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方法文章

在已建立的小鼠皮下肿瘤中富集与表征肿瘤免疫及非免疫微环境

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DOI：

10.3791/57685

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2018年6月7日

 ,  , 
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Baylor College of Medicine, 2Interdepartmental Graduate Program in Translational Biology and Molecular Medicine, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍一种分离和富集已建立的皮下肿瘤中肿瘤免疫及非免疫微环境组分的方法。该技术可分别分析肿瘤免疫浸润细胞和非免疫肿瘤组分，从而实现对肿瘤免疫微环境的全面表征。

摘要

肿瘤免疫微环境（TIME）近年来被认识到在实体瘤治疗反应中起关键作用，尤其是对免疫治疗而言。免疫治疗领域的最新临床进展凸显了建立可重复方法以准确、全面表征肿瘤及其相关免疫浸润的迫切需求。通过肿瘤酶解和流式细胞术分析，可对多种免疫细胞亚群及表型进行广泛表征；然而，分析深度常受限于荧光染料在抗体组合设计中的限制，以及为检测稀有免疫细胞群体而需获取较大肿瘤样本的要求。因此，我们开发了一种高效且高通量的方法，用于将肿瘤免疫浸润成分从非免疫性肿瘤组分中分离并富集。所述的肿瘤消化结合基于离心密度的分离技术，可分别对肿瘤组分与肿瘤免疫浸润组分进行表征，同时保持细胞活性，从而实现对肿瘤免疫状态的全面分析。该方法已被用于表征实体瘤中广泛存在的空间免疫异质性，进一步说明了建立一致性的全肿瘤免疫谱型分析技术的重要性。总体而言，该方法为皮下移植的实体小鼠肿瘤免疫学特征的表征提供了一种高效且可灵活调整的技术手段；因此，该工具可用于更精确地刻画肿瘤免疫学特征，并用于新型免疫治疗策略的临床前评估。

引言

免疫抑制性肿瘤微环境（TIME）近年来被确认为癌症的一个重要特征，已知在实体瘤的发生、发展、保护过程中发挥关键作用，并可降低其对免疫治疗的敏感性。1肿瘤免疫微环境（TIME）由多种细胞亚群和表型组成，这些细胞亚群和表型为揭示肿瘤的免疫状态提供了关键信息。这些免疫细胞亚群可进一步分为起源于淋巴细胞或髓系细胞的群体，二者共同构成了先天性和适应性免疫反应的主体。2,3近年来，癌症免疫治疗领域的进展表明，免疫治疗策略（即， 免疫检查点抑制剂，嵌合抗原受体T细胞 等等。) 有可能诱导持久的癌症缓解；然而，它们在实体瘤癌症中仍然相对无效4,5许多研究团队已证实，肿瘤免疫微环境（TIME）对治疗成功与否具有关键性阻碍作用6,7，因此，仍需在临床前阶段准确评估新的免疫疗法，特别是关注其调节或克服肿瘤免疫微环境（TIME）的能力8.

