本文介绍一种分离和富集已建立的皮下肿瘤中肿瘤免疫及非免疫微环境组分的方法。该技术可分别分析肿瘤免疫浸润细胞和非免疫肿瘤组分，从而实现对肿瘤免疫微环境的全面表征。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
在已建立的小鼠皮下肿瘤中富集与表征肿瘤免疫及非免疫微环境
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
肿瘤免疫微环境（TIME）近年来被认识到在实体瘤治疗反应中起关键作用，尤其是对免疫治疗而言。免疫治疗领域的最新临床进展凸显了建立可重复方法以准确、全面表征肿瘤及其相关免疫浸润的迫切需求。通过肿瘤酶解和流式细胞术分析，可对多种免疫细胞亚群及表型进行广泛表征；然而，分析深度常受限于荧光染料在抗体组合设计中的限制，以及为检测稀有免疫细胞群体而需获取较大肿瘤样本的要求。因此，我们开发了一种高效且高通量的方法，用于将肿瘤免疫浸润成分从非免疫性肿瘤组分中分离并富集。所述的肿瘤消化结合基于离心密度的分离技术，可分别对肿瘤组分与肿瘤免疫浸润组分进行表征，同时保持细胞活性，从而实现对肿瘤免疫状态的全面分析。该方法已被用于表征实体瘤中广泛存在的空间免疫异质性，进一步说明了建立一致性的全肿瘤免疫谱型分析技术的重要性。总体而言，该方法为皮下移植的实体小鼠肿瘤免疫学特征的表征提供了一种高效且可灵活调整的技术手段；因此，该工具可用于更精确地刻画肿瘤免疫学特征，并用于新型免疫治疗策略的临床前评估。
引言
免疫抑制性肿瘤微环境（TIME）近年来被确认为癌症的一个重要特征，已知在实体瘤的发生、发展、保护过程中发挥关键作用，并可降低其对免疫治疗的敏感性。1肿瘤免疫微环境（TIME）由多种细胞亚群和表型组成，这些细胞亚群和表型为揭示肿瘤的免疫状态提供了关键信息。这些免疫细胞亚群可进一步分为起源于淋巴细胞或髓系细胞的群体，二者共同构成了先天性和适应性免疫反应的主体。2,3近年来，癌症免疫治疗领域的进展表明，免疫治疗策略（即， 免疫检查点抑制剂，嵌合抗原受体T细胞 等等。) 有可能诱导持久的癌症缓解；然而，它们在实体瘤癌症中仍然相对无效4,5许多研究团队已证实，肿瘤免疫微环境（TIME）对治疗成功与否具有关键性阻碍作用6,7，因此，仍需在临床前阶段准确评估新的免疫疗法，特别是关注其调节或克服肿瘤免疫微环境（TIME）的能力8.
目前对肿瘤免疫微环境（TIME）进行表征的研究通常采用显微镜技术或流式细胞术，并结合....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本文所述所有方法均已获得贝勒医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 肿瘤组织的收获与消化
注意：每例肿瘤的收获时间约为 3 - 5 分钟，处理时间约为 1 小时 + 每例肿瘤 2 - 3 分钟。
- 通过吸入二氧化碳处死小鼠，并在取材前用70%乙醇喷洒每只小鼠，以防止毛发污染。手术切除小鼠皮下肿瘤，并确保肿瘤组织无任何污染组织即， 毛发、皮肤、腹膜 等等。)。将每个肿瘤置于含有1.8 mL不含胎牛血清（FBS）的基础RPMI-1640培养基的24孔板中。对于较大规模的收获，需将培养板置于冰上保持低温，以维持细胞活性。
注意：如果需要无菌操作，所有肿瘤解剖步骤都必须在生物安全柜中使用无菌外科器械进行（即， 剪刀，镊子 等等。），以及后续所有步骤。最长径介于 0.5 - 1 cm 的肿瘤最为理想，过大或过小的肿瘤均需调整试剂用量。 - 使用剪刀将肿瘤切成小于1 mm的组织块3 每个孔中的组织块。
- 在基础RPMI-1640培养基（不含FBS）中溶解胶原酶I至10 mg/mL、胶原酶IV至2,500 U/mL以及DNase I至200 U/mL，配制10倍消化液。
注意：消化液混合物可提前一天配制，并在 -20 °C 保存；....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
我们的结果表明，如本方案所述，将肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）从非免疫性肿瘤组分中分离具有显著优势。此外，通过所描述的方法，我们展示了已建立的实体瘤在免疫学上存在显著的异质性。
许多肿瘤解离技术存在一个显著问题，即样本活力下降，这通常是由于消化条件过于剧烈所致即， 高温，营养供应不足 等等。）。采用所述消化方法，无论是否结合密度梯度介质富集，经流式细胞术评估，可获得约70–90%的总细胞活力图1A）。在TIL富集组分和肿瘤富集组分中观察到相似的存活率，表明该方法总体毒性极低（图1A, 图2C）。此外，与未富集的肿瘤消化物相比，在分析的活细胞总数.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
肿瘤微环境（TIME）由多种复杂的细胞成分和分子构成。最近的研究证据表明，准确表征这一环境有助于更好地理解治疗成功或失败的原因，甚至可能帮助识别治疗耐药的机制。例如，肿瘤内多种免疫抑制细胞水平的升高（即， 髓源性抑制细胞，调节性T细胞， 等等。）可减轻效应免疫反应，并消除免疫治疗效果。另一方面，肿瘤内效应免疫细胞群的增多（例如， 肿瘤特异性的CD8+ T细胞、自然杀伤细胞、辅助性T细胞）可作为治疗效果的有力预测指标。另一种能够持续准确反映肿瘤免疫状态的特征是肿瘤细胞自身的表型特征，包括表达多种旨在抑制效应性免疫应答的免疫抑制性配体、酶或分子。即， PD-L1、PD-L2、吲哚胺2,3-双加氧酶、一氧化氮 等等。综上所述，这表明有必要对实体瘤的免疫和肿瘤细胞特征进行准确而全面的表征。
本文所述技术可实现对小鼠实体皮下肿瘤中免疫细胞与肿瘤细胞组分的分离与富集，进而可独立进行流式细胞术分析，全面评估肿瘤免疫微环境（TIME）以及肿瘤细胞与TIME之间的相互作用。经过富集后，可优化设计广泛的免疫细胞流.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
