本文介绍了一种在活细胞细胞器中对单个膜蛋白进行多色定位的实验方案。通过使用自标记蛋白来连接荧光染料，可对同一细胞器不同膜区室中分布的蛋白质实现约18 nm精度的定位。
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本文内容
摘要
摘要
了解蛋白质在细胞亚区室中的定位对于阐明其特定功能至关重要。本文介绍一种超分辨率技术，该技术通过生成蛋白质的定位图和追踪图，确定蛋白质可进入的微区室。此外，利用多色定位显微镜，可同时获得不同亚区室中蛋白质的定位与追踪特征。该技术专用于活细胞，基于对单个可移动膜蛋白的重复成像。目标蛋白通过基因工程与特定的自标记标签融合表达。这些标签是能够以共价方式与底物发生反应的酶，底物上连接有荧光染料。酶标记蛋白与荧光标记底物反应后，即可实现蛋白标记。本文中使用的荧光染料为四甲基罗丹明（Tetramethylrhodamine, TMR）和硅基罗丹明（Silicon Rhodamine, SiR），它们分别连接在相应酶的底物上。通过使用皮摩尔（pM）至纳摩尔（nM）浓度范围的底物，可实现亚化学计量比标记，从而获得清晰可分辨的信号。这些信号的定位精度约为 15–27 nm。该技术支持单分子多色成像，颜色数量受限于可用的膜通透性荧光染料以及自标记酶的种类。我们通过检测质量控制酶——PTEN诱导的激酶1（PINK1）在不同线粒体区室中的定位及其在加工过程中与其他膜蛋白的关系，验证了该技术的可行性。然而，由于标记效率较低，同时标记两个相邻蛋白的概率较小，因此该方法在利用单分子FRET或共追踪来验证不同标记单个蛋白之间真实物理相互作用方面存在局限性。尽管该技术在膜区室蛋白成像方面具有优势，但在大多数情况下并不适用于高移动性可溶性蛋白的定位研究。
引言
本实验方案的目的是提供一种成像方法，用于在活细胞内对单个膜蛋白进行定位和追踪。我们将该方法称为追踪与定位显微镜技术（Tracking and Localization Microscopy, TALM）1,2。与随机光学重建显微镜技术（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM）3 和荧光激活定位显微镜技术（(F)PALM）4,5 类似，TALM 是一种基于单分子的荧光定位技术。然而，该方法的独特之处在于，通过结合膜蛋白的运动性以及对同一标记分子在不同位置的重复成像，能够揭示出可移动蛋白所能到达的微区室。换句话说，蛋白可能的定位范围由细胞器的结构以及蛋白自身的运动性共同决定1。该方法与其他多种超分辨率成像技术具有互补性6,7,8，因为它通过成像可移动蛋白来生成定位图和轨迹图。标记方法基于使用基因工程构建的融合蛋白，这些融合蛋白本身不具荧光。这些融合蛋白是可自标记....
