本文介绍了一种从李-佛美尼综合征（Li-Fraumeni Syndrome, LFS）患者来源的成纤维细胞诱导生成诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs），通过间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）将iPSCs分化为成骨细胞，并建立疾病模型的方法 体内 使用LFS患者来源的成骨细胞研究肿瘤发生。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
Li-Fraumeni综合征（LFS）是一种常染色体显性遗传性肿瘤综合征。LFS患者易患多种类型的肿瘤，包括骨肉瘤——儿童和青少年中最常见的原发性非血液系统恶性肿瘤之一。因此，LFS为研究该恶性肿瘤提供了理想的模型。利用诱导性多能干细胞（iPSC）技术，可通过将LFS患者的iPSC分化为间充质干细胞（MSCs），再进一步分化为成骨细胞——即骨肉瘤的起源细胞，从而成功构建与LFS相关的骨肉瘤疾病模型。这些来自LFS的成骨细胞重现了骨肉瘤的致瘤特性，为解析骨肉瘤的发病机制提供了一个极具吸引力的模型系统。本文展示了一种从LFS患者成纤维细胞生成iPSC、将iPSC分化为MSC、MSC分化为成骨细胞的实验方案，以及 体内 利用LFS成骨细胞研究肿瘤发生。该iPSC疾病模型可进一步用于鉴定LFS相关骨肉瘤的潜在生物标志物或治疗靶点。
引言
2006年至2007年间，山中伸弥（Shinya Yamanaka）博士和詹姆斯·A·汤姆森（James A. Thomson）博士的实验室取得了一系列突破性发现，从而推动了诱导性多能干细胞（iPSCs）的诞生1,2,3。通过使用特定的转录因子对体细胞进行重编程以生成iPSCs，研究人员成功获得了具有关键特性的细胞，即多能性和自我更新能力——这些特性此前被认为仅存在于人胚胎干细胞（hESCs）中。iPSCs可来源于任何个体或患者，且无需从胚胎中获取，极大地拓展了可用于研究的疾病种类和遗传背景。自那时起，源自患者的iPSCs已被用于重现多种人类疾病的表型，包括阿尔茨海默病4、肌萎缩侧索硬化症5以及长QT综合征6,7,8。
iPSC 研究的这些进展也为癌症研究开辟了新的途径。最近，多个研究团队已利用患者的 iPSC 构建了在易感遗传背景下癌症发展的模型9,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究已获得休斯顿德克萨斯大学健康科学中心（UTHealth）动物福利委员会批准。实验严格遵循UTHealth实验动物医学中心制定的标准进行。 & 护理（CLAMC），该机构已获得美国实验动物护理协会（AAALAC International）认证。本研究中的人类受试者属于情景A（"不涉及人类受试者研究"根据NIH SF424文件的定义，因此无需获得德克萨斯大学健康科学中心（UTHealth）人类研究伦理委员会的批准。
1. LFS 诱导多能干细胞的生成（图1A）
- 第 -2 天，将 2 × 104 个 LFS 患者成纤维细胞接种至 6 孔板的 1 个孔中，使用成纤维细胞培养基（表 1）在 37 °C、5% CO2 恒湿培养箱中培养。确保成纤维细胞在转导当天（第 0 天）达到 50–60% 的融合度。
- 第 0 天进行仙台病毒转导。操作时，将旧培养基更换为预热的成纤维细胞培养基。将商用仙台病毒重编程试剂盒（见材料表）置于冰上解冻。根据生产商说明书，用混合的仙台病毒感染 LFS 成纤维细胞。
- 转导细胞在成纤维细胞培养基中的维持（第 1–6 天）：
- 转导后第 1 天（即转导后 24 小时），移除含有残余仙....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本方案包含LFS iPSC的生成、MSC分化、成骨细胞分化等步骤 体内 使用LFS间充质干细胞来源的成骨细胞进行肿瘤发生检测。
使用市售仙台病毒重编程试剂盒将成纤维细胞重编程为LFS诱导性多能干细胞（iPSCs）的流程示意图见图1A。基于仙台病毒递送山中四因子的方法是一种非整合型重编程技术。因此，稳定的LFS iPSC克隆应不含有仙台病毒基因组，并且外源性OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC转基因应已丢失，可通过使用特异性引物进行RT-PCR检测来验证（图1B）。根据生产商说明书建议，获得无仙台病毒的iPSC依赖于培养条件和传代次数。在本实验方案所述的培养条件下，通常在传代10次后即可检测到iPSC中仙台病毒的清除（图1B）。所建立的LFS iPSC克隆.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
为了实现更高的间充质干细胞（MSC）分化效率，以下几个方面至关重要。其一是启动MSC分化前诱导多能干细胞（iPSCs）的培养条件。本文所述方案基于先前的研究9,17。iPSCs需要在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上培养至少2周。将iPSCs在MEFs上维持于良好状态，对于其在明胶包被培养板上的贴附以进行MSC分化至关重要。另一个重要方面是分化前iPSCs在MEFs上的密度。建议在iPSCs融合度达到80–90%时启动MSC分化。iPSCs过度生长会损害其在分化过程中的细胞存活率。最后一个关键点是启动MSC分化时的接种密度。根据我们的经验，较高的细胞密度有助于iPSCs在明胶包被培养板上的贴附。一个100 mm培养皿的iPSCs可接种至6孔板中的三个孔。若直接将iPSCs重悬并接种于MSC分化培养基中，会对iPSCs造成较大应激，因而偶尔会导致接种后严重的细胞死亡。较高的iPSCs密度可提高MSC分化的成功率。
与间充质干细胞的分化不同，成骨分化过程更为直接。为了获得.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
R. Z. 由德克萨斯大学健康科学中心癌症预防研究培训项目博士前奖学金（德克萨斯州癌症预防与研究所资助项目 RP160015）提供支持。J.T. 由中山大学附属第一医院启林计划提供支持。D.-F.L. 是癌症研究CPRIT学者，获得美国国立卫生研究院独立研究职业发展奖 R00 CA181496 及 CPRIT 资助项目 RR160019 的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 塑料器皿 | |||
| 100 mm 培养皿 | Corning | 430107 | |
| 60 mm 培养皿 | Corning | 430166 | |
| 6 孔板 | Falcon | 353046 | |
| 12 孔板 | Falcon | 353043 | |
| 48 孔板 | Falcon | 353078 | |
