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方法文章

利用Li-Fraumeni综合征患者来源的诱导性多能干细胞建立骨肉瘤模型

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DOI:

10.3791/57664

2018年6月13日

本文内容

摘要

本文介绍了一种从李-佛美尼综合征(Li-Fraumeni Syndrome, LFS)患者来源的成纤维细胞诱导生成诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs),通过间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)将iPSCs分化为成骨细胞,并建立疾病模型的方法 体内 使用LFS患者来源的成骨细胞研究肿瘤发生。

摘要

Li-Fraumeni综合征(LFS)是一种常染色体显性遗传性肿瘤综合征。LFS患者易患多种类型的肿瘤,包括骨肉瘤——儿童和青少年中最常见的原发性非血液系统恶性肿瘤之一。因此,LFS为研究该恶性肿瘤提供了理想的模型。利用诱导性多能干细胞(iPSC)技术,可通过将LFS患者的iPSC分化为间充质干细胞(MSCs),再进一步分化为成骨细胞——即骨肉瘤的起源细胞,从而成功构建与LFS相关的骨肉瘤疾病模型。这些来自LFS的成骨细胞重现了骨肉瘤的致瘤特性,为解析骨肉瘤的发病机制提供了一个极具吸引力的模型系统。本文展示了一种从LFS患者成纤维细胞生成iPSC、将iPSC分化为MSC、MSC分化为成骨细胞的实验方案,以及 体内 利用LFS成骨细胞研究肿瘤发生。该iPSC疾病模型可进一步用于鉴定LFS相关骨肉瘤的潜在生物标志物或治疗靶点。

引言

2006年至2007年间,山中伸弥(Shinya Yamanaka)博士和詹姆斯·A·汤姆森(James A. Thomson)博士的实验室取得了一系列突破性发现,从而推动了诱导性多能干细胞(iPSCs)的诞生1,2,3。通过使用特定的转录因子对体细胞进行重编程以生成iPSCs,研究人员成功获得了具有关键特性的细胞,即多能性和自我更新能力——这些特性此前被认为仅存在于人胚胎干细胞(hESCs)中。iPSCs可来源于任何个体或患者,且无需从胚胎中获取,极大地拓展了可用于研究的疾病种类和遗传背景。自那时起,源自患者的iPSCs已被用于重现多种人类疾病的表型,包括阿尔茨海默病4、肌萎缩侧索硬化症5以及长QT综合征6,7,8

iPSC 研究的这些进展也为癌症研究开辟了新的途径。最近,多个研究团队已利用患者的 iPSC 构建了在易感遗传背景下癌症发展的模型9,

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方案

本研究已获得休斯顿德克萨斯大学健康科学中心(UTHealth)动物福利委员会批准。实验严格遵循UTHealth实验动物医学中心制定的标准进行。 & 护理(CLAMC),该机构已获得美国实验动物护理协会(AAALAC International)认证。本研究中的人类受试者属于情景A("不涉及人类受试者研究"根据NIH SF424文件的定义,因此无需获得德克萨斯大学健康科学中心(UTHealth)人类研究伦理委员会的批准。

1. LFS 诱导多能干细胞的生成(图1A

  1. 第 -2 天,将 2 × 104 个 LFS 患者成纤维细胞接种至 6 孔板的 1 个孔中,使用成纤维细胞培养基(表 1)在 37 °C、5% CO2 恒湿培养箱中培养。确保成纤维细胞在转导当天(第 0 天)达到 50–60% 的融合度。
  2. 第 0 天进行仙台病毒转导。操作时,将旧培养基更换为预热的成纤维细胞培养基。将商用仙台病毒重编程试剂盒(见材料表)置于冰上解冻。根据生产商说明书,用混合的仙台病毒感染 LFS 成纤维细胞。
  3. 转导细胞在成纤维细胞培养基中的维持(第 1–6 天):
    1. 转导后第 1 天(即转导后 24 小时),移除含有残余仙....

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结果

本方案包含LFS iPSC的生成、MSC分化、成骨细胞分化等步骤 体内 使用LFS间充质干细胞来源的成骨细胞进行肿瘤发生检测。

使用市售仙台病毒重编程试剂盒将成纤维细胞重编程为LFS诱导性多能干细胞(iPSCs)的流程示意图见图1A。基于仙台病毒递送山中四因子的方法是一种非整合型重编程技术。因此,稳定的LFS iPSC克隆应不含有仙台病毒基因组,并且外源性OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC转基因应已丢失,可通过使用特异性引物进行RT-PCR检测来验证(图1B)。根据生产商说明书建议,获得无仙台病毒的iPSC依赖于培养条件和传代次数。在本实验方案所述的培养条件下,通常在传代10次后即可检测到iPSC中仙台病毒的清除(图1B)。所建立的LFS iPSC克隆.......

