基于液滴的微流控方法与微球PCR扩增用于单链DNA扩增子

摘要

本研究提供了一种用于制备基于液滴的微流控平台的方法，并应用聚丙烯酰胺微球进行微球-PCR扩增。微球-PCR方法能够在无需分离双链DNA的情况下获得单链DNA扩增产物。

摘要

基于液滴的微流控技术能够在微流控通道中可靠地生成均一的微球，从而精确控制所获得微球的尺寸和形貌。已成功制备出与丙烯酰基-DNA探针共聚的微球。合成单链DNA（ssDNA）的方法包括不对称PCR、外切酶消化以及链霉亲和素包被的磁珠分离等。然而，这些方法无法高效地利用大量高纯度的ssDNA。本文介绍了一种微球-PCR方案，详细说明了如何通过简单地从PCR反应管中移液，即可高效扩增ssDNA并将其与双链DNA（dsDNA）分离。该ssDNA的扩增产物可作为DNA微阵列和DNA-SELEX（指数富集配体系统进化）过程中的潜在试剂。

引言

由于单链DNA（ssDNA）具有进行DNA-DNA杂交的内在特性，它已被广泛视为一种分子识别元件（MRE）^1,2。ssDNA合成系统的发展可推动多种生物应用，例如基于互补相互作用的DNA微阵列³、寡核苷酸治疗、诊断技术以及集成化分子传感系统^4,5。

迄今为止，已利用微流控装置成功制备出微米级聚合物颗粒。多种微流控技术已被证实可在微通道环境中连续流动条件下高效地生成高度均一的微球^6,7。

在Lee et al.⁸的研究中，报道了一种基于液滴的微流控平台，用于共聚可交联寡聚微球的微流控合成及单链DNA扩增。该微流控平台由两层PDMS（聚二甲基硅氧烷）构成：上层为具有微流控通道网络的结构，用于生成微球；下层为平坦基底。该系统包含三种类型的PDMS流体通道：1）用于生成液滴的流动聚焦通道，2）用于混合两种溶液的蛇形通道，以及3）用于顺序聚合反应以实现微球固化的通道。当两....

方案

1. PDMS 微流控平台的制备

1. 通过按10:1的体积比混合基础聚合物和催化剂，制备20 mL液态PDMS预聚物。将10 mL液态PDMS浇注到硅片上预先制备的SU-8模具上，用于微流控网络的上部结构；对于底部平坦部分，则将相同体积的液态PDMS浇注到无模具结构的硅片上。
   注意：微流控网络在CAD程序中设计，随后转换为光掩模，以通过典型的光刻工艺制备母模（参见补充图）。该母模由硅片上的负性光刻胶SU-8模具构成¹¹。
2. 将涂有液态PDMS预聚物的两片硅片置于加热板上，在75 °C下固化30分钟。
   1. 手动从SU-8模具上剥离固化的PDMS层。将直径为1.5 mm的圆形打孔工具对准复制出的微流控网络上的油口，以连接微尺度流道与宏观流体样品。手动打出通孔。
   2. 重复此打孔操作三次，用于形成两个溶液入口及出口端口。
3. 使用手持式电晕处理仪对上层和底层PDMS层进行亲水表面处理，每个样品处理数秒¹²。
   1. 将两层经等离子体处理的PDMS堆叠后，使用加热板在90 °C下加热30分钟，完成PDMS与PDMS之间的键合。通过注射泵向三个入口端口通入加压水，以实现结构键合并测试所制备器件的泄漏情况。

结果

所制备的基于聚合物液滴的微流控平台由两层PDMS组成（图1a）。生成微球时使用了三种类型的微流控通道网络：1）如图1b所示的流动聚焦结构；2）用于混合溶液I和溶液II的蛇形通道；3）用于微球固化的聚合通道。所有通道的高度均为60 μm。混合通道和聚合通道的长度分别为74.35 mm和94.45 mm。用于两种不混溶流体流动的微通道宽度为100 μm，矿物油流动通道的宽度为200 μm。用于微球形成的孔口结构长度为50 μm，宽度为25 μm。扩散器结构的角度为37°。采用实验室自制的气动控制系统以实现矿物油的连续流动，并结合两台注射泵控制溶液流动（图1c），在微流控平台中生成微球（图1d）。当溶液流速和施加压力分别为0.6 mL/h和108 kPa时，微球的生成速度约为每秒30个（表2）。微球在微通道中.......

讨论

双链DNA（dsDNA）的污染是单链DNA（ssDNA）扩增中的主要问题。在传统的不对称PCR扩增中，仍难以有效抑制双链DNA的扩增¹⁵。此外，尽管生成单链DNA的技术已有改进，使样本通量效率得以提高，但由于成本高昂且纯化得率不完全，单链DNA的分离纯化仍然存在困难。

不对称PCR是在处理单链DNA（ssDNA）时最具挑战性的方法之一。该方法使用不等量的引物（例如，20:1的比例），以大量生成ssDNA。然而，要优化每个扩增反应以获得ssDNA非常困难。因此，必须从产物中去除副产物（双链DNA，dsDNA）⁴。

为了在无需额外分离步骤的情况下生成单链DNA（ssDNA），我们采用丙烯酰化共聚方法制备了聚丙烯酰胺微球，以暴露DNA探针。我们的DNA固定方法可轻松适配基于液滴的微流控平台。成功制备出具有微米级直径的共聚寡微球。随后，通过微球-PCR在单管反应中扩增了ssDNA。当然，若将该方法应用于其他PCR实验，则需.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
液态聚二甲基硅氧烷，PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	芯片组分
40% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液（19:1）	Bio-rad	1610140	可共聚寡聚微球的组分
过硫酸铵，APS	Sigma Aldrich	A3678	丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液的固化剂
N,N,N′,N′-四甲基乙二胺，TEMED	Sigma Aldrich	T9281	过硫酸铵的催化剂
矿物油	Sigma Aldrich	M5904	表1. 溶液III. 微球试剂组分
Cy3标记的互补寡核苷酸探针	Bioneer	合成	表3. 序列信息
丙烯酰胺修饰的单链DNA探针	Bioneer	合成	表1. 溶液I. 微球试剂组分
Tris	Biosesang	T1016	TE缓冲液组分，pH缓冲溶液
EDTA	Sigma Aldrich	EDS	TE缓冲液组分，去除离子（Ca2+）
Ex taq	Takara	RR001A	单链DNA扩增
共聚焦显微镜	Carl Zeiss	LSM 510	识别微球表面暴露的寡核苷酸
光学显微镜	Nikon Instruments Inc.	eclipse 80i	计算微球数量
T100热循环仪	Bio-rad	1861096	单链DNA扩增
手持式电晕处理仪	Electro-Technic	BD-20AC Laboratory Corona Treater	亲水性表面处理
加热板	As one	HI-1000	用于液态PDMS固化的加热平台
注射泵	kd Scientific	78-1100	溶液I和溶液II的均匀流动
空气压缩机	Kohands	KC-250A	溶液III的流体控制
亮线血细胞计数板	Sigma Aldrich	Z359629	计算微球数量