目前对肿瘤免疫微环境（TIME）进行表征的研究通常采用显微镜技术或流式细胞术，并结合抗体标记策略，以鉴定免疫细胞亚群及其特征9,10这两种策略提供的信息具有独特差异：显微镜技术能够实现对细胞亚群的空间分布进行观察，而流式细胞术则可实现高通量、更广泛的细胞变化定量分析。尽管近年来荧光多重免疫组化技术结合光谱成像系统的优化取得了进展，目前已可支持多达7个参数，但受限于较小的检测面板规模，难以实现全面的免疫谱型分析，因此该技术通常用于更为集中的特定分析。正因如此，流式细胞术仍是目前应用最广泛的免疫谱型分析技术之一。尽管其在肿瘤免疫微环境（TIME）表征中被广泛使用，但样本处理与染色方法却存在较大差异。大多数方案通常采用肿瘤解离酶（即， 胶原酶，DNase 等等。）以及手动解离方法制备单细胞悬液，随后进行抗体染色与分析7尽管每种方法都有其优势，但许多研究团队已证实，这些技术可能引发显著的变异性。11这使得不同研究之间对肿瘤微环境的分析结果极难进行比较，即使是在评估相同的鼠源肿瘤模型时也是如此。此外，由于消化后肿瘤细胞与肿瘤浸润免疫细胞相互混杂，这些方法难以独立评估这两类成分。样本量的限制进一步制约了多色抗体组合染色及分析的可行性，这在试图表征稀有免疫细胞亚群时成为一个主要问题。即， 肿瘤特异性T细胞12较新的技术，如质谱流式细胞术（或称飞行时间质谱流式细胞术，CyTOF），可实现对细胞亚群的高维表型分析，部分系统支持超过42个独立参数的检测 panel 设计。13尽管CyTOF技术在免疫谱型分析中具有强大功能，但其应用仍受到设备成本高昂、分析所需专业知识以及设备可及性等因素的限制。此外，许多CyTOF实验方案建议对免疫细胞亚群进行纯化，以提高信噪比14因此，我们建议将本富集方法用于CyTOF分析的上游步骤，以提高数据质量。

本文描述了一种整合了肿瘤免疫浸润细胞分离的肿瘤微环境消化与分析方法。该方法的目的是实现对肿瘤免疫浸润细胞和肿瘤细胞组分的独立高通量分析，从而更全面地表征肿瘤微环境。利用该方法，我们进一步证明了进行全肿瘤分析的重要性，因为皮下实体瘤模型显示出显著的空间免疫异质性。总体而言，该方法能够更准确且一致地进行样本间的比较，因为它富集了肿瘤内的免疫细胞亚群，并允许对肿瘤的肿瘤细胞组分和免疫组分进行独立分析。

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方案

本文所述所有方法均已获得贝勒医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 肿瘤组织的收获与消化

注意：每例肿瘤的收获时间约为 3 - 5 分钟，处理时间约为 1 小时 + 每例肿瘤 2 - 3 分钟。

  1. 通过吸入二氧化碳处死小鼠，并在取材前用70%乙醇喷洒每只小鼠，以防止毛发污染。手术切除小鼠皮下肿瘤，并确保肿瘤组织无任何污染组织即， 毛发、皮肤、腹膜 等等。)。将每个肿瘤置于含有1.8 mL不含胎牛血清（FBS）的基础RPMI-1640培养基的24孔板中。对于较大规模的收获，需将培养板置于冰上保持低温，以维持细胞活性。
    注意：如果需要无菌操作，所有肿瘤解剖步骤都必须在生物安全柜中使用无菌外科器械进行（即， 剪刀，镊子 等等。），以及后续所有步骤。最长径介于 0.5 - 1 cm 的肿瘤最为理想，过大或过小的肿瘤均需调整试剂用量。
  2. 使用剪刀将肿瘤切成小于1 mm的组织块3 每个孔中的组织块。
  3. 在基础RPMI-1640培养基（不含FBS）中溶解胶原酶I至10 mg/mL、胶原酶IV至2,500 U/mL以及DNase I至200 U/mL，配制10倍消化液。
    注意：消化液混合物可提前一天配制，并在 -20 °C 保存；但不建议长期储存，因为酶在溶解后会随时间推移逐渐失去活性。
  4. 加入200 µL含有胶原酶I、胶原酶IV和DNase I的10倍解离混合液至每孔，其中组织块直径为1 mm3 块
  5. 在37 °C下孵育样品1小时，同时使用轨道摇床以60 - 100 rpm速度轻轻振荡。
    注意：在酶消化过程中将温度升高至 37 °C 可能引起免疫细胞活化。
  6. 孵育1小时后，向每孔加入1 mL含5% FBS和2 mM EDTA的RPMI-1640培养基以中和反应。
  7. 将肿瘤消化液和剩余的肿瘤组织块用移液器转移至置于50 mL离心管上方的40 µm细胞滤筛中。
    注意：剪掉1 mL枪头的尖端，以便更顺利地将肿瘤消化液转移至滤筛。
  8. 使用10 mL注射器活塞通过滤网对肿瘤组织进行机械性解离。每隔一段时间用2 mL添加了5% FBS的RPMI-1640培养基冲洗滤网，并重复操作，直至滤网上无残留肿瘤组织。
    注意：总共使用约 4 - 10 mL 培养基应足以充分冲洗滤网上的肿瘤组织。
    注意：所有样本完成此步骤前，需将样本置于冰上，以保持细胞活性。
  9. 使用添加了补充剂的RPMI-1640培养基将每个50 mL离心管调整至相同体积。
    注意：调整体积对于离心机平衡至关重要。跳过此步骤可能导致离心机损坏或人身伤害。
  10. 将细胞悬液离心（5 分钟，805 × g，4 °C），弃上清，加入 2 mL 添加物的 RPMI-1640 培养基重悬。
    注意：离心后可能形成难以重悬的细胞团块。请使用5 mL刻度吸管快速吹打混匀以分散团块，再继续后续操作。

