本文介绍了一种在活细胞细胞器中对单个膜蛋白进行多色定位的实验方案。通过使用自标记蛋白来连接荧光染料，可对同一细胞器不同膜区室中分布的蛋白质实现约18 nm精度的定位。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
了解蛋白质在细胞亚区室中的定位对于阐明其特定功能至关重要。本文介绍一种超分辨率技术，该技术通过生成蛋白质的定位图和追踪图，确定蛋白质可进入的微区室。此外，利用多色定位显微镜，可同时获得不同亚区室中蛋白质的定位与追踪特征。该技术专用于活细胞，基于对单个可移动膜蛋白的重复成像。目标蛋白通过基因工程与特定的自标记标签融合表达。这些标签是能够以共价方式与底物发生反应的酶，底物上连接有荧光染料。酶标记蛋白与荧光标记底物反应后，即可实现蛋白标记。本文中使用的荧光染料为四甲基罗丹明（Tetramethylrhodamine, TMR）和硅基罗丹明（Silicon Rhodamine, SiR），它们分别连接在相应酶的底物上。通过使用皮摩尔（pM）至纳摩尔（nM）浓度范围的底物，可实现亚化学计量比标记，从而获得清晰可分辨的信号。这些信号的定位精度约为 15–27 nm。该技术支持单分子多色成像，颜色数量受限于可用的膜通透性荧光染料以及自标记酶的种类。我们通过检测质量控制酶——PTEN诱导的激酶1（PINK1）在不同线粒体区室中的定位及其在加工过程中与其他膜蛋白的关系，验证了该技术的可行性。然而，由于标记效率较低，同时标记两个相邻蛋白的概率较小，因此该方法在利用单分子FRET或共追踪来验证不同标记单个蛋白之间真实物理相互作用方面存在局限性。尽管该技术在膜区室蛋白成像方面具有优势，但在大多数情况下并不适用于高移动性可溶性蛋白的定位研究。
引言
本实验方案的目的是提供一种成像方法，用于在活细胞内对单个膜蛋白进行定位和追踪。我们将该方法称为追踪与定位显微镜技术（Tracking and Localization Microscopy, TALM）1,2。与随机光学重建显微镜技术（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM）3 和荧光激活定位显微镜技术（(F)PALM）4,5 类似，TALM 是一种基于单分子的荧光定位技术。然而，该方法的独特之处在于，通过结合膜蛋白的运动性以及对同一标记分子在不同位置的重复成像，能够揭示出可移动蛋白所能到达的微区室。换句话说，蛋白可能的定位范围由细胞器的结构以及蛋白自身的运动性共同决定1。该方法与其他多种超分辨率成像技术具有互补性6,7,8，因为它通过成像可移动蛋白来生成定位图和轨迹图。标记方法基于使用基因工程构建的融合蛋白，这些融合蛋白本身不具荧光。这些融合蛋白是可自标记的酶，能与连接了染料的底物发生共价反应。该策略的优势在于，可通过添加底物的量来控制标记程度。此外，还可根据所选的偶联染料来调整荧光颜色。目前已有多种可用的自标记酶标签9。使用自标记酶标签的另一个优势是，偶联染料通常比荧光蛋白更稳定且亮度更高1，因此单个蛋白在漂白前可被更长时间、更精确地记录。这使得可移动蛋白的运动轨迹得以记录，并可从中提取扩散系数10,11。
本文展示了TALM在研究线粒体膜蛋白上的可行性，但该方法也可应用于其他细胞内和细胞外膜蛋白，包括不同类型的细胞12,13。我们证明，多色TALM能够同时区分不同亚区室中的蛋白质，可作为现有超分辨率荧光显微技术的有力补充14,15,16。TALM适用于活细胞成像17。所选用的罗丹明染料四甲基罗丹明（TMR）和硅基罗丹明（SiR）具有优异的光物理特性，特别是其高亮度和稳定性，使得能够在多个成像帧中连续记录单个膜蛋白，从而获得定位（及轨迹）图谱。然而，TALM在定位具有高扩散系数的可溶性蛋白时存在局限性，因为其运动模糊程度过高，且每帧采集的光子数过低，难以实现精确定位。