一种简单且可重复的制备新鲜分离大鼠脑微血管膜样本的方法

摘要

本文介绍了一种分离大鼠脑微血管及制备膜样品的方法。该方案具有明显优势，可从单个动物获得蛋白质产量可观且微血管富集度高的样品。所得样品可用于对脑微血管内皮进行可靠的蛋白质分析。

摘要

血脑屏障（BBB）是一种动态的屏障组织，可对多种病理生理和药理刺激产生反应。这些刺激所引起的变化可显著调节药物向脑组织的递送，进而给中枢神经系统（CNS）疾病的治疗带来重大挑战。许多影响药物治疗的血脑屏障变化涉及定位于内皮细胞并在此表达的蛋白质。事实上，关于血脑屏障在健康与疾病状态下生理学的此类知识，已激发了人们对研究这些膜蛋白的浓厚兴趣。从基础科学研究的角度来看，这意味着需要一种简单、可靠且可重复的方法，用于从实验动物脑组织中分离微血管。为了从新分离的微血管制备膜样本，关键在于样本中应富集内皮细胞，同时尽量减少神经血管单元中其他细胞类型（即星形胶质细胞、小胶质细胞、神经元、周细胞）的存在。此外，该方法的优势在于能够从单个动物制备样本，从而真实反映实验群体中蛋白质表达的变异性。本文提供了用于分离大鼠脑微血管及制备膜样本的方法细节。通过在样本缓冲液中添加葡聚糖，并经过四次离心步骤，可实现微血管的富集。该方案易于被其他实验室根据其特定应用进行调整。采用本方案所获得的样本已在蛋白质分析实验中产生可靠的数据，有助于深入理解血脑屏障对生理、病理生理及药理刺激的响应机制。

引言

血脑屏障（BBB）位于中枢神经系统（CNS）与体循环系统之间，对维持脑内环境稳态起着至关重要的作用。具体而言，血脑屏障能够精确调控脑组织细胞外液中的溶质浓度，并高效地向脑组织输送满足中枢神经系统巨大代谢需求所必需的营养物质¹。这些功能意味着，血脑屏障主要在微血管内皮细胞水平发挥作用，必须具备特定的机制，以允许某些物质进入脑实质，同时防止潜在有害的外源性物质在脑内蓄积。事实上，脑微血管内皮细胞无窗孔结构，且胞饮作用有限，从而确保了其不具备非选择性通透性²。此外，脑微血管内皮细胞表达紧密连接和黏附连接蛋白，这些蛋白在相邻内皮细胞之间形成物理性的"密封"，极大地限制了血液来源物质通过细胞旁路途径向脑实质的扩散。实际上，内源性和外源性物质的选择性通透依赖于摄取和外排转运蛋白的功能性表达³。总体而言，紧密连接、黏附连接以及转运蛋白协同作用，共同维持血脑屏障独特的屏障特性。

血脑屏障是一种动态屏障，可对生理、病理生理及药理刺激产生响应。例如，缺氧/复氧应激已被证实可调节关键紧密连接蛋白的表达即， 闭锁蛋白（occludin）、闭锁小带蛋白-1（zonulae occludens-1, ZO-1），其表达变化与血管标志物（如蔗糖）的细胞旁通透性增加相关^4,5,6在创伤性脑损伤情况下，血脑屏障也观察到了类似的改变。⁷ 外周炎症性疼痛^8,9这些相同的疾病也可能调节血脑屏障（BBB）处的转运机制^{10,11,12,13,14}事实上，缺氧/复氧损伤会增强血脑屏障处有机阴离子转运多肽1a4（Oatp1a4）的功能性表达，从而显著增加特定Oatp转运底物（如牛磺胆酸盐和阿托伐他汀）从血液向脑组织的转运。¹³血脑屏障的特性也可能受到药物治疗本身的影响，这种机制可能成为药物在脑内疗效发生显著变化以及药物间相互作用的基础。例如，对乙酰氨基酚可作用于脑微血管内皮细胞中的核受体信号通路，增加关键外排转运蛋白P-糖蛋白（P-gp）的功能性表达，从而改变吗啡（一种阿片类镇痛药，且为已知的P-gp转运底物）所介导的时间依赖性镇痛效应¹⁵深入理解由疾病或药物诱导的血脑屏障（BBB）变化，还需要鉴定和表征调控这些改变的特异性调控机制。事实上，已在脑微血管内皮细胞中鉴定出若干离散的信号通路，这些通路调控紧密连接蛋白的分子表达^16,17 和转运蛋白^15,18,19综上所述，这些观察结果表明，复杂的分子通路参与了血脑屏障紧密连接和转运蛋白在生理和病理状态下的调控。