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方案
以下方案遵循当地机构研究伦理委员会的指导方针。
1. 方法
- 细胞培养
- 在含有5 mL培养基的T25细胞培养瓶中，于37 °C和5% CO2条件下培养细胞，例如HeLa细胞（人宫颈癌细胞）。
注意：用于成像时，将细胞传代至预先准备好的盖玻片上（见步骤1.3和1.4），并置于成像培养基中继续培养。
- 在含有5 mL培养基的T25细胞培养瓶中，于37 °C和5% CO2条件下培养细胞，例如HeLa细胞（人宫颈癌细胞）。
- 细胞转染
注意：尽可能使用稳定表达标签蛋白的细胞系，以避免强烈过表达24。对于瞬时转染，需调整转染所用质粒DNA的用量。例如，采用Ca2+磷酸盐转染法25时，在3.5 cm细胞培养皿中对汇合度为80–90%的细胞使用2.5–5 µg质粒DNA进行转染。进行双质粒共转染时，每种质粒各使用2.5 µg。- 对于双色实验，可使用一种稳定表达一种自标记蛋白的细胞系，并瞬时转染编码另一种自标记蛋白的质粒17。
注意：本实验中，双色实验采用的HeLa细胞系稳定表达自标记蛋白PINK1-Halo-Tag和Tom20-fSNAP-Tag。
- 对于双色实验，可使用一种稳定表达一种自标记蛋白的细胞系，并瞬时转染编码另一种自标记蛋白的质粒17。
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结果
多色成像与共定位分析有助于确定蛋白质的亚细胞器定位。我们此前已通过细胞质磷酸酶和张力蛋白同源物 PINK1 证实了这一点，该蛋白由于线粒体蛋白酶的加工而在不同线粒体亚区域中具有不同的定位17PINK1 是维持线粒体功能的重要因子34,35以确定PINK1在不同线粒体区室中随着其加工过程的定位情况（图 4A)，在活细胞中进行了多色超分辨率显微成像。因此，将PINK1与一种自标记标签（HaloTag）进行基因融合。为确定其在功能正常与功能障碍线粒体中相对于其他蛋白的定位，选用作为线粒体外膜转位酶复合物（TOM）组分的Tom2036，用另一种自标记标签（SNAP-tag）进行标记。记录了至少1,000帧（每秒96帧）的时间序列图像。一个通道中所有信号随时间累积的图像显示，PINK1定位于细胞质和线粒体中（
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讨论
本文介绍了一种用于移动膜蛋白双色单分子定位的技术。按照本方案，膜蛋白与自标记蛋白融合，后者可与分别偶联至其对应底物的罗丹明染料TMR和SiR发生反应。罗丹明染料具有高亮度和良好的光稳定性，因此能够实现重复成像1。为确保实验成功，需注意若干条件和关键要点。
首先，选择合适的滤光片和分光器以清晰分离TMR和SiR的信号非常重要。为了减少细胞外背景信号，使用PLL-PEG-RGD对盖玻片进行预清洁和包被是有效的。染料-底物的最终浓度必须根据自标记酶对其底物的亲和力以及酶在细胞内的可及性进行测试。对于线粒体蛋白17 和应激颗粒13，纳摩尔至皮摩尔浓度已足够。对于其他细胞器，所需浓度需另行测试。如果在记录开始时染色过强，无法分辨单个分子，则最好等待荧光染料发生漂白，使其数量减少至可分辨单个粒子（SP）的水平。我们发现，在染色过程中，BG-底物浓度高于30 nM、HTL-底物浓度高于1 nM，或延长染色时间以增加标记分子数量的做法均不可行。每.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢奥斯纳布吕克大学的生物物理学团队和Jacob Piehler提供的持续支持，感谢Wladislaw Kohl提供的技术支持和材料制备，以及CellNanOs委员会提供显微镜设备使用。本项目由SFB 944资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| (2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基)-乙磺酸，1 M) (HEPES) | Biochrom | #1104E | |
| DC1：二向色分光镜 | Chroma | 640 dcxr | NC506031 |
| DC2：多色镜，分光镜 | Chroma | zt405/488/561/640rpc | 已停产 |
| Dulbecco´s 磷酸盐缓冲液 (PBS) 1x (不含 Ca & Mg) | Sigma-Aldrich & Co. | #RNBF8311 | |
| Earle´s MEM，不含酚红、不含 L-谷氨酰胺且不含 NaHCO3，含 1% FBS、0.1% HEPES、0.1% NEAA、0.1% 丙氨酰-L-谷氨酰胺和 34.78% 碳酸氢钠 (NaHCO3 0.75g/l) | 成像培养基 | ||
| Earle´s 最低必需培养基 (MEM)，含酚红，含 1% 优质胎牛血清 (FBS)、0.1% HEPES (2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基)-乙磺酸，1 M) 和 0.1% 非必需氨基酸 (NEAA) | 生长培养基 | ||
| EF：四通道发射滤光片 | AHF analysentechnik | F72-866 | Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm |
| EMCCD 相机 | Andor | Andor iXON 897 | EMCCD 相机 |