2. 免疫细胞与肿瘤细胞组分的分离

注意：此步骤所需时间约为 1 h。

  1. 在15 mL离心管底部加入3 mL密度梯度介质。为每个肿瘤准备并标记足够的离心管。
  2. 用移液器沿离心管壁缓慢将2 mL肿瘤细胞悬液加至密度梯度介质上方，避免两层液体混合。
  3. 小心将分层后的离心管放入离心机，于805 × g、20 °C条件下离心20分钟，不使用刹车。
    注意：必须确保离心管正确配平，并确认离心过程中未使用刹车。任何操作不当均可能导致各层混合，从而难以完全回收样本。
  4. 使用转移移液器小心将肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）层及上层培养基转移至新的15 mL离心管中。弃去剩余的密度梯度介质，并将离心管底部的肿瘤细胞沉淀用2 mL含补充物的RPMI-1640培养基重悬。
    注意：离心后自上而下可观察到四个明显分层，依次为：培养基层、TIL层、密度梯度介质层和肿瘤细胞沉淀层。参见图2A以了解各层示例。
  5. 将TIL样本和肿瘤样本分别在不同离心管中离心（5分钟，805 × g，4 °C），弃去上清液。
  6. 将TIL样本用200 µL含补充物的RPMI-1640培养基重悬，肿瘤沉淀则用2 mL相同培养基重悬。置于冰上以维持细胞活性。

