本文介绍了一种利用植物病原菌Magnaporthe grisea检测植物致病性的实验方案。该报告将有助于对真菌分离物的致病型进行大规模筛选，并为在分子育种过程中深入理解植物抗性机制提供理想的起点。
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方法文章
植物感染试验：喷雾与伤口介导接种植物病原菌 Magnaporthe Grisea
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
植物具有一套强大的防御系统，可抵御病原真菌带来的潜在威胁。然而，对于具有重要农业价值的植物而言，目前防治此类病原体的措施过于保守，因而效果不够理想，并可能带来环境风险。因此，迫切需要鉴定宿主抗性因子，通过抗性种质资源的筛选、抗性基因的分离与表征以及抗性品种的分子育种，来自然地控制植物病害。为此，有必要建立一种准确、快速且可大规模应用的接种方法，以培育和开发植物抗性基因。稻瘟病菌 Magnaporthe grisea 可引起严重的病害症状并导致产量损失。近年来，M. grisea 已成为研究植物与真菌病原体互作机制的模式生物。因此，本文报道了一种针对 M. grisea 的植物致病性检测方法。该方法包括分生孢子悬浮液喷雾接种，以及菌丝块或分生孢子悬浮液滴加的创伤接种。离体水稻叶片创伤接种的关键步骤是在叶片上制造伤口，从而避免宿主穿透抗性带来的干扰。该喷雾/创伤接种方案有助于对 M. grisea 分离物的致病型进行快速、准确和大规模的筛选。这种整合式、系统化的植物感染方法将为全面理解植物病理学中的各类问题提供一个极佳的起点。
引言
由M. grisea引起的稻瘟病是全球水稻品种中最严重的病害之一1,2。M. grisea侵染寄主植物的过程包括分生孢子的产生和表面附着、分生孢子萌发及附着胞形成、侵入栓的形成和侵染菌丝分化，以及病害的扩散3。这些阶段在许多其他植物病原真菌中普遍存在，事实上，任一阶段受阻均可阻止对寄主植物的侵染。由于其重要的经济意义和良好的遗传操作性，M. grisea已成为研究植物-真菌病原体互作机制的模式生物1,4。因此，研究M. grisea这些发育阶段的分子基础，将有助于阐明真菌致病性的分子机制，并为筛选和设计新型杀菌剂提供候选靶基因5。
近期关于M. grisea感染的研究主要集中在侵染前阶段的分子机制，特别是分生孢子形成、附着胞形成、侵入钉的产生以及侵染性生长过程3,6。因此，建立一套详细的M. grisea侵染检测实验方案至关重要。本文提供了一种详细的侵染检测方法，该方法包括通过分生孢子悬浮液进行喷雾介导的侵染试验，以及利用M. grisea菌丝块对伤口进行接种。本报告重点介绍了菌株培养、用于喷雾的分生孢子诱导液制备，以及通过菌丝块介导的M. grisea植物接种步骤。以下将对这些步骤进行详细描述，整个实验流程的示意图和典型的病斑形态分别如图1和图2所示。
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方案
1. 使用M. grisea分生孢子悬浮液进行喷雾接种
- 稻瘟病菌（M. grisea）的真菌培养
- 制备燕麦番茄琼脂（OTA）培养基用于真菌菌株培养。
- 称取30–50 g燕麦片，加入800 mL去离子水（ddH2O），在电热锅中煮沸30分钟。
- 用纱布将煮过的燕麦汁过滤至烧杯中。
- 向烧杯中的滤液加入150 mL番茄汁和20 g琼脂，并用ddH2O定容至1,000 mL。
- 实验材料的准备
- 将约50粒水稻（Oryza sativa）品种丽江新团黑谷（LTH）种子在ddH2O中浸泡3天，或约50粒大麦（Hordeum vulgare cv Golden Promise）种子在ddH2O中浸泡约1天。
- 将水稻或大麦种子用湿润纱布包裹，置于约30个直径为10 cm × 10 cm的培养皿中的湿润滤纸上，在28 °C下萌发。水稻种子萌发时间约为2–3天，大麦种子萌发时间约为2天。温室相对湿度约为70%。
- 将水稻或大麦幼苗种植于经高压灭菌的盆栽土中，浇水后覆盖一层蛭石。
- 将植株置于25 °C的适宜玻璃温室或生长箱中培养约1～2周。
- 用无菌手术剪将三层滤纸剪成圆形（每个圆直径应为8 cm），并放置于100 mm无菌塑料培养皿中。
- 向每个培养皿中加入ddH2O，浸湿滤纸。
- 确保滤纸完全湿润，但不要添加过多水分。
- 用真空泵吸除多余水分。
- 在培养皿中放入两根无菌牙签，用于支撑水稻/大麦叶片；牙签间距约为2–3 cm。
- 在播种后2周采集水稻叶片，或在播种后7天采集大麦叶片。
- 取4至6叶期的水稻/大麦幼苗，从顶部向下约5 cm处剪去茎的下部，并收集叶片。
- 喷雾接种程序
- 将真菌菌株在OTA平板上于恒温培养箱（25 °C）中培养约4天。
- 使用0.5–5 mL移液器向每个培养4天的平板中加入约2 mL ddH2O。
- 用接种环将M. grisea野生型菌株和突变菌株的菌丝刮下，形成菌丝碎片。