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讨论

为了实现更高的间充质干细胞(MSC)分化效率,以下几个方面至关重要。其一是启动MSC分化前诱导多能干细胞(iPSCs)的培养条件。本文所述方案基于先前的研究9,17。iPSCs需要在小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)上培养至少2周。将iPSCs在MEFs上维持于良好状态,对于其在明胶包被培养板上的贴附以进行MSC分化至关重要。另一个重要方面是分化前iPSCs在MEFs上的密度。建议在iPSCs融合度达到80–90%时启动MSC分化。iPSCs过度生长会损害其在分化过程中的细胞存活率。最后一个关键点是启动MSC分化时的接种密度。根据我们的经验,较高的细胞密度有助于iPSCs在明胶包被培养板上的贴附。一个100 mm培养皿的iPSCs可接种至6孔板中的三个孔。若直接将iPSCs重悬并接种于MSC分化培养基中,会对iPSCs造成较大应激,因而偶尔会导致接种后严重的细胞死亡。较高的iPSCs密度可提高MSC分化的成功率。

与间充质干细胞的分化不同,成骨分化过程更为直接。为了获得.......

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

R. Z. 由德克萨斯大学健康科学中心癌症预防研究培训项目博士前奖学金(德克萨斯州癌症预防与研究所资助项目 RP160015)提供支持。J.T. 由中山大学附属第一医院启林计划提供支持。D.-F.L. 是癌症研究CPRIT学者,获得美国国立卫生研究院独立研究职业发展奖 R00 CA181496 及 CPRIT 资助项目 RR160019 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
塑料器皿
100 mm 培养皿Corning430107
60 mm 培养皿Corning430166
6 孔板Falcon353046
12 孔板Falcon353043
48 孔板Falcon353078
1 mL 移液器吸头USA Scientific1111-2721
200 µL 移液器吸头USA Scientific1111-0706
10 µL 移液器吸头USA Scientific1111-3700
5 mL 血清移液管SARSTEDT86.1253.001
10 mL 血清移液管SARSTEDT86.1254.001
25 mL 血清移液管SARSTEDT86.1685.001
50 mL 离心管,聚丙烯材质SARSTEDT62.547.100
15 mL 离心管,聚丙烯材质SARSTEDT62.554.100
培养材料与试剂
CytoTune- iPS 2.0 Sendai 重编程试剂盒InvitrogenA16517商用 Sendai 病毒重编程试剂盒
Corning hESC-合格基质Corning354277基底膜基质
CF1 MEFs,经辐照处理ThermoFisherA34180
DMEMSigma-AldrichD5671
DMEM/F12Corning10-090-CV
αMEMCorning10-022-CV
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368商用诱导多能干细胞培养基
KnockOut DMEM/F-12ThermoFisher12660012
FBS Opti-GoldGenDEPOTF0900-050
KnockOut 血清替代物ThermoFisherA3181502
青霉素-链霉素Sigma-AldrichP4333
MEM 非必需氨基酸Corning25-025-CI
L-谷氨酰胺溶液Sigma-AldrichG7513
2-巯基乙醇Sigma-AldrichM3148
人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)PEPROTECH100-18B
重组人血小板源性生长因子-ABPEPROTECH100-00AB
β-甘油磷酸钠Sigma-AldrichG9422
地塞米松Sigma-AldrichA4902
抗坏血酸Sigma-AldrichA5960
Dulbecco 磷酸盐缓冲液,1×(DPBS)Corning21-031-CV
StemMACS 传代溶液 XFMiltenyi Biotec130-104-688商用传代溶液
Accutase 细胞解离溶液Corning25-058-CI细胞解离溶液
噻唑紫精(ROCK 抑制剂)Calbiochem420220
0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液Sigma-AldrichT4049
胶原酶 II 型  ThermoFisher17101015
人 NANOG 抗体R&D SystemAF1997
OCT4 抗体(H-134)Santa Cruzsc-9081
人/小鼠 SSEA-4 PE 标记抗体R&D SystemFAB1435P
Alexa Fluor 555 小鼠抗人 TRA-1-81 抗原抗体DB Biosciences560123
Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG(H+L)Jackson ImmunoResearch705-545-003
Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG(H+L)Jackson ImmunoResearch111-545-144
PE 标记小鼠抗人 CD105 抗体eBioscience12-1057-42
FITC 标记小鼠抗人 CD44 抗体DB Biosciences555478
PE 标记小鼠抗人 CD73 抗体DB Biosciences550257
PE 标记小鼠抗人 CD166 抗体DB Biosciences560903
FITC 标记小鼠抗人 CD24 抗体DB Biosciences555427
驴血清Jackson ImmunoResearch017-000-121
山羊血清Jackson ImmunoResearch005-000-121
碱性磷酸酶染色试剂盒 IIStemgent00-0055
茜素红 SSigma-AldrichA5533
TRIzol 试剂ThermoFisher15596018
氯仿ThermoFisherC298-500
2-丙醇ThermoFisherA416-4
乙醇,无水,分子生物学级ThermoFisherBP28184
DNase I,无 RNase(1 U/µL)ThermoFisherEN0521
iScript cDNA 合成试剂盒BioRad1708891BUN
iQ SYBR Green SupermixBioRad1708884
Matrigel 基质高浓度(HC),无酚红Corning354262
1 mL 滑动接头注射器,26 号针头 × 5/8 英寸DB Biosciences309597

参考文献

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult h....

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重印与许可

标签

iPSC S