此外，与STORM或受激辐射损耗显微镜（STED）等技术相比，TALM所需的激发光强度更低6,7，从而减轻了光毒性效应。这一点尤为重要，因为光毒性应激常会影响细胞器形态18 ，进而干扰对蛋白运动性的分析19。综上所述，我们提出在活细胞中应用多色TALM技术，该技术填补了定位显微技术（如STORM/STED/(F)PALM）与蛋白运动性分析技术（如光漂白后荧光恢复（FRAP）20,21、荧光相关光谱（FCS）22和荧光互相关光谱（FCCS）11,23）之间的空白。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
以下方案遵循当地机构研究伦理委员会的指导方针。
1. 方法
- 细胞培养
- 在含有5 mL培养基的T25细胞培养瓶中，于37 °C和5% CO2条件下培养细胞，例如HeLa细胞（人宫颈癌细胞）。
注意：用于成像时，将细胞传代至预先准备好的盖玻片上（见步骤1.3和1.4），并置于成像培养基中继续培养。
- 在含有5 mL培养基的T25细胞培养瓶中，于37 °C和5% CO2条件下培养细胞，例如HeLa细胞（人宫颈癌细胞）。
- 细胞转染
注意：尽可能使用稳定表达标签蛋白的细胞系，以避免强烈过表达24。对于瞬时转染，需调整转染所用质粒DNA的用量。例如，采用Ca2+磷酸盐转染法25时，在3.5 cm细胞培养皿中对汇合度为80–90%的细胞使用2.5–5 µg质粒DNA进行转染。进行双质粒共转染时，每种质粒各使用2.5 µg。- 对于双色实验，可使用一种稳定表达一种自标记蛋白的细胞系，并瞬时转染编码另一种自标记蛋白的质粒17。
注意：本实验中，双色实验采用的HeLa细胞系稳定表达自标记蛋白PINK1-Halo-Tag和Tom20-fSNAP-Tag。
- 对于双色实验，可使用一种稳定表达一种自标记蛋白的细胞系，并瞬时转染编码另一种自标记蛋白的质粒17。
- 盖玻片清洗
- 将盖玻片放入烧杯中，加入30 mL H2O，轻轻振荡以去除其表面灰尘。
- 用镊子夹取盖玻片，并用氮气流吹干。
- 去除盖玻片表面的有机污染物，例如，通过等离子清洗。
注意：为避免玻璃材料进一步污染，操作盖玻片时应佩戴手套。
警告：当采用等离子清洗法清洁盖玻片时，仅上表面被清洁；应使用该面进行聚-L-赖氨酸-聚乙二醇-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（PLL-PEG-RGD）的包被（第1.4节）及细胞接种（第1.5节）。
- PLL-PEG-RGD包被盖玻片
注意：PLL-PEG-RGD是一种聚-L-赖氨酸（PLL）衍生物，连接有聚乙二醇（3,000 Da）和半胱氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸（CGRGDS）肽段。PLL可结合带负电荷的玻璃表面并形成PEG刷状结构，显著减少带电荧光染料的非特异性结合。此外，RGD基序模拟整合素受体的信号肽，从而促进原本不易贴壁的细胞通过整合素介导的方式贴附。- 按先前所述方法制备PLL-PEG-RGD26。简而言之，将0.8 mg PLL-PEG-RGD溶解于1 mL PBS中。取10 µL PLL-PEG-RGD溶液滴加于洁净盖玻片的上表面。
- 取另一张盖玻片，将其洁净面朝下覆盖在第一张盖玻片（已滴有PLL-PEG-RGD液滴）上，使PLL-PEG-RGD溶液夹在两张盖玻片之间，形成“三明治”结构。
- 小心将叠合的盖玻片放入烧杯中，在无尘干燥环境中室温孵育1小时。
- 1小时后，向烧杯中加入30 mL H2O，确保盖玻片完全浸没于水中。
- 轻轻振荡烧杯，直至两张盖玻片彼此分离。
- 用镊子将盖玻片从水中取出，并在氮气流下吹干。
