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方法文章

从人多能干细胞生成第一心场样心脏前体细胞及心室样心肌细胞

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DOI：

10.3791/57688

⸱

2018年6月19日

 ,  , 
1Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 2Department of Bioengineering, University of California at San Diego

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍一种可扩展的方法，通过简单组合使用Activin A和慢病毒介导的Id1过表达，从人类多能干细胞中生成第一心区样心脏前体细胞和心室样心肌细胞。

摘要

大量生成具有特定心区来源的功能性人类多能干细胞衍生的心脏前体细胞和心肌细胞，是细胞治疗心脏疾病及进行疾病建模的前提条件。我们近期研究发现，Id 基因在脊椎动物发育过程中对第一心区前体细胞的特化具有必要且充分的作用。本分化方案基于上述发现，利用 Id1 过表达联合 Activin A 作为强有力的命运特化信号，诱导产生类似第一心区（FHF-L）的前体细胞。重要的是，这些前体细胞可高效分化为类似心室的心肌细胞，效率约为 70–90%。本文中，我们详细描述了两个步骤：1）生成过表达 Id1 的人多能干细胞（hPSCs）；2）大规模分化可冻存的 FHF-L 前体细胞及类似心室的心肌细胞。

引言

大规模生产人多能干细胞（hPSCs）来源的心脏前体细胞和心肌细胞，是干细胞治疗1、疾病建模2,3以及快速鉴定调控心脏分化4,5,6和生理功能7,8的新通路的先决条件。尽管已有大量研究9,10,11,12,13,14,15报道了高效的人多能干细胞向心肌细胞分化的方案，但均未明确所获得心肌细胞的心区来源，尽管已发现左心室心肌细胞（第一心区）与右心室心肌细胞（第二心区）之间存在显著的分子差异16，且存在特定心区相关的先天性心脏病，例如左心发育不全综合征17或致心律失常性右室心肌病18。因此，从hPSCs中定向生成具有明确心区来源的心脏前体细胞和心肌细胞，已成为提升其在治疗和疾病建模应用中相关性的必要条件。

本方案依赖于Id1的组成型过表达，Id1是一种近期鉴定出的5 第一个心脏区域特化信号，与Activin A联合作用时，对启动hPSCs中的心脏发生既必要又充分。值得注意的是，Cunningham 等 (2017)5 表明 Id1 诱导的前体细胞特异性表达第一心场（HCN4, TBX5）但不包括第二心区标志物（SIX2, ISL1）在经历心脏分化时的情况。此外，作者还展示了整个缺失的转基因小鼠胚胎 Id 基因家族（Id1-4），不形成第一心区心脏前体细胞，而更内侧和后部的心脏前体细胞（第二心区）仍可形成，表明Id蛋白对启动第一心区心脏发生至关重要 体内方便的是，Id1诱导的前体细胞可被冷冻保存，并能自发分化为具有心室样特性的心肌细胞，包括表达心室特异性标志物IRX4, MYL2) 表达和心室样动作电位。

本文介绍一种简单且可扩展的方法，通过过表达 Id1 的人多能干细胞（hPSCs）生成类似第一心区（FHF-L）的心脏前体细胞及类似心室的心肌细胞。该方案的一个重要特点是可通过便捷的冷冻保存步骤，将心脏前体细胞的生成与后续心肌细胞的产生分离开来。综上所述，本方案详细阐述了以下必要步骤：（1）生成过表达 Id1 的人多能干细胞（hPSCs）；（2）从 hPSCs 生成类似第一心区（FHF-L）的心脏前体细胞；（3）冷冻保存所获得的前体细胞；以及（4）恢复 FHF-L 心脏前体细胞的分化过程，并生成高度富集（>70–90%）的搏动性类似心室的心肌细胞。