| QuadView 滤光立方体发射滤光片，橙色 | AHF analysentechnik | F39-637 | 带通 582 - 619 nm |
| QuadView 滤光立方体发射滤光片，红色 | Chroma | 带通 655 - 725 nm (HQ 690/70) | |
| FBS（胎牛血清）优质 | Biochrom | S0615 | |
| 荧光微球：TetraSpeck™ 微球，0.1 µm，荧光蓝色/绿色/橙色/深红色 | Thermo Fisher Scientific | T7279 | 荧光微球 |
| 谷氨酰胺 | Biochrom | #0951C | |
| HeLa 细胞 | DSMZ | ACC-57 | 来自患者 Henrietta Lacks 的宫颈癌细胞 |
| Hela 细胞 CI::paGFP，稳定株 | Muster 等，PLOS One 2010 | ||
| Hela 细胞 CV g::Halo7-Tag，稳定株 | Appelhans 等，NanoLett 2012 | ||
| Hela 细胞 Tom20::Halo7-Tag，稳定株 | Appelhans 等，NanoLett 2012 | ||
| 图像分光器 | Photometrics | Dual-View QV2 | 图像分光发射 |
| 图像处理软件 | ImageJ2 / Fiji | 免费软件 | |
| 浸油 - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45) | Carl Zeiss Jena GmbH | 444960-0000-000 | |
| 倒置落射荧光显微镜 | Olympus IX-71/73/83 | ||
| 561 nm 激光器，200 mW | CrystaLaser | CL-561-200 | 561 nm 发射 |
| 642 nm 激光器，140 mW | Omicron | Luxx-642-140 | 642 nm 发射 |
| MATLAB | MathWorks | 版本 R2013a | |
| 含 Earle's 平衡盐溶液的 MEM，2.2 g/L NaHCO3，稳定谷氨酰胺，不含酚红 | Biochrom | FG-0385 | |
| 含 Earle's 平衡盐溶液的 MEM，含 2.2 g/L NaHCO3，稳定谷氨酰胺，含酚红 | Biochrom | FG-0325 | |
| MitoTracker® Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | 染料 |
| MitoTracker® Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | 染料 |
| 多模-光学保偏单模光纤 | Pointsource/Qioptiq | KineFLEX | |
| NHS-PEG-MAL，Rapp Polymer | Rapp Polymere GmbH Tübingen | 盖玻片涂层 | |
| 非必需氨基酸 (NEAA) | Biochrom | #0802E | |
| PEG 800 (聚乙二醇) 10% | Carl Roth GmbH | 货号 Art No. 0263.1 | 盖玻片涂层 |
| 青霉素/链霉素 | Biochrom | #0122E | |
| PINK1-Halo7-Tag 表达质粒 | Beinlich 等，ACS Chemical Biology 2015 | ||
| 聚-L-赖氨酸 (1.2 mg/ml) | Sigma-Aldrich & Co. | 目录号 Cat. No.P9155 | 盖玻片涂层 |
| RGD 肽 (Ac-CGRGDS-COOH) | Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim | 盖玻片涂层 / 整合素受体基序 | |
| 与 HaloTag®-配体连接的硅基罗丹明 (SiRHTL) | 由 Kai Johnson 个人赠送 | 染料 | |
| 软件分析插件 | 自编 C. P. Richter，Osnabrück 生物物理学 | SLIMFAST 16g | |
| 四甲基罗丹明 / SNAP-Cell® TMR-Star 与 SNAP-配体连接 (TMRstar) | New England Biolab® | S9105S | 染料 |
| 与 HaloTag®-配体连接的四甲基罗丹明 (TMRHTL) | Promega | G8251 | 染料 |
| TIRF 聚光镜 | Olympus | Cell^TIRF MITICO 系统 | TIRF 聚光镜 |
| TIRF 显微镜控制软件 | Olympus cellSens 1.12 | ||
| TIRF 物镜 | Olympus | 150x 油镜 (数值孔径 N.A. 1.45；Olympus UAPO) | |
| 胰蛋白酶/EDTA 10x | Biochrom | #0266 | |
| 水 H2O 99.5% Rotipuran® 低有机物 | Carl Roth GmbH | 货号 Art. No. HN57.1 |
参考文献
- Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy. Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).
- Appelhans, T., Busch, K.
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