注意：包被后的盖玻片可在带盖的干燥无菌玻璃培养皿中保存数天。
- 成像样本制备
- 将单个包被的盖玻片转移至35 mm细胞培养皿中，确保PLL-PEG-RGD包被面朝上，并在其上方加入2 mL成像培养基。
- 向含有包被盖玻片的35 mm培养皿中的2 mL成像培养基内加入约500,000个经胰酶消化的细胞（200–500 µL），这些细胞应在其相应的膜蛋白上表达自标记标签。手动轻轻摇晃培养皿，确保细胞均匀分布，形成均一的细胞层。
- 在37 °C和5% CO2条件下孵育细胞，直至细胞汇合度达到80%。
注意：细胞样本应在成像前3天接种，转染前1天接种。对于稳定表达目标蛋白的细胞，可在成像前2天接种。后续仅对生长在盖玻片上的细胞进行成像。
- 标签蛋白标记
注意：大多数荧光底物需溶于无水DMSO中。当最终标记浓度为0.2–30 nM时，建议使用1 µM荧光底物的储存液17。若需对细胞内膜蛋白进行成像，应使用膜通透性荧光底物。- 将成像培养基在水浴中预热至37 °C。
- 取1 mL预热的成像培养基加入带盖的2 mL离心管中，从1 µM储存液中加入0.2–30 µL荧光底物，配制最终标记溶液（终浓度：0.2–30 nM）。
- 涡旋震荡标记溶液10秒。
- 将含有盖玻片细胞的35 mm培养皿中的培养基更换为1 mL已配制好的标记溶液（见步骤1.5）。
- 在37 °C和5% CO2条件下，将细胞在标记溶液中孵育20–30分钟。
- 用2 mL PBS洗涤细胞一次，再用2 mL成像培养基洗涤两次。最后向培养皿中加入1 mL新鲜成像培养基，将样本放回37 °C和5% CO2的培养箱中孵育至少1小时。成像前再更换一次成像培养基。
注意：首次进行实验时，建议使用市售的细胞器特异性染料对细胞器进行染色，以确认自标记蛋白是否正确靶向至细胞器膜27,28。在此情况下，建议使用100–200 nM底物浓度，以获得较强的信号。
- 荧光微球样本制备
注意：为确定光学漂移并实现不同通道图像的对齐，需使用多色荧光微球（0.1 µm）。通过所记录的图像，可生成两个发射通道之间的仿射变换矩阵。- 用纯H2O将微球溶液稀释至1%。
- 在已清洗的盖玻片（见步骤1.3）上五个不同位置各滴加5滴含荧光微球的稀释液。
- 将荧光微球样本置于洁净台中自然干燥。
注意：该样本可重复使用，因此应使用铝箔覆盖以防止污染，并在4 °C条件下保存。
2. 显微镜检查
- 实验装置
注意：用于双色单分子成像的基本显微系统基于倒置显微镜，配备两台激光器，通过多模光学保偏单模光纤耦合至单一全内反射（TIR）聚光镜，搭配专为TIRF设计的油浸物镜、多波段发射滤光片、图像分光器以及高灵敏度相机图1需要一个TIR聚光镜，能够连续调节入射角，以在落射式、高度倾斜和层状光片（高度倾斜薄层照明（HILO））之间切换29），并采用优化穿透深度的全内反射荧光（TIRF）激发模式。图像通过高灵敏度冷却探测器系统采集， 例如， 背照式电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机（量子效率 QE >90%）或 sCMOS 相机（QE >80–90%).- 通过在与后续实验相同条件下成像荧光微珠（见步骤 2.2）来确定光学漂移， 例如，当实验中记录了10,000帧时，也需对珠样样本记录10,000帧。为确定光学漂移，比较珠子在第一帧与最后获取帧中的位置（图1B）。如有必要，随后对图像序列进行光学漂移校正30 和/或使用漂移稳定的环境。
- 使用合适的二向色镜分光器装配滤光立方体， 例如，用于橙色和红色荧光，以及适用于橙色荧光和红色荧光的相应发射滤光片。为图像分光器配备合适的滤光片。通过在两个通道中分别记录单色样品来检测信号是否可能从一个通道泄漏到另一个通道图1C).