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方案

1. Id1 病毒的制备与感染

  1. 通过将 pCMVDR8.74、pMD2.G 和 pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR（Addgene：质粒 #107735）共转染至 HEK293T 细胞中，生成 Id1 过表达的慢病毒。收集病毒颗粒，从上清液中过滤并纯化，然后于 -80 °C 保存，方法同 Kitamura 等 (2003)19或者，可将 pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR 载体送至慢病毒生产服务商，通过商业途径制备 Id1 慢病毒。
    注意：请遵循慢病毒安全规范和标准操作规程。
    注意：重要提示：最佳病毒滴度应至少达到 108 至 109 转导单位/毫升（TU/mL）
  2. 感染前，将50 µl包被试剂加入96孔板的一个孔中进行包被，该试剂通常为Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞分泌的明胶状蛋白质混合物（参见 材料表).
  3. 在6孔板中培养的一孔多能干细胞，通过加入1 mL不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS进行解离2+ 和 Mg2+ 含0.5 mM EDTA。
    注意：消化时间因情况而异，通常为 3–10 分钟。当超过 80% 的细胞从培养板底部脱落时，进行下一步操作。
  4. 用无菌移液管将细胞悬液收集至15 mL塑料离心管中。
  5. 用 5 mL 含钙 PBS 中和解离试剂2+ 和 Mg2+.
  6. 离心沉淀细胞（200 × g，3 分钟）。
  7. 移除上清液，轻轻弹击离心管，以松动沉淀物。
  8. 在1 mL干细胞培养基中重悬细胞。
  9. 使用自动细胞计数器，按照供应商说明书进行细胞计数。
  10. 每孔（96孔板）接种20,000个活细胞于50 µL干细胞培养基中，培养基中添加2 µM RHO/ROCK信号通路抑制剂（参见 表1和表2).
  11. 24 小时后，观察细胞贴壁情况，并更换为含有 2 µM RHO/ROCK 通路抑制剂和 6 ng/mL 己二甲溴铵的 100 µl 干细胞培养基（参见 表1 和 2），慢病毒转染前一小时。
    注意：细胞应牢固贴附于培养板底部。
  12. 将Id1慢病毒置于冰上解冻。
  13. 每孔加入 3 µL 纯化的慢病毒（病毒滴度应在 108 到 109 TU/mL），然后将培养板放回细胞培养箱（37 °C，5% CO₂）中继续培养。2，20% O₂2).
  14. 病毒感染后24小时，向感染的细胞中加入100 µL新鲜干细胞培养基。
  15. 慢病毒感染48小时后，将含有病毒的培养基更换为200 µL新鲜干细胞培养基，其中添加1 µg/mL嘌呤霉素。
  16. 每天更换培养基，加入200 µL干细胞培养基，并补充1 µg/mL嘌呤霉素。
  17. 当细胞培养达到 80% 汇合度时，使用不含 Ca 的 200 µL PBS 解离细胞2+ 和 Mg2+ + 0.5 mM EDTA（适用于96孔板的一个孔）。
  18. 将细胞悬液收集至离心管中。
  19. 用 5 mL 含 Ca 的 PBS 中和解离试剂2+ 和 Mg2+.
  20. 离心沉淀细胞（200 × g，3 分钟）。
  21. 移除上清液，轻轻弹击离心管，以松动沉淀物。
  22. 用添加了2 µM RHO/ROCK通路抑制剂的干细胞培养基重悬细胞，体积为1 mL。
  23. 将所有细胞（1 mL）转移至12孔板中已包被的孔内。
  24. 24小时后，观察细胞在孔板中的贴壁情况，并在转导前1小时更换为1 mL干细胞培养基，培养基中添加2 µM RHO/ROCK通路抑制剂和6 ng/mL六亚甲基溴化铵。
  25. 将Id1慢病毒在冰上解冻。
  26. 每孔加入 5 µL 纯化的病毒（12 孔板）。
  27. 慢病毒感染24小时后，将含有病毒的培养基更换为1 mL新鲜干细胞培养基，其中添加3 µg/mL嘌呤霉素。
  28. 慢病毒感染48小时后，将含有病毒的培养基更换为1 mL新鲜干细胞培养基，其中添加6 µg/mL嘌呤霉素。
  29. 当细胞培养达到80%融合度时，使用500 µL不含Ca的PBS解离细胞2+ 和 Mg2+ 以及含0.5 mM EDTA（适用于12孔板的一个孔）。
  30. 将一半（250 µL）细胞悬液转移至已包被试剂的6孔板的一个孔中，该孔内含有2 mL添加了2 µM RHO/ROCK信号通路抑制剂的干细胞培养基。
  31. 使用剩余的一半样本（250 µL）进行RNA提取和qRT-PCR，以确定慢病毒介导的 Id1 表达水平，如 Colas 中所示 等 (2012)4.
    注意：重要提示：如果 Id1 mRNA 表达水平低于 0.005 倍 GAPDH 表达水平（参见 表3 对于qRT-PCR引物），重复上述感染过程，直至Id1表达水平超过阈值。