JMN 承认获得美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所（T32GM088129）和国家牙科与颅面研究所（F31DE026682）的经费支持。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。本项目还得到了贝勒医学院细胞计量与细胞分选核心实验室的支持，该核心实验室的资金来自美国国立卫生研究院（P30 AI036211、P30 CA125123 和 S10 RR024574），并承蒙 Joel M. Sederstrom 提供的专业协助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6至12周龄雄性C57BL/6小鼠 | Jackson Laboratory | N/A | 本研究中用于肿瘤实验的小鼠 |
| MEER小鼠同源性癌细胞系 | 来自合作方 | N/A | 表达E6/E7 HPV抗原的小鼠扁桃体上皮癌细胞系 |
| 70%异丙醇 | EMD Milipore | PX1840 | |
| 小鼠外科手术工具包 | World Precision Instruments | MOUSEKIT | 主要仅需剪刀、镊子和手术刀。 |
| 24孔板 | Denville Scientific Inc. | T1024 | 或任何24孔平底板。 |
| RPMI-1640培养基 | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| 胶原酶I | EMD Milipore | 234153 | |
| 胶原酶IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| 低速轨道摇床 | BioExpress (供应商：Genemate) | S-3200-LS | 或任何其他轨道摇床。 |
| 温控培养箱 | Fisher Scientific | 13-255-27 | 或任何其他温控培养箱 |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL移液器及吸头 | Eppendorf | 13-690-032 | 或任何其他移液器及吸头 |
| 40 µm细胞筛 | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL离心管 | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL锥形管 | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL无针鲁尔锁注射器 | BD | 309604 | |
| Lymphoprep密度梯度介质 | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| 移液管 | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96孔U型底板 | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3转录因子染色缓冲液套装 | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | 固定/透化缓冲液和透化缓冲液 |
| 温控离心机 | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT流式细胞仪 | ThermoFisher Scientific | N/A | 用于96孔板细胞体积定量计数 |
| 纯化大鼠抗小鼠CD16/CD32（小鼠BD Fc阻断剂） 克隆2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc阻断剂 |
| LIVE/DEAD可固定蓝色死细胞染色试剂盒，适用于紫外激发 | ThermoFisher Scientific | L34962 | 可固定活力染色剂 |
| CD45单克隆抗体（30-F11），APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR β单克隆抗体（H57-597），APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α 抗体（KT15），PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4单克隆抗体（GK1.5），PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC II类（I-A/I-E）单克隆抗体（M5/114.15.2），Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c单克隆抗体（N418），PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80单克隆抗体（BM8），eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b单克隆抗体（M1/70），APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G（Gr-1）单克隆抗体（RB6-8C5），PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274（PD-L1，B7-H1）单克隆抗体（MIH5），PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273（B7-DC）单克隆抗体（122），PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67单克隆抗体（B56），BV711 | BD Biosciences | 563755 |
参考文献
- Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Whiteside, T. L.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