图 1：使用橙色和红色发射荧光团的多色追踪与定位显微镜（TALM）光学布局。（A）倒置显微镜装置，包含至少两个激发激光器、TIRF 聚光镜、适用于 TIRF 的物镜、图像分光器和高灵敏度相机。插图：为激发细胞内细胞器，入射光束角度必须设置为小于 TIRF 的临界角，以实现高度倾斜且层状的光片照明（HILO）。DC1：二向色镜 1；DC2：二向色镜 2；EF：发射滤光片。（B）通过以与后续实验相同帧率（此处为 15 Hz）连续采集 10,000 帧荧光微球位置图像来检测光学漂移。前 500 帧和后 500 帧位置的连接轨迹显示漂移情况。此外，将首帧与末帧位置分别以红色和蓝色叠加成像，显示漂移极小。漂移量定义为信号中心之间的距离除以总记录时间，此处为 125 pm/s。（C）检测信号分离的清晰度，此处为 TMR 与 SiR。对两个通道分别生成 3,000 帧的累积和图像（TMR 位于通道 1，SiR 位于通道 2）。SiRHTL 标记 Tom20-HaloTag，TMRHTL 标记氧化磷酸化复合体 V-HaloTag。颜色为伪彩。比例尺 = 100 nm（B）和 1 µm（C）。请点击此处查看该图的放大版本。
- 图像分束器生成图像的物理对齐
注意：对于在盖玻片上制备的样品，可使用自制的样品台（图 2A）。为避免灰尘， 等等。 将培养皿盖子松散地盖在成像室上方，以防样品落入其中。同一载样台可用于固定带有荧光微珠或细胞的盖玻片；当对细胞进行成像时，加入0.5–0.8 mL成像培养基。图像分光器将图像分成两个或多个光谱分离的通道，并将其并排投射到同一相机上。由于不同通道经过独立的光路，该过程可能在通道之间引入系统性畸变，并妨碍直接的共定位分析。因此，需首先进行物理对准，其次利用变换矩阵进行后期校正对准。在两种对准过程中，荧光微珠应在整个视野内均匀分布。- 将含有荧光微球的制备样品安装在样品架中，置于聚四氟乙烯（PTFE）环与红色橡胶环之间（图2A).
- 启动显微镜、所有硬件组件以及显微成像所需的所有软件。
- 用沾有异丙醇的无绒布擦拭物镜和盖玻片底部，然后用一张新的无绒布将两者擦干。在物镜的镜片孔上滴加一滴浸油。
- 将装有微珠样品的样品架放置在显微镜载物台上，使盖玻片底部接触浸油。使用透射光或激光线对微珠进行聚焦。
- 调节两束激发激光的功率，使两个荧光通道中的信号强度相近。寻找一个具有多个明显荧光信号的区域。
- 使用相机控制软件生成荧光通道的合并图像。然后通过图像分光器上的螺丝手动调节其内部反射镜的角度，以实现两个荧光通道信号的最佳重叠图2B).
注意： 注意！ 切勿超出相机的动态范围。
- 通过执行空间变换的软件对光谱分离的通道进行对齐
注意：以下部分展示了使用我们软件插件（可应要求提供）进行校正后配准与定位的流程。- 启动TIRF显微镜控制软件，并选择在实时成像模式下分别显示各个通道。拍摄一张在所有通道中激发荧光的快照图像（图2C).
- 使用此快照图像生成变换矩阵（参见 图2).
注意：变换矩阵用于空间变换，通常为仿射变换，以校正平移（两个通道间单点光源信号的偏移）。 - 启动软件分析插件（可向本实验室申请获取，详见 图2C).
- 载入先前记录的荧光微球双色图像（参见步骤 2.2）至软件中。选择所使用的荧光通道方向。当提示“校准图像”时，点击“是”，并选择先前拍摄的快照。
- 打开“单元管理器”以定义单位转换系数（像素大小、帧率、光子转换系数）。
- 打开“定位管理器”。首先确定点扩散函数（PSF）。点击按钮：“PSF 半径”。在弹出的“PSF 估计器”窗口中，定义数值孔径和发射波长最大值。通过点击“估计 PSF 半径”开始估算。接受所获得的实验 PSF。设定评估区域、去卷积循环次数以及用于计算的计算机核心数量。按下“定位”以启动对单个粒子强度分布的二维对称高斯函数拟合图 2C).
- “接受”获得的实验点扩散函数（PSF）。定义评估区域、去卷积循环次数以及用于计算的计算机核心数量。点击“localize”以启动对单个粒子强度分布的二维对称高斯函数拟合图2C).
- 打开“校准管理器”。在两个通道的融合渲染图像中，显示原始信号和定位的中心点。选择“仿射”模式。通过绘制连接线，手动连接来自同一荧光微球的两个通道中对应的定位中心点对。
- 连接分布在视野各处的相应信号。完成后，按“接受”。保存校准结果。
注意：空间变换在每个荧光小球处进行采样，并在其间进行插值。所提取的变换函数表示一个位移场 Δr(x,y)，用于随后校正实验中的双色单分子定位数据，使其在定位精度范围内重叠。空间变换矩阵通常为仿射变换矩阵，可校正通道间的平移、缩放和旋转，精度达到纳米级别，该矩阵可通过本手册中的一对一映射方法推导得出。图2C).
