采用一种新颖的方法评估肠道宿主-微生物相互作用，该方法结合了合成口腔菌群、体外胃肠道消化以及小肠上皮模型。本文介绍了一种可灵活应用于评估病原体细胞侵袭、多物种生物膜形成，甚至益生菌制剂存活能力的方法。
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本文内容
摘要
摘要
宿主与微生物群之间的相互作用早已被认识并得到广泛描述。口腔与其他胃肠道部位相似，存在常驻微生物群，可防止外源性细菌的定植。事实上，口腔中已发现超过600种细菌，单个个体在任何时间点可能携带约100种不同的细菌。口腔细菌具有附着于口腔生态系统中各种生态位的能力，从而融入常驻微生物群落，并促进其生长与存活。然而，吞咽过程中细菌进入肠道可能扰乱肠道微生物群的平衡。事实上，口服牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）可改变回肠菌群的细菌组成。我们采用合成菌群作为天然口腔生态系统的简化模型，以阐明口腔细菌在模拟胃肠道转运条件下的存活能力与活性。选取14种细菌，经体外（in vitro）唾液、胃液和肠液消化处理后，引入包含Caco-2和HT29-MTX细胞的多室细胞模型，以模拟肠道黏膜上皮。该模型用于揭示被吞咽细菌对参与肠肝循环的细胞的影响。使用合成菌群可实现良好的可控性与可重复性。因此，该方法可适用于评估病原体的存活能力及后续炎症相关变化、益生菌混合物的定植能力，以及最终对肝前循环的潜在细菌影响。
引言
人类与细菌共同生活，细菌数量与人体细胞数量相当1。因此，全面了解人类微生物组至关重要。口腔是一个独特的环境，被划分为多个较小的生态位，因而不同区域含有多种多样的细菌和生物膜。作为一个开放的生态系统，口腔中的某些菌种可能是短暂存在的。然而，某些微生物在出生后不久即定植，并形成有序的生物膜2。这些生物膜存在于龈沟上方的牙面、龈下龈沟、舌面、黏膜表面以及牙科修复体和充填物上3。细菌也可能以絮状物或浮游细胞的形式存在于牙根管腔内，或与坏死的牙髓组织混合，或悬浮于液体环境中。
宿主细胞与定植微生物群之间存在着活跃且持续的相互交流4细菌在种内和种间进行交流，仅有少数天然定植菌能够直接黏附于组织表面，而其他细菌则附着于这些初始定植菌。例如，微生物之间的细胞-细胞结合对于将继发性定植菌整合入口腔生物膜并形成复杂的相互作用微生物网络至关重要。4唾液样本中约70%的细菌聚集体由 卟啉单胞菌属 sp. 链球菌 sp. 普雷沃菌属 sp. 韦荣球菌 sp. 和未鉴定种 拟杆菌门. F. nucleatum 是龈下生物膜中的中间定植菌，可与晚期定植菌发生聚集 ....
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方案
1. 菌株与培养条件
注意：该合成口腔菌群由口腔微生物组中常见的菌株组成3。
- 从美国典型培养物保藏中心（ATCC）获取以下菌株：Aggregatibacter actinomycetemcomitans（ATCC 43718）、Fusobacterium nucleatum（ATCC 10953）、Porphyromonas gingivalis（ATCC 33277）、Prevotella intermedia（ATCC 25611）、Streptococcus mutans（ATCC 25175）、Streptococcus sobrinus（ATCC 33478）、Actinomyces naeslundii（ATCC 51655）、Streptococcus gordonii（ATCC 49818）、Actinomyces viscosus（ATCC 15987）以及Streptococcus mitis（ATCC 49456）。
- 从莱布尼茨微生物与细胞培养物保藏中心（DSMZ）获取Veillonella parvula（DSM 2007），从BCCM/LMG细菌保藏中心获取....
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结果
该方案可建立一种适用于阐明口腔细菌在模拟胃肠道转运条件下存活与存活性的模型。来自各菌株的完整细胞数量约为108 细胞/mL-1 在合成群落建立之前，多物种微宇宙在群落构建过程中含有超过90%的可存活细胞图1A 和 1B）。根据活/死菌定量结果，每次消化步骤后细菌活力均有所下降（图2）。这可能是由于胃部通过期间的酸性pH以及小肠消化液中含有的胆盐所致，这些情况在生理条件下会发生。在通过两者的过程中存活率 体外 和 体内 胃肠道消化可能依赖于环境的差异（例如， 喂养 与 空腹条件），甚至细菌保护过程（孢子形成或肠溶包衣）。
流式细胞术计数必须与适当的对照（如.......