| 1 mL 移液器吸头 | USA Scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL 移液器吸头 | USA Scientific | 1111-0706 | |
| 10 µL 移液器吸头 | USA Scientific | 1111-3700 | |
| 5 mL 血清移液管 | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
| 10 mL 血清移液管 | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
| 25 mL 血清移液管 | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
| 50 mL 离心管，聚丙烯材质 | SARSTEDT | 62.547.100 | |
| 15 mL 离心管，聚丙烯材质 | SARSTEDT | 62.554.100 | |
| 培养材料与试剂 | |||
| CytoTune- iPS 2.0 Sendai 重编程试剂盒 | Invitrogen | A16517 | 商用 Sendai 病毒重编程试剂盒 |
| Corning hESC-合格基质 | Corning | 354277 | 基底膜基质 |
| CF1 MEFs，经辐照处理 | ThermoFisher | A34180 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
| αMEM | Corning | 10-022-CV | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | 商用诱导多能干细胞培养基 |
| KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
| FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
| KnockOut 血清替代物 | ThermoFisher | A3181502 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MEM 非必需氨基酸 | Corning | 25-025-CI | |
| L-谷氨酰胺溶液 | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 2-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） | PEPROTECH | 100-18B | |
| 重组人血小板源性生长因子-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
| β-甘油磷酸钠 | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | A4902 | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Dulbecco 磷酸盐缓冲液，1×（DPBS） | Corning | 21-031-CV | |
| StemMACS 传代溶液 XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | 商用传代溶液 |
| Accutase 细胞解离溶液 | Corning | 25-058-CI | 细胞解离溶液 |
| 噻唑紫精（ROCK 抑制剂） | Calbiochem | 420220 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| 胶原酶 II 型 | ThermoFisher | 17101015 | |
| 人 NANOG 抗体 | R&D System | AF1997 | |
| OCT4 抗体（H-134） | Santa Cruz | sc-9081 | |
| 人/小鼠 SSEA-4 PE 标记抗体 | R&D System | FAB1435P | |
| Alexa Fluor 555 小鼠抗人 TRA-1-81 抗原抗体 | DB Biosciences | 560123 | |
| Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG（H+L） | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG（H+L） | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| PE 标记小鼠抗人 CD105 抗体 | eBioscience | 12-1057-42 | |
| FITC 标记小鼠抗人 CD44 抗体 | DB Biosciences | 555478 | |
| PE 标记小鼠抗人 CD73 抗体 | DB Biosciences | 550257 | |
| PE 标记小鼠抗人 CD166 抗体 | DB Biosciences | 560903 | |
| FITC 标记小鼠抗人 CD24 抗体 | DB Biosciences | 555427 | |
| 驴血清 | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| 山羊血清 | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| 碱性磷酸酶染色试剂盒 II | Stemgent | 00-0055 | |
| 茜素红 S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| TRIzol 试剂 | ThermoFisher | 15596018 | |
| 氯仿 | ThermoFisher | C298-500 | |
| 2-丙醇 | ThermoFisher | A416-4 | |
| 乙醇，无水，分子生物学级 | ThermoFisher | BP28184 | |
| DNase I，无 RNase（1 U/µL） | ThermoFisher | EN0521 | |
| iScript cDNA 合成试剂盒 | BioRad | 1708891BUN | |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
| Matrigel 基质高浓度（HC），无酚红 | Corning | 354262 | |
| 1 mL 滑动接头注射器，26 号针头 × 5/8 英寸 | DB Biosciences | 309597 |
参考文献
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult h....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
