本研究中，我们展示了一种利用螺旋惯性微流控闭环操作从临床呼吸道分泌物中无标记分离中性粒细胞的方法。该方法有望拓展临床 体外 用于多种呼吸系统疾病的检测方法
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本文内容
摘要
摘要
气道分泌物中含有大量与免疫相关的细胞，例如中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞，这些细胞可作为研究和临床评估多种肺部疾病的重要资源。然而，由于患者黏液具有异质性和高黏性，目前尚无可靠的解离方法能在不损伤患者气道分泌物中宿主免疫细胞的前提下进行处理。本研究介绍了一种利用惯性微流控技术进行患者免疫评估的样本制备方法。无论临床样本的流体性质如何异质，该方法均可从经数毫升洁净生理盐水稀释1,000倍的气道分泌物样本中回收超过95%的中性粒细胞。通过将浓缩后的输出流重新循环至初始样品储液池，可实现免疫细胞的高浓度、高回收率和高纯度；这种循环操作被视为对惯性微流控单次注射驱动运行的一种权衡。螺旋微流控的闭环操作可在无物理或化学干扰的情况下分离白细胞，这一点已通过经分选中性粒细胞在佛波酯（PMA）诱导下的弹性蛋白酶释放实验得到验证。
引言
由于气道分泌物中的细胞被大量黏液包裹，通过常规方法对白细胞功能进行评估存在困难。 体外 检测一直受到阻碍。二硫苏糖醇（DTT）是最常用的裂解缓冲液，可用于解离和均质化痰液，以便进行细胞学分析和介质检测，同时保持分离细胞的可耐受存活率1,2然而，DTT 可能会干扰气道中性粒细胞表面结合的抗原，导致中性粒细胞功能受损，例如弹性蛋白酶和髓过氧化物酶（MPO）的释放受到影响2,3因此，关于人类呼吸道中性粒细胞功能的研究较少采用外周血中性粒细胞，而外周血中性粒细胞可能无法反映肺部中性粒细胞的生理特性4与此同时，惯性微流控技术在从各类患者生物基质中分离细胞方面取得了进展5,6惯性升力与迪恩阻力之间的平衡根据颗粒/细胞的大小使其排列，从而实现无标记的颗粒分离7我们课题组先前介绍了一种循环肿瘤细胞的样本制备方法8,9血液中的病原体8，悬浮培养中的细胞10,11,12以及来自血液的多形核白细胞（PMNs）13,14.
本文介绍了一种利用闭环惯性微流控技术从患者呼吸道分泌物中分离免疫细胞的实验方案，可用于后续分析 体外 检测，例如中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）检测。该方法在细胞/颗粒的侧向存在显著重叠的情况下仍能实现高浓度和高回收率，这种情况在临床样本中较为常见。通过将内壁（IW）聚焦的大颗粒或细胞重新循环回输入样本管，目标颗粒或细胞在原始储液池中富集，而含有小黏蛋白聚集体的背景液体则流入废液储液池。尽管临床样本具有异质性的流体特性，该方法在将呼吸道分泌物样本用洁净生理盐水稀释1,000倍（约1 mL）后，仍能稳定回收超过95%的中性粒细胞。相比之下，裂解法的多形核白细胞（PMNs）回收率则因样本状态不同而波动较大。本方案以无标记方式捕获白细胞，且不造成物理或化学损伤，从而为通过微创手段从临床难以处理的生物样本中获取敏感细胞提供了可能。
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方案
样本采集已获得匹兹堡大学机构审查委员会批准（IRB# PRO16060443，PRO10110387）。所有实验均在生物安全柜内进行，并穿戴适当的个人防护装备。
1. 器件制备与软光刻技术
注意：采用标准的软光刻技术15,16 制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道。
- 按10:1的基料与固化剂比例混合PDMS预聚物。
- 将30 g PDMS预聚物混合物倒入微加工的铝制模具中（尺寸见图1），并将20 g PDMS预聚物混合物倒入100 mm培养皿中。
注：培养皿用于制备较厚的PDMS薄膜（约3 mm），作为支撑层。PDMS支撑层可使微流控芯片整体具有均匀的物理表面特性。也可使用玻璃载片上的薄PDMS膜。具有特定通道尺寸的母模通过在铝板上进行微铣削加工设计和制造。本研究中使用的螺旋通道为8圈螺旋微通道，具有一个入口和两个出口，半径从8 mm增加至24 mm，以实现高效的基于尺寸的分离。 - 将模具和培养皿放入真空干燥器中脱气，直至表面无可见气泡，通常需要5–10分钟。使用实验室真空泵为干燥器提供真空。
- 释放真空，将模具和培养皿放入90 °C烘箱中加热1小时。
注：可使用加热板或其他加热装置替代烘箱。 - 从烘箱中取出模具和培养皿，在室温下冷却10分钟。
- 使用2 mm打孔器小心地沿轮廓切割并打穿流体通路孔。
注：打孔尺寸可根据所用管路或流体导管的尺寸进行调整。 - 将胶带贴附在器件的通道面和PDMS厚膜表面，然后用镊子小心剥离，以去除灰尘。
- 对器件的通道面和普通PDMS表面进行空气等离子体处理，并与预先制备的普通PDMS支撑层键合（图1A）。
- 将芯片置于50 mm × 70 mm的玻璃载片上，并放入70 °C烘箱中至少30分钟，以增强键合强度。
2. 从机械通气患者收集气管分泌物
注意：可通过改良的传统方法，从接受机械通气的成年患者在常规气道护理期间获取气管分泌物样本。样本去标识化后立即送检处理。
