Sigma-Aldrich	货号：411000
Tween-20	Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain	货号：655204
磷酸盐缓冲液（PBS）	VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain	货号：E404
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	货号：S2002
链霉亲和素Alexa Fluor 555偶联物	Thermo Fisher Scientific	货号：S21381
链霉亲和素Cy5偶联物	GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK	货号：PA45001
材料
N-羟基琥珀酰亚胺衍生物修饰的玻璃载片 H	Schott-Nexterion, Jena, Germany	货号：1070936
Whatman滤纸	Sigma-Aldrich	货号：WHA10347509
1.5 mL离心管	Eppendorf	货号：0030120086
软件与算法
ScanArray Express 微阵列分析系统	PerkinElmer	http://www.per
kinelmer.com/microarray
层级聚类浏览器（Hierarchical Clustering Explorer）应用程序	美国马里兰大学，MD，USA	http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/