图 2：双色通道对齐的工作流程。（A）将带有荧光微球的盖玻片安装在样品 holder 中，置于聚四氟乙烯（PTFE）环和橡胶环之间，然后用螺栓将腔室的上下部分固定在一起。（B）由图像分光器产生的通道视图的物理对齐。记录来自两个通道（绿色和红色，伪彩色）中荧光微球（0.1 µm）的信号并进行合并。通过手动调节光学图像分光器上的相应螺丝，使不同通道信号的最佳重叠（黄色，下层面板）得以实现。（C）生成用于后期处理的通道对齐变换矩阵。为了精确定位颗粒，必须根据发射波长和物镜的数值孔径确定点扩散函数（PSF）。通过使用对称的二维高斯拟合分析其强度分布，可确定 PSF 的中心位置。将拟合得到的信号峰值定位结果投射到原始模糊信号上。在合并图像中，连接两个通道信号的定位中心，生成变换矩阵，该矩阵随后用于实验数据的后期对齐处理。比例尺 = 1 µm（B, C）。请点击此处查看该图的放大版本。
- 单分子成像技术观察线粒体膜蛋白
注意：所有实验均在室温下进行。在成像前，T细胞或非贴壁细胞必须固定在琼脂糖中。31.- 将带有贴壁细胞的盖玻片置于橡胶环和聚四氟乙烯环之间固定图3A）。向腔室中加入 0.5–0.8 mL 成像培养基。
- 重复步骤 2.2.2–2.2.5。
- 调整TIRF显微镜控制软件中的照明角度，使入射角小于全内反射模式的临界角，从而通过HILO光片激发特定的兴趣区域32 （高激发低观察模式， 图1A).
警告：避免激光束直射眼睛！ - 设置EM增益，并选择适合实验的曝光时间，以确保每帧采集到足够的光子。
- 将激光功率设置为获得高信噪比（S/N）图3B），因为定位精度直接对应于信噪比33 (图3C).
- 在细胞周边区域寻找无重叠、呈长条形的线粒体及单分子信号图3D; 补充视频 1）。如果未观察到单分子信号，需继续等待直至漂白过程导致单分子信号出现（图3E).
- 记录至信号数量过低而无法合理继续为止（通常为 1,000–10,000 帧，具体取决于荧光染料的漂白行为）， 图3F).
- 启动成像处理软件，并通过生成至少 1,000 个记录帧的累积渲染叠加图像来检查线粒体结构（图3G).
注意：最快帧率由读出区域决定。使用双色图像分光器时，单个通道的视场被缩减为256 × 512像素；使用四色分光器时，视场进一步缩减为256 × 256像素。因此，使用双色图像分光器进行双色成像时，帧率可达30 Hz。应设置帧转移模式以实现尽可能短的读出时间。 - 启动软件分析插件并加载原始数据。选择通道方向并载入图像。当提示“校准图像”时，使用步骤 2.3.9 中的变换矩阵。各通道将被单独显示。
- 打开“UNIT MANAGER”以定义每个通道的单位转换因子。为每个通道打开“LOCALIZATION MANAGER”。然后定义评估区域、去卷积循环次数，添加所用条件下的理论点扩散函数（PSF），并设置用于计算的计算机核心数量。最后，点击“localize”以获得定位的单颗粒结果图3H; 补充视频 2).
- 请注意，该程序最终将生成一幅累积的超分辨率图像，显示所有定位的粒子图3I).