- 若需进行气管抽吸，应使用导管抽取气道分泌物。
- 将导管小心送入气管插管约一半深度，然后从预装的10 mL注射器中注入5 mL的0.9%无菌生理盐水。
- 当导管完全推进或遇到阻力时，抽吸分泌物并收集至无菌痰液收集容器中。
- 在无菌痰液容器中收集10 mL气管分泌物，并置于冰上。立即将样本送检进行处理。
3. 气管分泌物样本制备
注意：所有实验必须在生物安全柜中进行，并佩戴适当的个人防护装备。
- 使用塑料10 mL注射器将1 mL呼吸道分泌物样本分散于9 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中（进行10倍稀释）。使用钝头移液器混匀黏液样本。
- 用40 µm尼龙细胞滤网过滤稀释液，以去除大块组织或血凝块，防止堵塞微流控装置的进样孔或通道。处理后将样本置于冰上。
- 将每个样本的稀释液再用100倍体积的PBS缓冲液分散，最终获得1,000倍稀释的悬浮液。在整个解离操作过程中，将样本置于冰上。
4. 实验设置
注意：所有实验必须在生物安全柜中进行，并佩戴适当的个人防护装备。
- 组装PDMS芯片与流体导引装置，以向四个螺旋微通道施加均匀流速（图1B）。
注：采用四个通道可通过并行处理提高通量，同时优化最终悬浮液的体积和细胞密度。流体导引装置采用立体光刻型3D打印机使用透明树脂设计和制造。流体导引装置的入口和出口端口采用雌性鲁尔接头，便于连接并在操作过程中实现稳定密封。 - 将1/16英寸雄性鲁尔接头连接至流体导引装置的入口、内壁（IW）出口和外壁（OW）出口端口，并将硅胶管连接至样品悬浮液。
- 在入口和各出口的两端插入钝头接头，使其到达样品储液池底部。
- 将蠕动泵与入口管路连接。
- 将入口管路和IW出口管路的末端置于样品储液池中，将OW出口管路的末端置于废液储液池中（图1C，D）。
- 将50 mL不含钙和镁的过滤PBS管置于样品储液池中。
- 以低流速（约1 mL/min）启动泵，对装置进行预灌注。
注：当通道中捕获气泡时，用镊子轻压通道顶部以破坏并排除气泡。当装置完全充满缓冲液后，更换PBS管，准备气道分泌物样品管。 - 当样品置于样品储液池中后，开启蠕动泵并将流速设定为4 mL/min（图1C，D）。
- 当样品体积达到指定体积（约1 mL）时，停止操作并断开硅胶管。
注：该方法在将大量稀释液（>50 mL）浓缩至微量离心管体积（约1 mL）方面更具效率（图2）。
5. 流式细胞术分析
注意：为了比较解离方法（微流控与裂解），采用了免疫荧光流式细胞术。
- 向初始悬液（步骤 3.3）和所得悬液（步骤 4.9）中加入异硫氰酸荧光素（FITC）标记的小鼠抗人 CD66b 单克隆抗体和别藻蓝蛋白（APC）标记的小鼠抗人 CD45 单克隆抗体（每种抗体各 200 µL），体积比为 1:25。
- 将样品在 4 °C 避光孵育 30 分钟。
- 使用流式细胞仪分析两个样品，以定量中性粒细胞（PMNs）。
注意：FITC-APC 双阳性、CD66b 阳性且 CD45 阳性的细胞群体被视为中性粒细胞。回收率通过输入悬液与所得悬液中总细胞数的比值计算。
6. NE 释放分析
注意：为了比较微流控法和裂解法分离的中性粒细胞的功能，使用了中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）检测试剂盒。
- 向每个所得的悬液（步骤 4.9 获得）中加入检测试剂盒中提供的 PMA，使其终浓度为 50 nM。
- 将样品在 37 °C 下孵育 2 小时。
- 将悬液在 300 × g 下离心 10 分钟。
- 取每份上清液 10 µL 转移至 96 孔板（试剂盒中提供）。
注意：也可使用平底黑色聚苯乙烯 96 孔微孔板。 - 向每个孔中加入 90 µL 稀释后的检测缓冲液（试剂盒中提供）。
- 加入 10 µL 弹性蛋白酶底物（Z-Ala-Ala-Ala-Ala 2Rh110，试剂盒中提供）。
- 在 37 °C 下孵育 1.5 小时。
- 使用荧光计在激发波长 485 nm 和发射波长 525 nm 下读取 96 孔板。
注意：中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）水平需除以流式细胞术分析获得的 PMN 细胞计数。
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结果
通过DTT黏液溶解法和微流控解离法，我们均获得了透明的免疫细胞悬液（图3A）。微流控解离法在1 mL无菌悬液中，从稀释1,000倍（总体积50 mL）的气道分泌物样本中平均回收了4.40 × 105个中性粒细胞（PMNs）（2.1 × 104 至 5.60 × 105个PMNs，n = 6）。与初始稀释液相比，在6个临床样本中，94.0%的中性粒细胞（CD66b+/CD45+）被稳定地富集于小体积悬液中。然而，DTT黏液溶解法的平均回收率为53.5%，且样本间差异显著（30.8%–96.0%）（图3B）。
接下来，使用一种商用中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）检测试剂盒进行概念验证，检测弹性蛋白酶的释放情况。在无外界刺激条件下，采用...