2. hPSCsId1 的维持

  1. 将hPSCsId1在包被的6孔板中培养，每孔加入3 mL干细胞培养基，并补充6 µg/mL嘌呤霉素。
  2. 当hPSCsId1达到80%融合度时，使用无酶解离试剂按照生产商说明书将细胞以集落形式传代（1:6传代比例），每孔加入3 mL干细胞培养基，并补充6 µg/mL嘌呤霉素。

3. 分化前人多能干细胞Id1 的制备

  1. 用包被试剂对12孔板进行包被，每孔500 µL。
  2. 当hPSCsId1达到90%融合度时，通过每孔加入1 mL不含Ca2+和Mg2+但含有0.5 mM EDTA的PBS溶液，孵育5–10分钟使细胞解离。每隔1分钟检查一次解离情况，当80%的细胞已从培养板上脱落时，进行下一步操作。
  3. 将细胞悬液收集至离心管中。
  4. 加入5 mL含Ca2+和Mg2+的PBS以中和解离试剂。
  5. 离心收集细胞（200 × g，3分钟）。
  6. 弃去上清液，轻轻弹击离心管以松动细胞沉淀。
  7. 将细胞重悬于2 mL干细胞培养基中，培养基中添加2 µM RHO/ROCK信号通路抑制剂。
  8. 使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。
  9. 每孔接种300,000个细胞至1 mL干细胞培养基中，培养基中添加2 µM RHO/ROCK信号通路抑制剂和6 µg/mL嘌呤霉素，并将培养板转移至组织培养孵箱中。
  10. 每日更换培养基，加入含6 µg/mL嘌呤霉素的2 mL干细胞培养基，直至细胞达到90%融合度。此时开始心肌细胞分化（下一步）。

4. 将hPSCsId1分化为第一心区样心脏前体细胞（FHF-L CPs）

  1. 对于12孔板体系，在第0天启动分化，用1.5 mL添加了Activin A（100 ng/mL）的诱导培养基（表1）替换干细胞培养基（不同板型所需的推荐体积和Activin A浓度参见表2）。
  2. 在第1天（启动分化24小时后），每孔12孔板更换为2 mL不含Activin A的诱导培养基。
  3. 在第3天，每孔12孔板更换为2 mL不含Activin A的诱导培养基。
  4. 在第5天，收集FHF-L CPs用于冷冻保存（下一步）。
    注意：重要提示：建议在此阶段进行冷冻保存，因为这可以将心脏前体细胞的生成与后续心肌细胞的生产分离开来，并实现大量细胞批次的生物样本库储存。另请注意，第5天的FHF-L CPs也可转移至新包被的培养板以继续分化，具体操作请参阅步骤5.1–5.5以传代FHF-L CPs，然后进入步骤6.5继续分化。

5. FHF-L CPs 的冷冻保存

  1. 吸弃含有第5天FHF-L CP的孔板中的全部培养基，迅速加入1 mL预热（37 °C）的含酶1x解离试剂（见材料表）。将培养板放入组织培养孵箱中。
  2. 1分钟后，在孵箱内左右轻轻摇动培养板。
  3. 2分钟（总时间）后，从孵箱中取出培养板，加入1 mL含10% FBS的培养基。
  4. 使用5 mL移液器轻柔吹打细胞，促进细胞从培养板表面脱离。
  5. 将细胞悬液收集至离心管中，于200 × g离心3分钟，收集细胞沉淀。
  6. 用2 mL冻存液重悬细胞沉淀。
  7. 使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。
  8. 加入适量体积的冻存液（见材料表），使细胞浓度达到目标冻存浓度（通常为5–10 × 106 个细胞/mL）。
  9. 将细胞转移至冻存管中，放入程序降温盒（降温速率为1 °C/min），并将降温盒置于-80 °C冰箱中过夜。
  10. 24小时后，将冻存管转移至液氮中进行长期保存。
    注意：本实验方案可在此处暂停。