研究血脑屏障（BBB）面临的一个重要挑战是，必须建立一种简单且高效的方法，用于从实验动物的脑组织中分离微血管，并进一步制备膜样本。这些样本的制备需确保富含脑微血管内皮细胞，同时最大限度减少其他细胞类型的污染。近年来，科学文献中已报道了多种从啮齿类动物脑组织中分离微血管的方法^13,20,21,22。本文介绍了一种简单、稳定且可重复的从大鼠脑组织中分离微血管并制备富含内皮细胞膜样本的方法，可用于蛋白质表达分析。该微血管分离方案的优势在于，能够从单个实验动物获得高质量的样本，并具备足够的蛋白质产量，从而允许评估个体动物间蛋白质表达的差异。这一改进显著提高了血脑屏障研究的可靠性，避免了对血脑屏障处蛋白质变化真实幅度的高估或低估。此外，通过加入多次含葡聚糖的离心步骤，可进一步提高实验样本中微血管的富集度，同时有效去除神经元等非目标细胞成分。

方案

以下所述所有操作程序均已获得机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并符合美国国立卫生研究院（NIH）以及《动物研究：报告》规范 体内 实验（ARRIVE）指南。本方案的流程如图所示。 图1.

1. 实验步骤的准备工作

1. 配制脑微血管缓冲液（BMB）。首先称取54.66 g D-甘露醇、1.90 g EGTA 和 1.46 g 2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇（即 Tris）碱基，放入洁净的烧杯中。加入1.0 L去离子水。使用磁力搅拌器混合BMB缓冲液的各组分。待溶液充分混匀后，用1.0 M HCl调节pH至7.4。
2. 在麻醉动物前，预先配制26%葡聚糖溶液（分子量75,000，w/v）。按照以下步骤配制葡聚糖溶液。
   注：必须提前配制该溶液，因为葡聚糖在水相缓冲液中完全溶解通常需要约1.5–2小时。
   1. 将粉末状葡聚糖（每100 mL缓冲液使用26 g）称量至洁净烧杯中。
   2. 量取所需体积的BMB，并转移至另一个洁净烧杯中。
   3. 将BMB缓慢倒入盛有葡聚糖粉末的烧杯中。在倾倒过程中，使用玻璃搅拌棒手动搅拌粉末，以促进溶解。
   4. 使用1.0 M HCl在使用前立即调节pH至7.4。
      注：通常从12只单独的Sprague-Dawley大鼠（雄性或雌性；3月龄；每只200–250 g）中分离脑微血管需要200 mL葡聚糖溶液（即52 g葡聚糖溶于200 mL BMB中）。

2. 从 Sprague-Dawley 大鼠中提取脑组织

1. 在完成所需的实验处理后，使用氯胺酮（50 mg/kg；2.5 mL/kg，腹腔注射）和赛拉嗪（10 mg/mL；2.5 mL/kg，i.p.）对 Sprague-Dawley 大鼠进行麻醉。将氯胺酮和赛拉嗪用0.9%生理盐水稀释至终浓度分别为20 mg/mL和4.0 mg/mL。根据IACUC指南，使用锋利的断头器通过断头法处死动物。雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠均采用相同的操作程序。
2. 使用手术剪在颅骨表面做一条横向切口，剥离大鼠颅骨上的皮肤。
3. 使用咬骨钳小心去除颅骨骨板，暴露脑组织。
4. 用刮铲取出脑组织，分离大脑，并将分离的脑组织放入含有5 mL BMB的50 mL锥形管中。在使用前立即向每1.0 mL BMB缓冲液中加入1.0 μL蛋白酶抑制剂混合物。

