本文介绍了一种利用植物病原菌Magnaporthe grisea检测植物致病性的实验方案。该报告将有助于对真菌分离物的致病型进行大规模筛选，并为在分子育种过程中深入理解植物抗性机制提供理想的起点。
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方法文章
植物感染试验：喷雾与伤口介导接种植物病原菌 Magnaporthe Grisea
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
植物具有一套强大的防御系统，可抵御病原真菌带来的潜在威胁。然而，对于具有重要农业价值的植物而言，目前防治此类病原体的措施过于保守，因而效果不够理想，并可能带来环境风险。因此，迫切需要鉴定宿主抗性因子，通过抗性种质资源的筛选、抗性基因的分离与表征以及抗性品种的分子育种，来自然地控制植物病害。为此，有必要建立一种准确、快速且可大规模应用的接种方法，以培育和开发植物抗性基因。稻瘟病菌 Magnaporthe grisea 可引起严重的病害症状并导致产量损失。近年来，M. grisea 已成为研究植物与真菌病原体互作机制的模式生物。因此，本文报道了一种针对 M. grisea 的植物致病性检测方法。该方法包括分生孢子悬浮液喷雾接种，以及菌丝块或分生孢子悬浮液滴加的创伤接种。离体水稻叶片创伤接种的关键步骤是在叶片上制造伤口，从而避免宿主穿透抗性带来的干扰。该喷雾/创伤接种方案有助于对 M. grisea 分离物的致病型进行快速、准确和大规模的筛选。这种整合式、系统化的植物感染方法将为全面理解植物病理学中的各类问题提供一个极佳的起点。
引言
由M. grisea引起的稻瘟病是全球水稻品种中最严重的病害之一1,2。M. grisea侵染寄主植物的过程包括分生孢子的产生和表面附着、分生孢子萌发及附着胞形成、侵入栓的形成和侵染菌丝分化，以及病害的扩散3。这些阶段在许多其他植物病原真菌中普遍存在，事实上，任一阶段受阻均可阻止对寄主植物的侵染。由于其重要的经济意义和良好的遗传操作性，M. grisea已成为研究植物-真菌病原体互作机制的模式生物1,4。因此，研究M. grisea这些发育阶段的分子基础，将有助于阐明真菌致病性的分子机制，并为筛选和设计新型杀菌剂提供候选靶基因5。
近期关于M. grisea感染的研究主要集中在侵染前阶段的分子机制，特别是分生孢子形成、附着胞形成、侵入钉的产生以及侵染性生长过程3,6。因此，建立一套详细的M. grisea侵染检测实验方案至关重要....
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方案
1. 使用M. grisea分生孢子悬浮液进行喷雾接种
- 稻瘟病菌（M. grisea）的真菌培养
- 制备燕麦番茄琼脂（OTA）培养基用于真菌菌株培养。
- 称取30–50 g燕麦片，加入800 mL去离子水（ddH2O），在电热锅中煮沸30分钟。
- 用纱布将煮过的燕麦汁过滤至烧杯中。
- 向烧杯中的滤液加入150 mL番茄汁和20 g琼脂，并用ddH2O定容至1,000 mL。
- 实验材料的准备
- 将约50粒水稻（Oryza sativa）品种丽江新团黑谷（LTH）种子在ddH2O中浸泡3天，或约50粒大麦（Hordeum vulgare cv Golden Promise）种子在ddH2O中浸泡约1天。
- 将水稻或大麦种子用湿润纱布包裹，置于约30个直径为10 cm × 10 cm的培养皿中的湿润滤纸上，在28 °C下萌发。水稻种子萌发时间约为2–3天，大麦种子萌发时间约为2天。温室相对湿度约为70%。
- 将水稻或大麦幼苗种植于经高压灭菌的盆栽土中，浇水后覆盖一层蛭石。
- 将植株....
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结果
该技术的完整工作流程如下所示 图1植物侵染试验在14天龄的感病水稻幼苗上进行（O. sativa cv CO-39）或感病的7天龄大麦叶片（H. vulgare cv Golden Promise7,8,9为了检测水稻叶片上的感染情况，使用分生孢子悬浮液（1.0 × 105 孢子/毫升）的 M. grisea 野生型菌株P131和Com1基因缺失突变体菌株经制备后，喷施于14天龄感病型CO-39幼苗的叶鞘上，随后将幼苗置于湿润培养箱中培养5天10P131接种的CO-39叶片表现出典型的水稻稻瘟病严重病斑，而Com1接种的叶片则显示出明显的侵染缺陷，无法引发完全侵染图.......
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讨论
植物抗病基因在防止病原菌（包括真菌病原菌）侵染方面发挥着至关重要的作用1,12。稻瘟病已被用作研究病原菌群体结构特征以及鉴定植物抗病基因的模式系统4。因此，有必要大规模检测主要农作物品种的抗病基因型及病原菌无毒基因型，以筛选出可连续种植的抗病植株。此外，为充分利用田间病原菌无毒基因型的优势，必须对不同抗性基因型的寄主品种进行合理布局12,13。然而，目前常用的接种方法通常会干扰抗性筛选和病原菌鉴定过程14,15,16,17。
本文介绍了一种快速且准确.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了北京农业大学专项科研项目（YQ201603）和北京市教育委员会科研项目（KM201610020005）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 滤纸 | GE Healthcare 品牌（瑞典） | 10311387 | |
| 50 mL 离心管 | CORNING（美国） | 430290 | |
| 离心机 | Eppendorf（美国） | 5804R | |
| 培养皿 | Thermofisher（美国） | 150326 | |
| 0.5–5 mL 移液器 | Eppendorf | 4920000105 | |
| 100–1000 µL 移液器 | Eppendorf | 4920000083 | |
| 真空泵 | Leybold | D25B | |
| 解剖针 | FST | 26000-35 | |
| 培养箱 | MEMMERT | PYX313 | |
| 接种环 | Greiner Bio One | 731175 |
参考文献
- Li, W. T., et al. A natural allele of a transcription factor in rice confers broad-spectrum blast resistance. Cell. 170 (1), 114-126 (2017).
- Chi, M. H., Park, S. Y., Kim, S., Lee, Y. H. A novel pathogenicity gene is re....
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