6. FHF-L CP 向心室样心肌细胞的分化

  1. 将第5天的FHF-L CPs冻存管从液氮储存中取出，放入干冰容器中。
  2. 将冻存管置于37 °C水浴中2至3分钟，直至细胞悬液完全解冻。
    注意：重要提示：解冻过程对时间敏感。细胞在冻存液中暴露时间过长（即超过10分钟）会降低细胞活力。
  3. 根据解冻的冻存管数量，将细胞转移至15 mL或50 mL离心管中。
  4. 将预热（37 °C）的心源性培养基（表1）以滴加方式（每30秒5滴）加入细胞悬液中。持续此操作，直至达到1:3的冻存液:心源性培养基比例。此时，加快心源性培养基的添加速度，直至达到1:10的冻存液:心源性培养基比例。
    注意：重要提示：渗透压的快速变化会增加解冻过程中的细胞死亡；因此，强烈建议按上述方法逐滴添加心源性培养基。
  5. 将细胞悬液离心（200 × g，3分钟），收集细胞沉淀。
  6. 吸除上清液，并轻轻弹击离心管以松动细胞沉淀。
  7. 用添加了2 µM RHO/ROCK信号通路抑制剂的心源性培养基重悬细胞。
    注意：细胞活力在不同批次解冻之间可能存在差异，通常>65%的细胞活力预示着良好的接种效率。
  8. 用添加了2 µM RHO/ROCK信号通路抑制剂的心源性培养基稀释浓缩的细胞悬液，以获得所需接种浓度（不同培养板规格的接种浓度参见表2）。
    注意：重要提示：若细胞接种密度过低，可能导致心肌分化效率下降。
  9. 将细胞接种至培养板中。
  10. 将培养板置于生物安全柜中静置20分钟后，再转移至细胞培养箱中。
  11. 在分化第6天，观察细胞贴壁情况。
    注意：心肌前体细胞在分化第5天进行冻存，解冻后24小时即为分化第6天。
    注意：出现漂浮（死亡）细胞是常见现象。
  12. 在分化第7天，吸除50%的培养基，并补充等量的新鲜心源性培养基。
    注意：此后无需再在心源性培养基中添加RHO/ROCK信号通路抑制剂。
  13. 每隔一天更换50%的心源性培养基。
  14. 注意观察分化第11至第13天之间出现的自发性搏动。
  15. 在分化第15天，使用DAPI（细胞核染色）和ACTC1（泛心肌标志物）通过免疫荧光法定量评估心肌分化效率。

7. 心室样心肌细胞的传代与维持

注意：到第14–16天时，应获得一层自发收缩的类似心室的心肌细胞单层。此时建议将心肌细胞解离并重新接种，以使培养物均一化，并防止细胞从培养板上脱落。

  1. 吸去孔板中所有培养基，迅速加入 1 mL 预热（37 °C）的含酶解离试剂（1×）。
    注意：含酶解离试剂（1×）的使用体积因孔板规格而异，但应完全覆盖孔底表面。
  2. 将孔板转移至组织培养孵箱中。
  3. 在孵箱内每 2 分钟轻轻左右摇晃孔板一次，以加速细胞脱离过程。
  4. 5–15 分钟后，当 80% 至 100% 的细胞已从孔底脱离时，取出孔板，并加入等体积含 10% FBS 的培养基以终止含酶解离试剂（1×）的活性。
    注意：本步骤中使用含酶解离试剂（1×）的孵育时间可能因批次不同而有所差异。
  5. 将细胞悬液收集至离心管中。
  6. 用移液器混匀细胞悬液，并使用自动细胞计数仪进行细胞计数。
  7. 用添加了 2 µM RHO/ROCK 通路抑制剂的维持培养基将细胞悬液稀释至所需细胞浓度（不同孔板规格参见 表 2）。
  8. 将心肌细胞接种至孔板后，轻轻晃动使细胞分布均匀，并在将孔板转移至组织培养孵箱前静置 10–20 分钟以促进细胞贴壁。
  9. 传代后 24 小时，观察细胞贴壁及恢复情况。
    注意：悬浮（死亡）细胞的存在较为常见。传代后 48–72 小时，心肌细胞应恢复自发性搏动。
  10. 为维持心肌细胞培养，每隔一天更换 50% 培养基为维持培养基，直至用于后续实验的类心室心肌细胞投入使用。