3. 大脑处理

1. 将脑组织从50 mL锥形管转移至洁净的培养皿中。
2. 用镊子将脑组织在直径为12.5 cm的滤纸上轻轻滚动，以去除 loosely 黏附于大脑皮层表面的外层脑膜。轻轻按压脑组织并再次滚动。此步骤中应频繁翻转滤纸。
3. 使用镊子将脉络丛从大脑半球分离。
   注意：脉络丛呈透明膜状结构，位于脑室表面。
4. 用镊子轻轻压平脑组织，并去除残留的脑膜和嗅球。
5. 将大脑皮层组织放入预冷的玻璃研钵中。向研钵中加入5.0 mL含有蛋白酶抑制剂混合物的BMB缓冲液。
6. 使用电动匀浆器，在3,700 rpm条件下，以15次上下匀浆动作进行匀浆。使用10 mL研钵和研杵组织研磨器进行匀浆操作。每次处理不同样品之间，需用70%乙醇清洗研杵。
   注意：匀浆动作的速度和幅度应保持一致。
7. 将匀浆液倒入已标记的离心管中。

4. 离心步骤

1. 向每个含有脑匀浆的已标记离心管中加入 8.0 mL 的 26% 葡聚糖溶液。
2. 将离心管倒置两次，然后充分涡旋震荡样品。对每个样品采用多个角度进行涡旋震荡，以确保脑匀浆溶液与 26% 葡聚糖溶液充分混合。
3. 在 4 °C 条件下，以 5,000 x g 离心 15 分钟。
   注意：对于某些分析，比较脑微血管与脑实质是有用的。如果需要评估脑实质中的蛋白表达，可收集此离心步骤的上清液（即脑实质组分），并储存在 -80 °C 以供后续使用。
4. 使用真空抽吸装置和玻璃巴斯德吸管移除上清液。
   注意：操作时必须小心，避免扰动沉淀。否则，所收集的脑微血管数量将减少，从而显著降低本实验的蛋白得率。
5. 将沉淀重悬于 5.0 mL 含有蛋白酶抑制剂混合物的 BMB 缓冲液中（即每 1.0 mL BMB 缓冲液中加入 1.0 μL 蛋白酶抑制剂混合物）。涡旋震荡沉淀，以确保充分混匀。
6. 向每个离心管中加入 8.0 mL 的 26% 葡聚糖溶液，并按照本实验方案的步骤 4.1–4.2 所述进行涡旋震荡。
7. 在 4 °C 条件下，以 5,000 x g 离心 15 分钟。
8. 使用真空瓶和玻璃吸管抽吸上清液，并确保含有脑微血管的沉淀不被破坏。
   注意：附着在管壁上的多余物质不含微血管，应小心清除并去除。
9. 重复步骤 4.5 至 4.8 两次。
10. 完成四次葡聚糖离心步骤后，向每个沉淀中加入 5.0 mL BMB 缓冲液，并涡旋震荡以重悬样品。
    注意：在完成步骤 4.10 后，可收集完整的微血管用于蛋白定位分析。可通过取 50 μL 重悬的微血管沉淀，涂抹于玻璃显微镜载玻片上实现。随后将微血管在加热块上 95 °C 热固定 10 分钟，再用冰冻乙醇固定 10 分钟。载玻片可在 4 °C 储存，直至进行成像研究时使用。

5. 超速离心法制备全脑微血管膜样品

1. 将样品转移至预冷的玻璃匀浆器中。
2. 使用电动高速匀浆器，在3,000 rpm条件下，上下匀浆脑组织8–10次。匀浆过程使用10 mL研钵和研杵组织研磨器进行。每次单个样品匀浆完成后，用70%乙醇清洗研杵。
3. 将样品转移至洁净的超速离心管中。对每根离心管编号并称重，并在装入超速离心转子前进行配平和配对。
   注意：所有超速离心管的称重和配对操作必须在盖紧管盖的条件下进行，以确保管重测量准确。
4. 在4 °C条件下，以150,000 × g 离心1小时。
5. 使用真空抽滤瓶和玻璃巴斯德吸管，小心吸取上清液，避免扰动毛细血管膜沉淀。
6. 根据沉淀物的大小，加入适量储存缓冲液，该缓冲液由去离子水和BMB按1:1（v/v）比例配制而成。通常，沉淀物重悬于400–500 μL储存缓冲液中。按每1.0 mL储存缓冲液加入1.0 μL的比例，向缓冲液中添加蛋白酶抑制剂混合物。
7. 涡旋振荡样品，使沉淀充分重悬于储存缓冲液中。
8. 使用玻璃巴斯德吸管，将毛细血管膜样品转移至已标记的1.5 mL微量离心管中。
9. 用针头注射器反复推注样品5次，以确保样品充分混匀且无细胞聚集体存在。
10. 将样品储存于-80 °C，直至分析时使用。
    注意：各微血管膜样品的蛋白含量采用Bradford法测定。