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讨论
口腔微生物组是人体健康的关键因素，这一点已被多位研究人员近期报道20,21。先前的研究结果表明，摄入含有大量细菌的唾液可能影响小肠的微生物生态系统，而小肠是免疫启动的主要部位之一。将静态的上消化道消化模型与代表宿主界面的肠上皮细胞及黏液分泌细胞相结合，有助于揭示微生物组分对宿主的影响。
体外模型是研究的基本工具，可用于开展机制性研究，并获得旨在减少、提高效率以及更精准定位体内研究的基础知识。因此，在构建合成微生物群落之前，确保无杂菌培养物的纯度、活性和最佳生长状态至关重要。我们建议在将细菌群落暴露于细胞培养物之前，评估其活性和组成，以避免分析结果出现偏差。大量受损细菌可能阻碍黏附作用，进而影响细胞模型的完整性。此外，使用可靠的细胞系来源可最大限度地减少细胞系误认、污染和注释错误，从而提高实验的可重复性22。
加入产黏液细胞可模拟.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
作者衷心感谢佛兰德斯研究基金会为 Marta Calatayud Arroyo 提供的资助（FWO 博士后基金-12N2815N）。Emma Hernandez-Sanabria 是由佛兰德斯创新与创业署（Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie，IWT）资助的博士后研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 菌株 | |||
| Aggregatibacter actinomycetemcomitans | 美国典型培养物保藏中心 | ATCC 43718 | |
| Fusobacterium nucleatum | 美国典型培养物保藏中心 | ATCC 10953 | |
| Porphyromonas gingivalis | 美国典型培养物保藏中心 | ATCC 33277 | |
| Prevotella intermedia | 美国典型培养物保藏中心 | ATCC 25611 | |
| Streptococcus mutans | 美国典型培养物保藏中心 | ATCC 25175 | |
| Streptococcus sobrinus | 美国典型培养物保藏中心 | ATCC 33478 | |
| Actinomyces viscosus | 美国典型培养物保藏中心 | ATCC 15987 | |
| Streptococcus salivarius TOVE-R | |||
| Streptococcus mitis | 美国典型培养物保藏中心 | ATCC 49456 | |
| Streptococcus sanguinis | BCCM/LMG 细菌保藏中心 | LMG 14657 | |
| Veillonella parvula | 莱布尼茨微生物与细胞培养物保藏中心（DSMZ） | DSM 2007 | |
| Streptococcus gordonii | 美国典型培养物保藏中心 | ATCC 49818 | |
| 细胞系 | |||
| Caco-2 细胞 | 欧洲认证细胞培养物保藏中心 | 86010202 | |
| HT29-MTX 细胞 | 欧洲认证细胞培养物保藏中心 | 12040401 | |
| 试剂与耗材 | |||
| 脑心浸液（BHI）肉汤 | Oxoid | CM1135 | |
| 血琼脂 2 | Oxoid | CM0055 | 血琼脂培养基 |
| 甲萘醌 | Sigma | M9429 | |
| 血红素 | Sigma | H9039 | |
| 5% 无菌脱纤维马血 | E&O Laboratories Ltd, | P030 | |
| InnuPREP PCRpure 试剂盒 | Analytik Jena | 845-KS-5010250 | PCR 纯化试剂盒 |
| Big Dye | Applied Biosystems | 4337454 | 测序染料 |
| ABI Prism BigDye Terminator v3.1 循环测序试剂盒 | Applied Biosystems | 4337456 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| 碘化丙啶 | Invitrogen | P1304MP | |
| 未包被、细胞培养处理、带通气盖、无菌的 T25 培养瓶 | VWR | 734-2311 | |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| 台盼蓝溶液 0.4%，液体，无菌过滤 | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| 含 GlutaMAX 和丙酮酸钠的 DMEM 细胞培养基 | Life technologies | 31966-047 | |
| Corning Transwell 聚酯膜细胞培养小室 | Sigma-Aldrich | CLS3450-24EA | |
| 猪胃黏蛋白 II 型 | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| 灭活胎牛血清 | Greiner Bio One | 758093 | |
| 抗生素-抗真菌剂（100X） | Gibco | 15240062 | |
| 分子生物学用 Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| 不含钙、镁的 DPBS | Gibco | 14190-250 | |
| Pierce LDH 细胞毒性检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| Corning HTS Transwell-24 孔，孔径 0.4 µm | Corning Costar Corp | 3450 | |
| 无核酸酶水 | Serva Electrophoresis | 28539010 | |
| 设备 | |||
| 改进型 Neubauer 计数板 | Carl Roth | T729.1 | |
| BD Accuri C6 流式细胞仪 | BD Biosciences | 653118 | |
| PowerLyzer 24 匀浆器 | MoBio | 13155 | |
| T100 梯度 PCR 仪 | BioRad | 186-1096 | |
| 冲洗系统 | 定制 | - | |
| InnOva 4080 恒温摇床 | New Brunswick Scientific | 8261-30-1007 | 用于 2.10 的摇床 |
| Memmert CO2 培养箱 | Memmert GmbH & Co. | ICO150med | |
| Millicell ERS（电阻力系统） | EMD Millipore, Merck KGaA | MERS00002 | |
| Millipore Milli-Q academic 超纯水系统 | Millipore, Merck KGaA | - | |
| 摇床（ROCKER 3D basic） | IKA | 4000000 | 用于 6.10 的摇床 |
参考文献
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biology. 14, e1002533(2016).
- Kelly, D., King, T., Aminov, R. Importance of microbial ....
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