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结果

生成 hPSCsId1细胞系
hPSCs 通过慢病毒感染实现 Id1 过表达（图 1A）。一旦生成 hPSCId1 细胞，即通过 qRT-PCR 定量转基因表达水平（图 1B）。仅当 hPSCId1 细胞系中 Id1 mRNA 的表达水平高于 GAPDH 的 0.005 倍时，方可用于后续分化实验。

hPSCsId1 的维持与分化前准备<...

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讨论

为了获得成功的分化效果，请务必严格遵循上述列出的步骤。此外，我们在此强调几个对分化结果有显著影响的关键参数。在开始分化前，应观察以下三个形态学指标：人多能干细胞Id1具有明显的干细胞形态、细胞间高度紧密聚集，以及在第0天时培养物达到高汇合度（>90%）。为此，最佳的分化条件是将解离后的hPSCsId1以单细胞形式接种，使其形成紧密聚集的单层细胞，并在2至3天内生长至约90%的汇合度。相反，如果hPSCId1培养物表现出细胞和克隆形态不良、克隆间紧密度低，以及培养体系中存在大范围的自发分化区域，则前心场样心前体细胞（FHF-L CP）的分化很难成功。

培养基体积和Activin A浓度是前侧前肠类器官（FHF-L CP）分化过程中的关键参数，且依赖于培养板的规格（见表2）。此外，需要注意的是，最佳Activin A浓度可能因所使用的hPSC细胞系不同而有所差异，可能需要进行浓度优化。

Id1 mRNA 在...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Colas 实验室的成员提供的有益讨论以及对本文手稿的审阅。本研究得到了美国国立卫生研究院/国家环境卫生科学研究所（NIH/NIEHS）R44ES023521-02 项目和加州再生医学研究所（CIRM）DISC2-10110 项目对 Colas 博士的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ACTC1 抗体SigmaA7811
激活素A干细胞技术Hu Recom Activin A
抗生素-抗真菌素（Anti-Anti）赛默飞世尔科技15240062
B27添加剂赛默飞世尔科技17504044
B27添加剂（不含胰岛素）赛默飞世尔科技A1895601
B27添加剂（不含维生素A）赛默飞世尔科技12587001
CDH5抗体R&D SystemsAF938
CryoStor CS10干细胞技术7930冷冻保存试剂
DMEM高糖Mediatech10-013-CV 
含钙 DPBS && Mg康宁21-030-CV
EDTA赛默飞世尔科技15575-038
FBSVWR89510-186
FluoVolt 膜电位检测试剂盒  赛默飞世尔科技F10488关于光学动作电位的采集，请参阅 McKeithan 等，2017
KnockOut血清替代物Gibco10828010
基质胶，生长因子减量型康宁356231包被试剂
mTeSR1 培养基套装干细胞技术5850
不含钙的 PBS && Mg康宁21-040-CV
青霉素-链霉素Gibco
嘌呤霉素 阿克罗斯227422500
ReLeSR干细胞技术5872无酶解离试剂
RPMI 1640赛默飞世尔科技11875-093
TAGLN 抗体Abcamab14106
Thiazovivin干细胞技术72254RHO/ROCK 通路抑制剂
TrypLE Express赛默飞世尔科技12605 -010含酶消化液（1X）
Tyrodes 溶液混合包  SigmaT2145-10X1L（关于光学动作电位采集，请参见 McKeithan 等，2017）

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