- 进行分析， 例如，可通过开源软件或我们应要求提供的软件实现。
- 在两个局部化通道中追踪单个分子 例如，使用多靶点示踪剂10
注意：步骤 2.4.13 需要预先（实验性）了解目标蛋白的扩散性，以正确设置边界条件。通常，确定正确的边界条件是一个迭代过程。
图3：单分子定位显微镜成像过程中的步骤。（A）将带有样品的盖玻片安装在自制样品架（由 J. Bereiter-Hahn 设计）的顶部和底部部件（灰色）之间。当样品架的两部分用螺栓固定时，橡胶环（红色）和聚四氟乙烯（PTFE）环（白色）分别从盖玻片的上方和下方密封系统。（B）TMR 信号的信噪比。（C）所有已定位粒子的计算定位精度直方图。（D）选择合适的成像区域，此处为线粒体明显分离的细胞边缘区域。（E）记录与图像处理：显示一帧具有清晰单分子信号的图像（此处记录的是 CV-HaloTag/TMRHTL 单分子）。（F）TMR 信号在记录时间内的强度变化。（G）3,000 帧未经处理的累积和图像。（H）利用二维高斯函数从单帧图像中定位的 CV-HaloTag/TMRHTL 粒子。（I）累积渲染后的总和图像，显示来自 3,000 帧的所有已定位 CV-HaloTag/TMRHTL 粒子。请点击此处查看此图的放大版本。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
多色成像与共定位分析有助于确定蛋白质的亚细胞器定位。我们此前已通过细胞质磷酸酶和张力蛋白同源物 PINK1 证实了这一点，该蛋白由于线粒体蛋白酶的加工而在不同线粒体亚区域中具有不同的定位17PINK1 是维持线粒体功能的重要因子34,35以确定PINK1在不同线粒体区室中随着其加工过程的定位情况（图 4A)，在活细胞中进行了多色超分辨率显微成像。因此，将PINK1与一种自标记标签（HaloTag）进行基因融合。为确定其在功能正常与功能障碍线粒体中相对于其他蛋白的定位，选用作为线粒体外膜转位酶复合物（TOM）组分的Tom2036，用另一种自标记标签（SNAP-tag）进行标记。记录了至少1,000帧（每秒96帧）的时间序列图像。一个通道中所有信号随时间累积的图像显示，PINK1定位于细胞质和线粒体中（
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文介绍了一种用于移动膜蛋白双色单分子定位的技术。按照本方案，膜蛋白与自标记蛋白融合，后者可与分别偶联至其对应底物的罗丹明染料TMR和SiR发生反应。罗丹明染料具有高亮度和良好的光稳定性，因此能够实现重复成像1。为确保实验成功，需注意若干条件和关键要点。
首先，选择合适的滤光片和分光器以清晰分离TMR和SiR的信号非常重要。为了减少细胞外背景信号，使用PLL-PEG-RGD对盖玻片进行预清洁和包被是有效的。染料-底物的最终浓度必须根据自标记酶对其底物的亲和力以及酶在细胞内的可及性进行测试。对于线粒体蛋白17 和应激颗粒13，纳摩尔至皮摩尔浓度已足够。对于其他细胞器，所需浓度需另行测试。如果在记录开始时染色过强，无法分辨单个分子，则最好等待荧光染料发生漂白，使其数量减少至可分辨单个粒子（SP）的水平。我们发现，在染色过程中，BG-底物浓度高于30 nM、HTL-底物浓度高于1 nM，或延长染色时间以增加标记分子数量的做法均不可行。每...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢奥斯纳布吕克大学的生物物理学团队和Jacob Piehler提供的持续支持，感谢Wladislaw Kohl提供的技术支持和材料制备，以及CellNanOs委员会提供显微镜设备使用。本项目由SFB 944资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| (2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基)-乙磺酸，1 M) (HEPES) | Biochrom | #1104E | |
| DC1：二向色分光镜 | Chroma | 640 dcxr | NC506031 |
| DC2：多色镜，分光镜 | Chroma | zt405/488/561/640rpc | 已停产 |
| Dulbecco´s 磷酸盐缓冲液 (PBS) 1x (不含 Ca & Mg) | Sigma-Aldrich & Co. | #RNBF8311 | |
| Earle´s MEM，不含酚红、不含 L-谷氨酰胺且不含 NaHCO3，含 1% FBS、0.1% HEPES、0.1% NEAA、0.1% 丙氨酰-L-谷氨酰胺和 34.78% 碳酸氢钠 (NaHCO3 0.75g/l) | 成像培养基 | ||
| Earle´s 最低必需培养基 (MEM)，含酚红，含 1% 优质胎牛血清 (FBS)、0.1% HEPES (2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基)-乙磺酸，1 M) 和 0.1% 非必需氨基酸 (NEAA) | 生长培养基 | ||
| EF：四通道发射滤光片 | AHF analysentechnik | F72-866 | Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm |
| EMCCD 相机 | Andor | Andor iXON 897 | EMCCD 相机 |
