优化的划痕实验方法 体外 使用自动化光学相机检测细胞迁移

摘要

在此，我们描述了一种检测细胞迁移的方法 体外 使用自动光学显微相机进行观察。划痕实验已被广泛应用于监测划痕闭合情况，通常在设定的时间段内进行跟踪。光学显微镜可实现对细胞迁移的可靠且低成本的检测。

摘要

细胞迁移是一个重要的过程，影响着伤口愈合和癌症等多种健康相关方面，因此开发研究细胞迁移的方法至关重要。划痕实验长期以来是最常用的方法 体外 一种用于检测具有抗迁移和促迁移特性的化合物的方法，因其成本低廉且操作简便而被广泛应用。然而，该实验常出现的问题是细胞在划痕边缘堆积。此外，为了获取实验数据，需要在一段时间内对同一位置进行多次成像，以比较细胞迁移的动态变化。尽管可使用不同的分析软件来描述划痕闭合情况，但这些方法耗时耗力、准确性较差，并会因反复操作导致温度变化循环。在本研究中，我们展示了一种优化的检测细胞迁移效应的方法， 例如 使用天然存在的蛋白质人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白及其N端肽乳铁素，作用于HaCaT表皮细胞系。关键的优化步骤是在PBS中进行洗涤和划痕处理，以消除上述细胞在边缘的积聚现象。这可能归因于阳离子的去除，已有研究显示阳离子会影响角质形成细胞的细胞间连接。为确保真实迁移的检测，本方案中加入了丝裂霉素C预处理步骤，该物质为DNA合成抑制剂。最后，我们展示了自动光学成像系统的应用，该系统可避免频繁的温度循环，减少人工操作在划痕闭合分析中的参与，同时提高实验重复性，并确保在不同时间点对划痕区域的相同部位进行持续分析。

引言

迁移是一个影响多种生理过程的重要现象。在伤口愈合过程中，细胞迁移有助于皮肤的再上皮化。而在难以愈合的伤口（如慢性伤口）中，机会性细菌会导致伤口感染，开放性伤口为细菌生长和生物膜的形成提供了理想环境^1,2。生物膜是耐药菌产生的重要原因之一，而耐药菌已成为现代社会面临的最大威胁之一³。在伤口愈合过程中，免疫细胞无法穿透生物膜。在癌症中，癌细胞的迁移是转移的关键步骤，而转移是实体瘤患者死亡的主要原因^4,5。因此，能够研究细胞迁移过程至关重要。

划痕实验常用于检测细胞迁移，因其成本低廉且易于在贴壁细胞系（如成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞系）上进行。^6,7如今，已有多种方法可用于进行划痕实验⁸，据报道已使用不同的材料，包括牙签⁹，细胞刮刀¹⁰，激光器¹¹和电流¹²所有方法均有各自的优缺点，应根据细胞类型、预算和分析工具来选择合适的方法。例如，如果所用的细胞类型需要包被或手动去除压力， 例如 使用牙签或移液器吸头会对该区域内的细胞迁移产生影响，因此应采用其他方法。本研究将重点介绍手动刮划法。

手动划痕法的一个缺点是划痕的大小和形状存在变异，且细胞容易在划痕边缘堆积。目前已有多种实验方案，其中一篇被广泛引用的文献建议在划痕后提高操作速度和/或进行充分洗涤¹³。此外，由于细胞增殖无法与迁移相区分，可能导致迁移结果出现假阳性，因此已采用多种方法来最小化细胞增殖的影响。已有报道的方法包括在划痕前进行血清饥饿¹⁴以及减少培养基中的血清含量¹⁵。然而，这些方法均无法完全确保无细胞增殖。因此，我们采用丝裂霉素C对细胞进行预处理，以确保所观察到的结果真实反映细胞迁移。丝裂霉素C是一种抗生素，可通过与DNA形成共价键抑制DNA合成，从而阻止DNA解链¹⁶。通过在划痕前用丝裂霉素C预处理细胞，并在划痕前用PBS洗涤，所观察到的划痕区域闭合即可真实反映细胞的迁移能力（图1）。

所有这些方法的一个共同特点是需要一个系统来分析迁移过程¹⁷。一种常见且经济的方法是使用明场显微镜在预设的时间点拍摄划痕区域的图像，然后通过图像软件分析划痕间隙的闭合情况，以此评估迁移进程^18,19。该方法耗时较长，且在重复拍摄同一位置和焦距时可靠性较差；此外，将细胞从培养箱转移至显微镜进行成像会导致温度反复变化。另一种已开发的方法是通过检测电流变化来监测细胞迁移：随着细胞在培养板上覆盖的面积增加，阻抗随之升高²⁰。通过测量阻抗，可避免对细胞环境造成干扰，因此该方法被认为是非侵入性的。该技术依赖于带有金电极的专用培养板，虽然成本较高，但能够同时检测多种细胞行为，如细胞贴附、增殖、迁移和细胞死亡。然而，该方法的一大缺点在于阻抗变化并不直接反映迁移情况，因为温度等因素对阻抗具有显著影响。阻抗的变化可能由多种未被软件识别的因素引起，从而增加了数据分析的难度。因此，由于缺乏直观的可视化信息，仍需借助传统的光学显微镜来验证细胞迁移。