3. 涂布与染色

注意：铺板所需时间为每肿瘤30秒；表面染色所需时间为1小时；胞内染色所需时间为40分钟；流式细胞术分析所需时间为每肿瘤1至4分钟。

  1. 为每种免疫染色面板和一个额外的细胞计数板准备并标记一个96孔U型底板。
    注意：通常总共准备三个板：一个以淋巴细胞为重点的面板板，一个以髓系细胞为重点的面板板，以及一个细胞计数板。
  2. 将单细胞悬液分装至各染色面板板中，并将固定体积的细胞悬液加入计数板。
    注意：计数板用于计算加入每个染色面板的总细胞数，从而实现准确的细胞亚群计数。使用具备96孔板上样和体积分析功能的流式细胞仪，可提供每个样本中每微升（µL）的细胞数量，进而计算出加入各染色面板的细胞总数。计数板可在4 °C下固定过夜后，用FACs缓冲液（含2% FBS的磷酸盐缓冲液PBS）洗涤并重悬于固定体积的FACs缓冲液中，次日进行检测。
  3. 每份样本用200 µL杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤两次，每次通过离心（5分钟，805 × g，4 °C）后弃去上清液，以去除任何游离的FBS。
  4. 每孔加入50 µL Fc阻断剂，使用多通道移液器混匀样本，并在4 °C下孵育20分钟。
  5. 加入50 µL 2倍浓缩的细胞外靶向抗体与可固定活力染料混合液，使用多通道移液器混匀，并在室温或4 °C下避光孵育30分钟。
    注意：抗体的具体染色条件取决于制造商的说明。所有染色稀释液必须使用DPBS配制，不得添加FBS，以防止可固定活力染料饱和。请参见本文所用染色面板的材料/设备表中推荐的最佳稀释比例。抗体与可固定活力染料溶液应配制成2倍浓度，以便在加入Fc阻断剂后，总体积为100 µL时达到最终1倍的染色浓度。
  6. 用FACs缓冲液洗涤样本两次，每次离心（5分钟，805 × g，4 °C）后弃去上清液。
  7. 用200 µL 1倍固定/通透溶液重悬细胞，避光条件下在4 °C下孵育过夜。
    注意：实验可在该步骤暂停过夜：将样本置于4 °C避光保存。
  8. 次日，对板进行离心（5分钟，805 × g，4 °C），弃去上清液。
  9. 用200 µL 1倍通透缓冲液洗涤一次，离心（5分钟，805 × g，4 °C），弃去上清液。
  10. 加入100 µL以1倍通透缓冲液配制的1倍浓度细胞内抗体染色面板，避光条件下在室温或4 °C下孵育30分钟（具体条件依制造商建议而定）。
  11. 先用1倍通透缓冲液洗涤一次（5分钟，805 × g，4 °C），弃去上清液，再用FACs缓冲液（含2% FBS的PBS）洗涤一次。
  12. 用300 µL FACs缓冲液（含2% FBS的PBS）重悬样本，转移至流式细胞管中，进行流式细胞分析。

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结果

我们的结果表明，如本方案所述，将肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）从非免疫性肿瘤组分中分离具有显著优势。此外，通过所描述的方法，我们展示了已建立的实体瘤在免疫学上存在显著的异质性。

许多肿瘤解离技术存在一个显著问题，即样本活力下降，这通常是由于消化条件过于剧烈所致即， 高温，营养供应不足 等等。）。采用所述消化方法，无论是否结合密度梯度介质富集，经流式细胞术评估，可获得约70–90%的总细胞活力图1A）。在TIL富集组分和肿瘤富集组分中观察到相似的存活率，表明该方法总体毒性极低（图1A, 图2C）。此外，与未富集的肿瘤消化物相比，在分析的活细胞总数...

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讨论

肿瘤微环境（TIME）由多种复杂的细胞成分和分子构成。最近的研究证据表明，准确表征这一环境有助于更好地理解治疗成功或失败的原因，甚至可能帮助识别治疗耐药的机制。例如，肿瘤内多种免疫抑制细胞水平的升高（即， 髓源性抑制细胞，调节性T细胞， 等等。）可减轻效应免疫反应，并消除免疫治疗效果。另一方面，肿瘤内效应免疫细胞群的增多（例如， 肿瘤特异性的CD8+ T细胞、自然杀伤细胞、辅助性T细胞）可作为治疗效果的有力预测指标。另一种能够持续准确反映肿瘤免疫状态的特征是肿瘤细胞自身的表型特征，包括表达多种旨在抑制效应性免疫应答的免疫抑制性配体、酶或分子。即， PD-L1、PD-L2、吲哚胺2,3-双加氧酶、一氧化氮 等等。综上所述，这表明有必要对实体瘤的免疫和肿瘤细胞特征进行准确而全面的表征。

本文所述技术可实现对小鼠实体皮下肿瘤中免疫细胞与肿瘤细胞组分的分离与富集，进而可独立进行流式细胞术分析，全面评估肿瘤免疫微环境（TIME）以及肿瘤细胞与TIME之间的相互作用。经过富集后，可优化设计广泛的免疫细胞流...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