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讨论
在惯性微流控技术中，颗粒和细胞会根据其尺寸在微通道内的特定横向位置上实现定位5,18,19,20。由于弯曲微通道中迪恩拖曳力与惯性升力的共同作用，在特定流速条件下，较大颗粒或中性粒细胞（>10 µm）会位于通道内侧，而较小的颗粒、黏液聚集体以及小于6 µm的碎片则被定位在通道外侧10,11,13,14。
然而，在使用微流控技术时，分离的浓度与回收率之间存在权衡，特别是当目标颗粒或细胞的分离尺寸范围与其他细胞/颗粒重叠时。为了获得高浓度的分选颗粒和细胞，需要较窄的分离范...
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披露
作者已就本文所述技术申请了专利。
致谢
本工作得到了美国国立卫生研究院/过敏与传染病研究所（NIH/NIAID，项目编号R21AI119042）以及美国国立卫生研究院U24样本节约检测项目（U24-AI118656）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PDMS预聚体 | 道康宁 | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 基础剂与固化剂按10:1的比例混合 |
| VWR 重力对流烘箱 | VWR | 414005-128 | 待固化的PDMS预聚物，90度 |
| 100毫米培养皿 | VWR | 89000-324 | PDMS 支撑层的制备 |
| Harris Uni-core 打孔器 | Sigma-Aldrich | WHAWB100076 | 2毫米直径或其他尺寸，具体取决于导管大小 |
| 空气等离子机 | 飞秒科学 | 可爱 | PDMS 装置与底部基底的表面等离子体处理 |
| 2” x 3” 载玻片 | TED PELLA, INC. | 2195 | 用于支撑PDMS装置 |
| Masterflex 卷装铂金硫化硅胶管，L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | 用于微流控和蠕动泵的管路 |
| 1/16英寸鲁尔接头，雄性 | 哈佛仪器 | PC2 72-1443 | 流体导引连接器 |
| 50 mL Falcon管 | 康宁 | 21008-940 | 样本采集 &和制备 |
| 不含钙和镁的1×磷酸盐缓冲液 | 康宁 | 45000-446 | 用于稀释样品的缓冲液 |
| Halyard 密闭吸痰导管，肘型，14F/通道 4.67 mm | HALYARD HEALTH | 22113 | 气管分泌物吸痰导管 |
| 0.9% 无菌生理盐水，10 mL 预充式注射器 | BD PosiFlush | NHRIC：8290-306547 | 用于患者气管分泌物采集 |
| SecurTainer™ III 型标本容器，20 mL | Simport | 1176R36 | 无菌痰液（呼吸道分泌物）采集容器 |
| 带鲁尔锁扣针头的注射器，10 mL | BD | BD309604 | 用移液器吹打混匀黏液样本，并触及样本管底部 |
| BD 钝端填充针，带BD鲁尔锁 提示 | BD | 用移液器吹打混匀黏液样本，并触及样本管底部 | |
| 40µm 尼龙细胞滤网 | Falcon | 21008-949 | 为去除可能堵塞微流控装置进样孔或通道的大块组织或血凝块。 |
| 蠕动泵（Masterflex L/S Digital Drive） | Cole-Parmer | HV-07522-30 | 微流控操作 |
| BD LSR II 流式细胞仪 | BD生物科学 | LSR II 流式细胞仪 | 细胞回收率的定量分析 |
| 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的小鼠抗人CD66b单克隆抗体 | BD 生物科学 | 561927 | 中性粒细胞免疫染色用于流式细胞仪分析 |
| APC标记的小鼠抗人CD45单克隆抗体 | BD生物科学 | 561864 | 中性粒细胞免疫染色用于流式细胞仪分析 |
| 酶标仪 | 赛默飞世尔科技 | Varioskan | 用于中性粒细胞弹性蛋白酶检测的酶标仪，激发波长485 nm，发射波长525 nm |
| 中性粒细胞弹性蛋白酶检测试剂盒 | Cayman Chemical | 600610 | 中性粒细胞功能评估 |
| Fluoresbrite YG 微球 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | 用于在微流控中显示白细胞轨迹的荧光颗粒 |
参考文献
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