为了克服现有技术的诸多缺点，我们采用了一种实时自动化的光学相机。该光学相机是一种检测系统，其在一个小型平台上集成了高通量显微镜、镜头、照明单元和数字相机。该系统配备内置软件，可用于检测细胞迁移、增殖等多种功能。为了检测迁移，使用了两种算法来分析细胞的生长和迁移动力学，分别称为增殖分析和伤口愈合分析。增殖分析基于一种两步图像分割算法，通过高级直方图分析结合纹理分析，识别被细胞覆盖的区域（以黄色显示）与空白背景区域之间的差异。伤口愈合分析则基于一种三步算法，用于识别细胞单层、定位伤口间隙，并测定间隙宽度。这些步骤在用户设定的时间点进行，数据以覆盖面积、间隙宽度和间隙面积的形式呈现。该设备的一大优势在于，由于相机的角度设计，可在液体环境中对贴壁细胞进行成像²¹。相机镜头以倾斜角度拍摄图像，并将其投影至单个z平面生成的z层叠图像中，以确保图像聚焦（图2）。z层叠图像通过整合一系列垂直于伤口边缘并覆盖整个伤口的图像（例如 40张）生成，从而能够捕捉细胞层的深度信息以及跨越伤口的清晰焦平面。此外，只需点击按钮，即可将这一系列图像合成为视频集合。

我们展示了一种优化的方案，用于检测角质形成细胞系HaCaT的迁移能力。我们测试了人和牛的乳铁蛋白及其N端肽段乳铁肽，以分析它们对细胞迁移的影响，因为这些分子已被证明具有多种抗菌和免疫调节作用^22,23。将这四种化合物与未处理的HaCaT细胞进行比较，同时使用表皮生长因子（EGF）作为阳性对照。

方案

该实验设计不存在伦理和法律限制，并已获得罗斯基勒大学的批准。实验装置的概览见图1，光学相机的工作机制见图2。

1. 准备

1. 所有操作均须在无菌超净工作台内进行，实验开始前使用70%乙醇清洁工作台面及所有设备。
2. 将光学相机置于37 °C、含5% CO₂的常规培养箱中，以确保细胞处于最佳培养条件。
3. 在T75培养瓶中，使用含10%胎牛血清（FBS）和1×抗生素（青霉素和链霉素）的DMEM培养基培养HaCaT细胞。
4. 每次传代时，使用1 mL 1×胰蛋白酶覆盖细胞层以消化脱离细胞，每3–4天传代一次。使用前需预先加热至室温。

2. 在48孔微孔板中生成HaCaT细胞单层

1. 用巴斯德吸管从T75培养瓶中移除培养基。
2. 向T75培养瓶中加入5 mL 1×无菌PBS，洗涤贴壁细胞。
   注意：确保PBS中不含钙和镁。
3. 轻轻晃动培养瓶使PBS充分接触细胞，然后用巴斯德吸管吸除PBS。
4. 重复步骤2.2–2.3。
5. 向培养瓶中加入1 mL 1×胰蛋白酶，并均匀覆盖细胞层。
6. 将培养瓶置于37 °C常规培养箱中孵育，直至细胞脱落（大多数细胞系需5–8分钟即可）。
7. 在显微镜下观察细胞是否已脱落。一旦细胞脱落，立即加入9 mL含10%胎牛血清（FBS）的常规培养基以中和1×胰蛋白酶。
8. 使用血细胞计数板、库尔特计数器或类似设备进行细胞计数。
   注意：可使用台盼蓝染色观察死细胞。然而，在1×胰蛋白酶处理下，活的HaCaT细胞呈完美圆形。
9. 将7.5 × 10⁴个细胞/孔接种于250 µL含10% FBS的培养基中，加入圆底48孔组织培养板（标准板）。
   注意：也可使用6、12、24或96孔板进行该实验，这些板均可用于光学显微镜观察。
10. 轻轻左右晃动培养板，确保细胞在孔内均匀分布，否则细胞会聚集于孔中央。在光学显微镜下检查，确认细胞在培养基中均匀分散。
11. 将培养板置于37 °C常规CO₂培养箱中过夜，或孵育至细胞完全贴附于孔底。