| QuadView 滤光立方体发射滤光片，橙色 | AHF analysentechnik | F39-637 | 带通 582 - 619 nm |
| QuadView 滤光立方体发射滤光片，红色 | Chroma | 带通 655 - 725 nm (HQ 690/70) | |
| FBS（胎牛血清）优质 | Biochrom | S0615 | |
| 荧光微球：TetraSpeck™ 微球，0.1 µm，荧光蓝色/绿色/橙色/深红色 | Thermo Fisher Scientific | T7279 | 荧光微球 |
| 谷氨酰胺 | Biochrom | #0951C | |
| HeLa 细胞 | DSMZ | ACC-57 | 来自患者 Henrietta Lacks 的宫颈癌细胞 |
| Hela 细胞 CI::paGFP，稳定株 | Muster 等，PLOS One 2010 | ||
| Hela 细胞 CV g::Halo7-Tag，稳定株 | Appelhans 等，NanoLett 2012 | ||
| Hela 细胞 Tom20::Halo7-Tag，稳定株 | Appelhans 等，NanoLett 2012 | ||
| 图像分光器 | Photometrics | Dual-View QV2 | 图像分光发射 |
| 图像处理软件 | ImageJ2 / Fiji | 免费软件 | |
| 浸油 - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45) | Carl Zeiss Jena GmbH | 444960-0000-000 | |
| 倒置落射荧光显微镜 | Olympus IX-71/73/83 | ||
| 561 nm 激光器，200 mW | CrystaLaser | CL-561-200 | 561 nm 发射 |
| 642 nm 激光器，140 mW | Omicron | Luxx-642-140 | 642 nm 发射 |
| MATLAB | MathWorks | 版本 R2013a | |
| 含 Earle's 平衡盐溶液的 MEM，2.2 g/L NaHCO3，稳定谷氨酰胺，不含酚红 | Biochrom | FG-0385 | |
| 含 Earle's 平衡盐溶液的 MEM，含 2.2 g/L NaHCO3，稳定谷氨酰胺，含酚红 | Biochrom | FG-0325 | |
| MitoTracker® Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | 染料 |
| MitoTracker® Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | 染料 |
| 多模-光学保偏单模光纤 | Pointsource/Qioptiq | KineFLEX | |
| NHS-PEG-MAL，Rapp Polymer | Rapp Polymere GmbH Tübingen | 盖玻片涂层 | |
| 非必需氨基酸 (NEAA) | Biochrom | #0802E | |
| PEG 800 (聚乙二醇) 10% | Carl Roth GmbH | 货号 Art No. 0263.1 | 盖玻片涂层 |
| 青霉素/链霉素 | Biochrom | #0122E | |
| PINK1-Halo7-Tag 表达质粒 | Beinlich 等，ACS Chemical Biology 2015 | ||
| 聚-L-赖氨酸 (1.2 mg/ml) | Sigma-Aldrich & Co. | 目录号 Cat. No.P9155 | 盖玻片涂层 |
| RGD 肽 (Ac-CGRGDS-COOH) | Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim | 盖玻片涂层 / 整合素受体基序 | |
| 与 HaloTag®-配体连接的硅基罗丹明 (SiRHTL) | 由 Kai Johnson 个人赠送 | 染料 | |
| 软件分析插件 | 自编 C. P. Richter，Osnabrück 生物物理学 | SLIMFAST 16g | |
| 四甲基罗丹明 / SNAP-Cell® TMR-Star 与 SNAP-配体连接 (TMRstar) | New England Biolab® | S9105S | 染料 |
| 与 HaloTag®-配体连接的四甲基罗丹明 (TMRHTL) | Promega | G8251 | 染料 |
| TIRF 聚光镜 | Olympus | Cell^TIRF MITICO 系统 | TIRF 聚光镜 |
| TIRF 显微镜控制软件 | Olympus cellSens 1.12 | ||
| TIRF 物镜 | Olympus | 150x 油镜 (数值孔径 N.A. 1.45；Olympus UAPO) | |
| 胰蛋白酶/EDTA 10x | Biochrom | #0266 | |
| 水 H2O 99.5% Rotipuran® 低有机物 | Carl Roth GmbH | 货号 Art. No. HN57.1 |
参考文献
- Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy. Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).
