本文介绍一种可扩展的方法，通过简单组合使用Activin A和慢病毒介导的Id1过表达，从人类多能干细胞中生成第一心区样心脏前体细胞和心室样心肌细胞。
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方法文章
从人多能干细胞生成第一心场样心脏前体细胞及心室样心肌细胞
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
大量生成具有特定心区来源的功能性人类多能干细胞衍生的心脏前体细胞和心肌细胞，是细胞治疗心脏疾病及进行疾病建模的前提条件。我们近期研究发现，Id 基因在脊椎动物发育过程中对第一心区前体细胞的特化具有必要且充分的作用。本分化方案基于上述发现，利用 Id1 过表达联合 Activin A 作为强有力的命运特化信号，诱导产生类似第一心区（FHF-L）的前体细胞。重要的是，这些前体细胞可高效分化为类似心室的心肌细胞，效率约为 70–90%。本文中，我们详细描述了两个步骤：1）生成过表达 Id1 的人多能干细胞（hPSCs）；2）大规模分化可冻存的 FHF-L 前体细胞及类似心室的心肌细胞。
引言
大规模生产人多能干细胞（hPSCs）来源的心脏前体细胞和心肌细胞，是干细胞治疗1、疾病建模2,3以及快速鉴定调控心脏分化4,5,6和生理功能7,8的新通路的先决条件。尽管已有大量研究9,10,11,12,13,14,15报道了高效的人多能干细胞向心肌细胞分化的方案，但均未明确所获得心肌细胞的心区来源，尽管已发现左心室心肌细胞（第一心区）与右心室心肌细胞（第二心区）之间存在显著的分子差异
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方案
1. Id1 病毒的制备与感染
- 通过将 pCMVDR8.74、pMD2.G 和 pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR（Addgene：质粒 #107735）共转染至 HEK293T 细胞中，生成 Id1 过表达的慢病毒。收集病毒颗粒，从上清液中过滤并纯化，然后于 -80 °C 保存，方法同 Kitamura 等 (2003)19或者，可将 pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR 载体送至慢病毒生产服务商，通过商业途径制备 Id1 慢病毒。
注意：请遵循慢病毒安全规范和标准操作规程。
注意：重要提示：最佳病毒滴度应至少达到 108 至 109 转导单位/毫升（TU/mL） - 感染前，将50 µl包被试剂加入96孔板的一个孔中进行包被，该试剂通常为Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞分泌的明胶状蛋白质混合物（参见 材料表).
- 在6孔板中培养的一孔多能干细胞，通过加入1 mL不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS进行解离2+ 和 Mg2+ 含0.5 mM EDTA。
注意：消化时间因情况而异，通常为 3–10 分钟。当超过 80% 的细胞从培养板底部脱落时，进行下一步操作。 - 用无菌移液管将细胞悬液收集至15....
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结果
生成 hPSCsId1细胞系
hPSCs 通过慢病毒感染实现 Id1 过表达（图 1A）。一旦生成 hPSCId1 细胞，即通过 qRT-PCR 定量转基因表达水平（图 1B）。仅当 hPSCId1 细胞系中 Id1 mRNA 的表达水平高于 GAPDH 的 0.005 倍时，方可用于后续分化实验。
hPSCsId1 的维持与分化前准备<.......
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讨论
为了获得成功的分化效果，请务必严格遵循上述列出的步骤。此外，我们在此强调几个对分化结果有显著影响的关键参数。在开始分化前，应观察以下三个形态学指标：人多能干细胞Id1具有明显的干细胞形态、细胞间高度紧密聚集，以及在第0天时培养物达到高汇合度（>90%）。为此，最佳的分化条件是将解离后的hPSCsId1以单细胞形式接种，使其形成紧密聚集的单层细胞，并在2至3天内生长至约90%的汇合度。相反，如果hPSCId1培养物表现出细胞和克隆形态不良、克隆间紧密度低，以及培养体系中存在大范围的自发分化区域，则前心场样心前体细胞（FHF-L CP）的分化很难成功。
培养基体积和Activin A浓度是前侧前肠类器官（FHF-L CP）分化过程中的关键参数，且依赖于培养板的规格（见表2）。此外，需要注意的是，最佳Activin A浓度可能因所使用的hPSC细胞系不同而有所差异，可能需要进行浓度优化。
Id1 mRNA 在.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Colas 实验室的成员提供的有益讨论以及对本文手稿的审阅。本研究得到了美国国立卫生研究院/国家环境卫生科学研究所（NIH/NIEHS）R44ES023521-02 项目和加州再生医学研究所（CIRM）DISC2-10110 项目对 Colas 博士的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ACTC1 抗体 | Sigma | A7811 | |
| 激活素A | 干细胞技术 | Hu Recom Activin A | |
| 抗生素-抗真菌素（Anti-Anti） | 赛默飞世尔科技 | 15240062 | |
| B27添加剂 | 赛默飞世尔科技 | 17504044 | |
| B27添加剂（不含胰岛素） | 赛默飞世尔科技 | A1895601 | |
| B27添加剂（不含维生素A） | 赛默飞世尔科技 | 12587001 | |
| CDH5抗体 | R&D Systems | AF938 | |
| CryoStor CS10 | 干细胞技术 | 7930 | 冷冻保存试剂 |
| DMEM高糖 | Mediatech | 10-013-CV | |
| 含钙 DPBS && Mg | 康宁 | 21-030-CV | |
| EDTA | 赛默飞世尔科技 | 15575-038 | |
| FBS | VWR | 89510-186 | |
| FluoVolt 膜电位检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | F10488 | 关于光学动作电位的采集，请参阅 McKeithan 等，2017 |
| KnockOut血清替代物 | Gibco | 10828010 | |
| 基质胶，生长因子减量型 | 康宁 | 356231 | 包被试剂 |
| mTeSR1 培养基套装 | 干细胞技术 | 5850 | |
| 不含钙的 PBS && Mg | 康宁 | 21-040-CV | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | ||
| 嘌呤霉素 | 阿克罗斯 | 227422500 | |
| ReLeSR | 干细胞技术 | 5872 | 无酶解离试剂 |
| RPMI 1640 | 赛默飞世尔科技 | 11875-093 | |
| TAGLN 抗体 | Abcam | ab14106 | |
| Thiazovivin | 干细胞技术 | 72254 | RHO/ROCK 通路抑制剂 |
| TrypLE Express | 赛默飞世尔科技 | 12605 -010 | 含酶消化液（1X） |
| Tyrodes 溶液混合包 | Sigma | T2145-10X1L | （关于光学动作电位采集，请参见 McKeithan 等，2017） |
参考文献
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-....
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重印与许可