- 收集菌丝碎片并转移至新的OTA平板。将菌丝碎片在超净工作台中吹干。
- 用三层纱布覆盖平板，在白天25 °C（14小时）、夜间23 °C（10小时）的温室中培养24–48小时，以保证分生孢子生长所需的湿度。
- 向每个平板中加入2 mL ddH2O，用无菌棉签轻轻刮取分生孢子，随后通过两层镜头纸过滤。注意不要刮伤培养基表面。
- 使用100–1,000 µL移液器将分生孢子悬液转移至新的50 mL离心管中。
- 在25 °C下以至少5,000 × g离心5分钟。
- 弃去上清液，将沉淀重悬于0.025%（v/v）Tween-20溶液中，使孢子浓度为每毫升2 × 104个分生孢子。Tween-20溶液体积通常为10–20 mL。
- 将孢子悬液倒入手持式喷雾器中。
- 向2周龄水稻幼苗的叶片或7日龄大麦幼苗的叶片喷洒约10 mL分生孢子悬液，并在25 °C黑暗高湿环境中孵育约24小时。对照植株喷洒0.025%（v/v）Tween-20溶液。
- 将叶片转移至另一光照湿润培养箱中，在25 °C下进行12小时光照周期培养。
- 接种后5天记录病害症状。检查长约6 cm的发病水稻/大麦叶片。抗病性评价标准依据国际水稻研究所（IRRI）的稻瘟病抗性评分系统。表1列出了该抗性评分系统的详细内容。
- 拍摄叶片照片以评估测试菌株的侵染情况。侵染程度通过每3.6 cm2面积上的病斑数量进行评估。
2. 用 M. grisea 菌丝块或分生孢子悬液滴进行创伤接种
- 使用解剖针在离体水稻/大麦叶片的主脉上刮出三道长2 - 3 cm的伤口；注意不要穿透叶片。
- 将刮伤的叶片置于牙签上，并喷洒0.02%（v/v）Tween-20溶液，使叶片表面形成一层液滴。
- 从OTA平板上为每种M. grisea菌株（野生型、突变体、互补菌株或其他测试菌株）切取一块0.5 cm × 0.5 cm的菌丝块。
- 将菌丝块或25 µL分生孢子悬液滴加到受伤的叶片上，置于湿润培养箱中，25 °C下培养3 - 8 d。
- 在接种后5 - 7 d观察病斑。检查方法与喷雾接种法相同（见步骤1.3.13）。
- 观察长约~6 cm的感病水稻/大麦叶片，并拍照以评估测试菌株的侵染情况。通过每3.6 cm2面积上的病斑数量来评估侵染程度。
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结果
该技术的完整工作流程如下所示 图1植物侵染试验在14天龄的感病水稻幼苗上进行（O. sativa cv CO-39）或感病的7天龄大麦叶片（H. vulgare cv Golden Promise7,8,9为了检测水稻叶片上的感染情况，使用分生孢子悬浮液（1.0 × 105 孢子/毫升）的 M. grisea 野生型菌株P131和Com1基因缺失突变体菌株经制备后，喷施于14天龄感病型CO-39幼苗的叶鞘上，随后将幼苗置于湿润培养箱中培养5天10P131接种的CO-39叶片表现出典型的水稻稻瘟病严重病斑，而Com1接种的叶片则显示出明显的侵染缺陷，无法引发完全侵染图...
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讨论
植物抗病基因在防止病原菌（包括真菌病原菌）侵染方面发挥着至关重要的作用1,12。稻瘟病已被用作研究病原菌群体结构特征以及鉴定植物抗病基因的模式系统4。因此，有必要大规模检测主要农作物品种的抗病基因型及病原菌无毒基因型，以筛选出可连续种植的抗病植株。此外，为充分利用田间病原菌无毒基因型的优势，必须对不同抗性基因型的寄主品种进行合理布局12,13。然而，目前常用的接种方法通常会干扰抗性筛选和病原菌鉴定过程14,15,16,17。
本文介绍了一种快速且准确...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了北京农业大学专项科研项目（YQ201603）和北京市教育委员会科研项目（KM201610020005）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 滤纸 | GE Healthcare 品牌（瑞典） | 10311387 | |
| 50 mL 离心管 | CORNING（美国） | 430290 | |
| 离心机 | Eppendorf（美国） | 5804R | |
| 培养皿 | Thermofisher（美国） | 150326 | |
| 0.5–5 mL 移液器 | Eppendorf | 4920000105 | |
| 100–1000 µL 移液器 | Eppendorf | 4920000083 | |
| 真空泵 | Leybold | D25B | |
| 解剖针 | FST | 26000-35 | |
| 培养箱 | MEMMERT | PYX313 | |
| 接种环 | Greiner Bio One | 731175 |
参考文献
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