- Appelhans, T., Busch, K. Single Molecule Tracking and Localization of Mitochondrial Protein Complexes in Live Cells. Methods Mol Biol. 1567, 273-291 (2017).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy. Nat Protoc. 4 (3), 291-308 (2009).
- Pennacchietti, F., Gould, T. J., Hess, S. T. The Role of Probe Photophysics in Localization-Based Superresolution Microscopy. Biophys J. 113 (9), 2037-2054 (2017).
- Wegel, E., Göhler, A., Lagerholm, B. C., Wainman, A. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific reports. , Available from: https://www.nature.com/articles/srep27290?WT.feed_name=subjects_physical-sciences (2016).
- Pellett, P., et al. Two-color STED microscopy in living cells. Biomedical Optics Express. 2 (8), (2011).
- Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79(2016).
- Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740(2015).
- Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat Methods. 5 (8), (2008).
- Appelhans, T., Busch, K. B. Dynamic imaging of mitochondrial membrane proteins in specific sub-organelle membrane locations. Biophysical reviews. 9 (4), 345-352 (2017).
- Wilmes, S., et al. Triple-color super-resolution imaging of live cells: resolving submicroscopic receptor organization in the plasma membrane. Angewandte Chemie. 51 (20), 4868-4871 (2012).
- Niewidok, B., et al. Single-molecule imaging reveals dynamic biphasic partition of RNA-binding proteins in stress granules. J Cell Biol. , (2018).
- Wurm, C. A., Jakobs, S. Differential protein distributions define two sub-compartments of the mitochondrial inner membrane in yeast. FEBS Lett. 580 (24), 5628-5634 (2006).
- Schmidt, R., Wurm, C. A., Punge, A., Egner, A., Jakobs, S., Hell, S. W. Mitochondrial cristae revealed with focused light. Nano Lett. 9 (6), 2508-2510 (2009).
- Kukat, C., Wurm, C. A., Spahr, H., Falkenberg, M., Larsson, N. G., Jakobs, S. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
- Beinlich, F., Drees, C., Piehler, J., Busch, K. Shuttling of PINK1 between Mitochondrial Microcompartments Resolved by Triple-Color Superresolution Microscopy. ACS chemical biology. 10 (9), 1970-1976 (2015).
- Shim, S., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Sbalzarini, I., Mezzacasa, A., Helenius, A., Koumoutsakos, P. Effects of Organelle Shape on Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biophysical Journal. 89 (3), 1482-1492 (2005).
- Reits, E., Neefjes, J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), E145-E147 (2001).
- Goehring, N., Chowdhury, D., Hyman, A., Grill, S. FRAP Analysis of Membrane-Associated Proteins: Lateral Diffusion and Membrane-Cytoplasmic Exchange. Biophysical Journal. 99 (8), 2443-2452 (2010).
- Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harbor protocols. 2014 (7), 709-725 (2014).
- Sukhorukov, V., Dikov, D., Busch, K., Strecker, V., Wittig, I., Bereiter-Hahn, J. Determination of protein mobility in mitochondrial membranes of living cells. Biochimica et biophysica acta. 1798 (11), 2022-2032 (2010).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Graham, F. L., van der Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52 (2), 456-467 (1973).
- Wedeking, T., et al. Spatiotemporally Controlled Reorganization of Signaling Complexes in the Plasma Membrane of Living Cells. Small. 11 (44), 5912-5918 (2015).
- Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. [Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release. J Biol Chem. 280 (1), 715-721 (2005).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J Histochem Cytochem. 44 (12), 1363-1372 (1996).
- Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells (vol 5, pg 159). Nature Methods. 5 (5), 455(2008).
- Elmokadem, A., Yu, J. Optimal Drift Correction for Superresolution Localization Microscopy with Bayesian Inference. Biophys J. 109 (9), 1772-1780 (2015).
- Barlag, B., et al. Single molecule super-resolution imaging of proteins in living Salmonella enterica using self-labelling enzymes. Sci Rep. 6, 31601(2016).
- Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
- Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
- Jin, S., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-Mediated Mitophagy at a Glance. Journal of Cell Science. 125, 795-799 (2013).
- Yamano, K., Youle, R. J. PINK1 is degraded through the N-end rule pathway. Autophagy. 9 (11), 1758-1758 (2013).
- Wiedemann, N., et al. Machinery for protein sorting and assembly in the mitochondrial outer membrane. Nature. 424 (6948), 565-571 (2003).
- Thompson, R., Larson, D., Webb, W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
