小鼠经口咽部吸入式呼吸机相关及医院获得性细菌性肺炎模型

摘要

感染性肺炎是人类最常见的感染之一。合适的体内模型对于理解疾病发病机制和测试新型治疗药物的疗效至关重要。利用这种小鼠经口咽部吸入性肺炎模型，可研究此类致命感染的发病机制并评估新的治疗方法。

摘要

小鼠感染模型对于理解疾病发病机制以及测试旨在对抗致病病原体的新型治疗手段的有效性至关重要。感染性肺炎是临床患者中最常见的感染之一，因此需要建立合适的体内模型。典型的肺炎模型采用经鼻接种方式，但这种方法会将过量的病原体沉积于肺外，导致靶外并发症和症状，例如鼻窦炎、胃炎、肠炎、物理性损伤，或通过微粒雾化模拟更接近病毒性、结核性或真菌性肺炎的气溶胶传播。这些模型无法准确反映典型的社区获得性或医疗机构相关性细菌性肺炎的发病过程。相比之下，本研究所描述的小鼠口咽部吸入性肺炎模型可模拟医疗机构相关性肺炎中的飞沫传播途径。将50 µL细菌悬液接种至麻醉小鼠的口咽部，可引发反射性吸入，从而导致肺炎。利用该模型，研究人员可深入探究引起肺炎的病原体的致病机制，并评估针对这些疾病的新疗法。

引言

下呼吸道感染是全球致死率最高的传染性疾病，也是发展中国家最常见的死亡原因¹。全球范围内，此类感染每年导致超过320万人死亡¹。此外，医院获得性肺炎是最常见且最致命的医疗相关感染之一，通常由最具抗生素耐药性的病原体引起^2,3。无论是社区获得性肺炎还是医院获得性肺炎，其典型的细菌性肺炎感染途径均为口咽部分泌物误吸入肺泡。目前用于研究这些疾病的鼠类模型常采用鼻内接种方式⁴，但该方法会将大部分细菌沉积于肺外，导致鼻窦炎和物理性损伤等非靶向并发症和症状，与这些模型本应模拟的人类疾病进展过程不符。其他模型可能使用吸入舱或微雾化装置，这些方法能更准确地模拟病毒性、结核性及真菌性肺炎，却无法真实再现典型细菌性肺炎的正常感染途径。

小鼠经口咽部吸入性肺炎模型可用于模拟细菌性肺炎的自然感染途径及发病机制。通过移液器将50 µL细菌悬液接种至麻醉小鼠的口咽部，可引发反射性吸入，从而导致感染性肺炎。利用该模型，研究人员能够以更高保真度、更接近人类吸入性肺炎感染的方式，研究肺炎致病菌的发病机制以及针对这些疾病的新型治疗方法。此外，与通过口腔感染的类似模型^5,

方案

所有涉及动物的操作均须获得研究人员所在机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 细菌接种物的制备

1. 分离细菌菌落。
   1. 划线接种一种细菌菌株（例如, A. baumannii “HUMC1”) 接种于适当的无菌琼脂培养基上（例如，胰蛋白酶大豆琼脂），注意划线分离以获得单菌落。
   2. 在适当条件下孵育（例如，37 °C 过夜。
2. 过夜培养
   1. 从琼脂平板上选择一个具有代表性的孤立菌落，用无菌接种环挑取，并接种于10 mL相应的无菌液体培养基中（例如胰蛋白胨大豆肉汤
   2. 在适当条件下让样品达到稳定期（例如37 °C、200 rpm 振荡培养过夜，使用带透气盖的 50 mL 锥形管。
3. 进行继代培养。
   1. 用移液器将100 μL过夜培养物转移至10 mL新鲜无菌肉汤中。
   2. 在适当条件下培养至对数生长期例如，37 °C、200 rpm 振荡培养3小时，使用带通气盖的50 mL锥形管。
4. 洗涤继代培养物。
   1. 从培养环境中取出传代培养物。
   2. ....