JMN 承认获得美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所（T32GM088129）和国家牙科与颅面研究所（F31DE026682）的经费支持。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。本项目还得到了贝勒医学院细胞计量与细胞分选核心实验室的支持，该核心实验室的资金来自美国国立卫生研究院（P30 AI036211、P30 CA125123 和 S10 RR024574），并承蒙 Joel M. Sederstrom 提供的专业协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
6至12周龄雄性C57BL/6小鼠Jackson Laboratory N/A本研究中用于肿瘤实验的小鼠
MEER小鼠同源性癌细胞系来自合作方 N/A表达E6/E7 HPV抗原的小鼠扁桃体上皮癌细胞系 
70%异丙醇 EMD Milipore PX1840
小鼠外科手术工具包World Precision InstrumentsMOUSEKIT主要仅需剪刀、镊子和手术刀。 
24孔板 Denville Scientific Inc.T1024或任何24孔平底板。 
RPMI-1640培养基Sigma-AldrichR0883
胶原酶I EMD Milipore234153
胶原酶IVWorthington Biochemical CorporationLS004189
DNase I Sigma-Aldrich11284932001
低速轨道摇床BioExpress (供应商：Genemate) S-3200-LS或任何其他轨道摇床。 
温控培养箱Fisher Scientific13-255-27或任何其他温控培养箱
FBSSigma-AldrichF8192
EDTAAMRESCOE177
1 mL移液器及吸头Eppendorf13-690-032或任何其他移液器及吸头
40 µm细胞筛Fisher Scientific22363547
50 mL离心管Denville Scientific Inc.C1062-P
15 mL锥形管Denville Scientific Inc.C1012
10 mL无针鲁尔锁注射器BD309604
Lymphoprep密度梯度介质STEMCELL Technologies7811
移液管Denville Scientific Inc.P7212
96孔U型底板Denville Scientific Inc.
DPBSSigma Aldrich D8573
FoxP3转录因子染色缓冲液套装 ThermoFisher Scientific00-5523-00固定/透化缓冲液和透化缓冲液
温控离心机Eppendorf 5810 R
Attune NxT流式细胞仪ThermoFisher ScientificN/A用于96孔板细胞体积定量计数 
纯化大鼠抗小鼠CD16/CD32（小鼠BD Fc阻断剂） 克隆2.4G2 ThermoFisher Scientific553141Fc阻断剂
LIVE/DEAD可固定蓝色死细胞染色试剂盒，适用于紫外激发ThermoFisher ScientificL34962可固定活力染色剂
CD45单克隆抗体（30-F11），APC-eFluor 780ThermoFisher Scientific47-0451-80
TCR β单克隆抗体（H57-597），APCThermoFisher Scientific17-5961-82
CD8-α 抗体（KT15），PESanta Cruz Biotechnologysc-53473 
CD4单克隆抗体（GK1.5），PE-Cyanine5ThermoFisher Scientific15-0041-81
MHC II类（I-A/I-E）单克隆抗体（M5/114.15.2），Alexa Fluor 700ThermoFisher Scientific56-5321-82
CD11c单克隆抗体（N418），PE-Cyanine5ThermoFisher Scientific15-0114-82
F4/80单克隆抗体（BM8），eFluor 450ThermoFisher Scientific48-4801-80
CD11b单克隆抗体（M1/70），APCThermoFisher Scientific17-0112-81
Ly-6G（Gr-1）单克隆抗体（RB6-8C5），PEThermoFisher Scientific12-5931-82
CD274（PD-L1，B7-H1）单克隆抗体（MIH5），PE-Cyanine7ThermoFisher Scientific25-5982-80
CD273（B7-DC）单克隆抗体（122），PerCP-eFluor 710ThermoFisher Scientific46-9972-82
Ki-67单克隆抗体（B56），BV711BD Biosciences563755

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