结果

分离大鼠脑微血管及制备微血管膜样品的实验流程如图1所示。采用本方案，成功地从大鼠脑组织中分离出完整的微血管（图2A）。这些微血管是在完成葡聚糖离心后、开始超速离心制备膜样品前获得的（即步骤4.10完成后）。在该图像中，微血管使用针对Oatp1a4的抗体进行染色，该转运蛋白已被证实可在脑微血管内皮细胞的质膜上高水平表达^2,11,13,18。通过蛋白质印迹分析（图2B），从雌性Sprague-Dawley大鼠分离的微血管膜制备物中，血小板内皮细胞黏附分子-1（PECAM-1；亦称CD31）含量显著富集，该蛋白是脑微血管的标志蛋白。PECAM-1是...

讨论

本文介绍了一种从大鼠脑组织中 freshly 分离的微血管制备膜蛋白样品的简单且有效的方法。文献中已报道了多种用于分离大鼠脑微血管和/或从分离的微血管制备膜组分的方法^{13,20,21,22,24}。尽管上述微血管分离方案在原理上相似，但本方法已进行了优化，能够从单只实验动物获得蛋白产量优异的膜样品。这一改进消除了以往为获得足够蛋白富集度以用于多种蛋白分析方法而必须合并至少三只 Sprague-Dawley 大鼠微血管的需要。这些蛋白分析方法包括但不限于 Western 印迹分析、点印迹和共免疫沉淀。需要注意的是，将多个实验动物的微血管合并以制备单一样品的做法会显著降低组间变异性。因此，微血管合并可能导致数据离散度降低，从而不能真实反映实验动物群体中蛋白表达的实际变异性。由于现在可从单只实验动物制备样品，因此能够真实捕...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	#P8340	脑微血管缓冲液的组分
D-甘露醇	Sigma-Aldrich	#M4125	脑微血管缓冲液的组分
EGTA	Sigma-Aldrich	#E3889	脑微血管缓冲液的组分
Trizma 碱	Sigma-Aldrich	#T1503	脑微血管缓冲液的组分
葡聚糖（分子量 75,000）	Spectrum Chemical Mftg Corp	#DE125	用于离心步骤中将微血管与脑实质分离的葡聚糖
氯胺酮	MWI Animal Health	#501072	全身麻醉剂
赛拉嗪	Western Medical Supply	#5530	全身麻醉剂
0.9% 生理盐水溶液	Western Medical Supply	N/A	全身麻醉剂稀释液
滤纸（直径 12.5 cm）	VWR	#28320-100	用于去除脑组织中的脑膜
离心管	Sarstedt	#60.540.386	用于葡聚糖离心步骤的一次性离心管
Pierce™ 考马斯亮蓝 Plus（Bradford）检测试剂	ThermoFisher Scientific	#23236	用于测定膜制备物中的蛋白质浓度
Wheaton 电动匀浆器	DWK Life Sciences	#903475	样品匀浆所必需
10.0 ml 玻璃研钵和研杵组织研磨器	DWK Life Sciences	#358039	样品匀浆所必需
盐酸	Sigma-Aldrich	#H1758	缓冲液 pH 调节所必需
牛血清白蛋白	ThermoFisher Scientific	#23210	Bradford 检测的蛋白质标准品
标准镊子	Fine Science Tools	#91100-12	用于脑组织解剖
Friedman-Pearson 咬骨钳	Fine Science Tools	#16020-14	用于打开颅骨以分离脑组织
50 ml 锥形离心管	ThermoFisher Scientific	#352070	用于脑组织分离后的收集
玻璃巴斯德吸管	ThermoFisher Scientific	#13-678-20C	用于葡聚糖离心后吸取细胞碎片
无水乙醇	Sigma-Aldrich	#459836	用于清洁组织研磨器；用蒸馏水稀释至 70%
超速离心管	Beckman-Coulter	#41121703	用于样品的超速离心