结果

通过严格遵循实验方案，可轻松获得可重复且可靠的数据。为了使实验之间具有可比性，必须严格遵守自定义的接种物制备方案。在感染操作过程中，正确处理小鼠也至关重要。务必先将小鼠放入不含异氟烷的麻醉舱中。如果将小鼠直接放入预先充满异氟烷的麻醉舱，它们会惊慌失措，并可能承受过度应激，从而可能影响实验结果。在盖紧容器盖后，应逐步将异氟烷浓度从0%缓慢增加至4%（v/v）；快速给予异氟烷同样可能导致小鼠恐慌。当小鼠失去意识后，将异氟烷浓度降低至2–3%（v/v），并让其在舱内继续维持数分钟。此时，小鼠已准备好进行感染（图1）。

将小鼠从麻醉室中取出，并用其上门齿将其悬挂，以便接触舌头（图2）。使用钝头镊子轻轻拉出舌头（图3），然后将夹持着舌头的镊子转移至无菌手套包裹的手指上（

讨论

诚然，小鼠并非微型人类。从小鼠模型中获得的结果必须结合具体背景进行考量，并根据小鼠与人类之间的差异和相似之处，判断其对人类的适用性⁶。此外，选择合适的小鼠品系至关重要，因为不同品系对某些感染的易感性存在差异；所选用的病原体菌株同样如此¹⁶。

必须以严谨且高度可重复的方式进行感染操作。接种物在某一剂量下可能对小鼠具有致死性，而在该剂量的90%时却可能完全无害。因此，本方案中列出的所有条件都必须以完全相同的方式重现，尤其是在制备接种物和实施感染时。此外，每种病原体在不同接种剂量下会引起不同程度的疾病。因此，有必要通过预实验确定每种病原体菌株在每种小鼠品系中的合适接种剂量。

对于革兰氏阴性菌，每只小鼠接种量≤5 × 10⁸ CFU已足以导致毒力强的菌株引发死亡。不建议使用在每只小鼠≤1 × 10⁹ CFU剂量下仍无致死效应的菌株，因为这表明所接种至肺部的菌量本身可能不足以真实反映其在发病机制中的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	BD	214530	与胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）混合制备胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）
硼硅酸盐玻璃珠	Kimble	135003	每次使用前通过烘烤或高压灭菌进行灭菌
烧杯，250 mL	Pyrex	1003	用于精确分装高浓度细菌接种物
离心机	Sorvall	ST 40R	可在 4×g 和 4°C 条件下运行
麻醉室	Kent Scientific Corporation	VetFlo-0720	最多可容纳 5 只小鼠
冷冻模具，中等尺寸	Sakura Tissue-Tek	4566	一次性乙烯基标本模具，15×15×5 mm
牙线	Oral-B	37000469537	系于距实验台高度约 6" 的稳固柱上
镊子	VWR	82027-440	用于轻柔地将小鼠舌头拉出口腔
肺组织匀浆器	Omni International	TM125-115	首次使用前进行高压灭菌；样品间需冲洗
用于麻醉的异氟烷	Abbott	10015516	可使用其他替代药物；相应调整操作步骤
iSTAT 检测卡	Abbott	03P79-25	提供多种型号以满足不同需求
氯胺酮，100 mg/mL	Western Medical Supply	4165	用 PBS 稀释 1:10 至 1 mg/mL，并与浓度为 1 mg/mL 的赛拉嗪混合使用
眼部软膏	Akorn	Tears Renewed	避免 dispenser 尖端接触眼睛
最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂	Fisher Scientific	23-730-571	用于在 -80 °C 下冷冻肺组织样本，以便进行病理切片
培养皿	VWR	25384-302	聚苯乙烯材质，一次性，已灭菌，100×15 mm
磷酸盐缓冲液（PBS）	Corning	21-031-CM	不含钙和镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）
移液器吸头，200-μL	VWR	10017-044	使用前进行高压灭菌
移液器，200-μL	Gilson	Pipetman P200	使用前进行高压灭菌并校准
细菌涂布棒	Bel-Art	F377360006	每次使用前通过烘烤或高压灭菌进行灭菌
磁力搅拌子，直径 7.9 mm × 长度 38.1 mm	VWR	58948-150	用于分装过程中搅拌高浓度细菌接种物
磁力搅拌器	Corning	PC-620D	用于分装过程中搅拌高浓度细菌接种物
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）	BD	211822	与琼脂混合制备 TSA
锥形瓶，无菌，50 mL	Corning	431720	用于制备细菌接种物
锥形瓶，无菌，500 mL	Corning	431123	用于浓缩接种物以制备冷冻接种物
冻存管，2.0 mL	Corning	430659	用于高浓度细菌接种物的低温保存
赛拉嗪，20 mg/mL	Akorn	AnaSed Injection	用 PBS 稀释 1:20 至 1 mg/mL，并与浓度为 1 mg/mL 的氯胺酮混合使用