3. 添加刺激物以产生迁移效应

1. 在光学显微镜下检查孔内细胞是否达到90-95%的融合度。
2. 用适量培养基配制10 µg/mL的丝裂霉素C。
   注意：本研究中，丝裂霉素C以1 mg/mL的储存液形式保存于4 °C。溶液中的丝裂霉素C可在2-8 °C避光条件下保存最多一周。
3. 用巴斯德吸管从每孔中移除用过的培养基。
4. 向每孔中加入250 µL浓度为5 µg/mL的丝裂霉素C。
5. 将培养板在37 °C、5% CO₂条件下孵育2小时。
6. 通过将肽类刺激物用适量培养基稀释来配制刺激溶液。
   注意：本研究中，人源和牛源乳铁蛋白及乳铁素肽均以25 µg/mL的浓度、250 µL的体积进行测试。
7. 用巴斯德吸管移除含丝裂霉素C的培养基。
8. 用250 µL 1x PBS（室温）洗涤每孔一次，并用巴斯德吸管移除洗涤液。
9. 加入250 µL 1x PBS，然后用200 µL移液枪头在孔内垂直划痕。每个孔使用新的枪头。
10. 移除PBS，并加入250 µL肽类刺激物。
11. 通过调节培养板两侧的螺丝，将培养板安装至光学摄像系统中。保留微孔板的盖子。
    注意：如有需要，摄像系统可在打开盖子的情况下运行。

4. 在计算机上设置光学相机的程序

1. 单击左侧任务栏中的采集。
2. 在左侧任务栏中选择伤口愈合功能。
3. 通过单击板示意图下方来选择板类型。
4. 通过选中未使用的孔并单击屏幕左上方的启用来取消选择这些孔。
   注意：默认情况下所有孔均被选中。
5. 通过右键单击其中一个孔，调整镜头对焦位置以适应细胞位置。
   注意：也可通过移动板示意图右侧的滑块手动调节自动对焦。
6. 在图像间隔下设置图像拍摄的时间间隔（例如 (00:30:00)）。
7. 设置重复次数以匹配所需的时间段（例如 97 次重复）。
8. 单击右下角的开始按钮启动运行。

结果

HaCaT 是一种角质形成细胞系，是皮肤中最丰富的细胞类型之一。当皮肤发生伤口时，皮肤细胞开始增殖并迁移至伤口床，以闭合伤口（图3）。因此，这两个过程对于正常的伤口愈合至关重要。

光学相机可实时追踪这两个过程。对于细胞迁移，系统提供三组数据：细胞覆盖面积、间隙宽度和间隙面积。在监测经乳铁蛋白、乳铁素肽或表皮生长因子（EGF）处理的划痕时，光学显微镜使我们能够随时间追踪这三个参数。经过48小时孵育后，我们观察到EGF处理组伤口闭合率达到95%，而未处理对照组仅为38%（图3A）。不同形式的乳铁蛋白和乳铁素肽的伤口闭合率介于33%至62%之间，其中肽段的效果强于其母体蛋白。根据初始划痕后间隙宽度的变化所计算出的伤口闭合百分比也可绘制成图（图3B）。

讨论

迁移在发育、伤口愈合、免疫学和癌症研究中的重要性促使人们发展出多种研究迁移的方法。迁移可以表现为细胞扩展或闭合间隙的行为。通常检测划痕闭合，因为与以特定形态培养细胞相比，先以单层培养细胞再制造划痕更为简便⁸。本研究展示了一种优化的手动划痕方法，该技术易于掌握且成本低廉。我们引入了DNA合成抑制剂丝裂霉素C，增加了一次洗涤步骤以优化划痕效果，相较于已发表的方法有所改进¹⁸，并采用了光学相机以实现高通量研究。

的 体外 划痕实验需要使用能够良好贴壁并附着于孔板底部的贴壁细胞系，同时需抑制细胞增殖以检测细胞在划痕区域的迁移能力。这两个特征对实验至关重要。为准确检测细胞迁移，已有多种方法被报道，包括降低血清浓度或在划痕前对细胞进行饥饿处理。¹⁴，DMSO，或各种抑制剂 ^13,27通常可以使用无血清培养基，但某些细胞...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
oCelloScope	BioSense Solution ApS		光学相机
UniExplorer 软件	BioSense Solution ApS		(8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT 细胞			由 Bispebjerg 医院捐赠
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	HaCaT 细胞培养基
FBS	Gibco	10270	胎牛血清
PBS	Gibco	D837	不含 Mg+ 和 Ca2+
青霉素-链霉素	Sigma	P0781	抗生素
胰蛋白酶 (10x)	Sigma	T3924
丝裂霉素 C	Tocris	3258	抑制增殖
微量滴定板	Greiner Bio-one	677 180
培养箱	Panasonic		37°C, 5% CO2
血细胞计数板	Assistent		Türk (0.1 mm)
移液器辅助器	Accu-Jet pro