基于液滴的微流控方法与微球PCR扩增用于单链DNA扩增子

摘要

本研究提供了一种基于液滴的微流控平台的制备方法，并介绍了聚丙烯酰胺微球在微球-PCR扩增中的应用。微球-PCR方法能够在无需分离双链DNA的情况下获得单链DNA扩增产物。

摘要

基于液滴的微流控技术能够在微流控通道中可靠地生成均一的微球，从而精确控制所得微球的尺寸和形貌。已成功制备出与丙烯酰化-DNA探针共聚的微球。合成单链DNA（ssDNA）的方法包括不对称PCR、外切酶消化以及链霉亲和素包被的磁珠分离等。然而，这些方法无法高效地利用大量高纯度的ssDNA。本文介绍了一种微球-PCR方案，详细说明了如何通过直接从PCR反应管中移液，高效扩增ssDNA并将其与双链DNA（dsDNA）分离。该ssDNA扩增技术可作为DNA微阵列和DNA-SELEX（指数富集配体系统进化）过程中的潜在试剂加以应用。

引言

由于单链DNA（ssDNA）具有DNA-DNA杂交的内在特性，它被广泛视为一种分子识别元件（MRE）^1,2。ssDNA合成系统的发展可推动多种生物应用，例如基于互补相互作用的DNA微阵列³、寡核苷酸治疗、诊断技术以及集成化分子传感^4,5。

迄今为止，已利用微流控装置成功制备出微米级聚合物颗粒。多种微流控技术已被证实可在微通道环境中连续流动条件下高效地生成高度均一的微球^6,7。

在Lee 等⁸的研究中，报道了一种基于液滴的微流控平台，用于共聚可聚合寡聚微球的微流控合成及单链DNA（ssDNA）扩增。该微流控平台由两层PDMS（聚二甲基硅氧烷）构成：上层为具有微流控通道网络的部分，用于生成微球；下层为平坦基底。该结构包含三种类型的PDMS流体通道：1）用于生成液滴的流动聚焦通道，2）用于混合两种溶液的蛇形通道，以及3）用于顺序聚合反应以实现微球固化的通道。当两种互不相溶的流体被引入同一PDMS流体通道时，流体被迫通过狭窄的孔口结构。通道几何形状、流速和黏度等流动行为会影响微球的尺寸和形貌。因此，主液流可被分割为微米尺度的单分散微球^9,10。

本文提供了一种用于扩增单链DNA（ssDNA）的微球-PCR详细实验方案。首先，介绍了基于液滴的微流控装置的设计过程；随后，阐述了如何以互补方式将随机DNA模板功能化至聚丙烯酰胺微球表面；最后，展示了用于扩增单链DNA的微球-PCR操作步骤。

方案

1. PDMS 微流控平台的制备

1. 通过将基础聚合物与催化剂按10:1的体积比混合，制备20 mL液态PDMS预聚物。将10 mL液态PDMS倒入硅晶圆上已制备好的SU-8模具中，用于微流控网络的上部结构；对于底部平坦部分，将相同体积的液态PDMS直接倒在无模具结构的硅晶圆上。
   注意：微流控网络在CAD软件中设计，随后转换为光掩模，以通过典型的光刻工艺制备母模（参见补充图）。该母模由硅晶圆上的负性光刻胶SU-8模具构成¹¹。
2. 将涂有液态PDMS预聚物的两片硅晶圆置于加热板上，在75 °C下固化30分钟。
   1. 手动将固化的PDMS层从SU-8模具上剥离。将直径为1.5 mm的圆形打孔工具对准复制出的微流控网络上的油口，以连接微尺度流道与宏观流体样品，手动打出通孔。
   2. 重复此打孔操作三次，用于形成两个进样口和一个出样口。
3. 使用手持式电晕处理仪对上层和底层PDMS层进行亲水表面处理，每个样品处理数秒钟¹²。
   1. 将两层经等离子处理的PDMS叠合，置于加热板上于90 °C加热30分钟，完成PDMS与PDMS之间的键合。通过注射泵向三个进样口通入加压水，以实现结构键合并检测所制器件是否存在泄漏。

2. 聚丙烯酰胺寡微球的制备

1. 按照 表1 中详细说明的配比准备珠子混合物。
2. 涡旋并短暂离心标准单链DNA丙烯酰胺标记探针（Ap，100 μM）以及丙烯酰胺:双丙烯酰胺（19:1）储备液。
3. 通过混合以下成分制备溶液I：25 μL 40%丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液、10 μL 单链DNA（丙烯酰胺探针）、10 μL 5×TBE缓冲液（1.1 M Tris；900 mM 硼酸；25 mM EDTA）和5 μL 水。用50 μL 20%过硫酸铵制备溶液II。
4. 准备两个注射器，分别装入溶液I和溶液II，并将其安装在泵上，以将溶液引入微流控平台。准备含有0.4% TEMED的矿物油，用于微球表面的固化。
   注意：TEMED是一种已知的自由基稳定剂。自由基可加速过硫酸铵（APS）引发的聚合反应速率，从而催化丙烯酰胺的聚合。
5. 在玻璃瓶中加入4 mL矿物油，以产生连续流动。
6. 在玻璃瓶盖上插入两根管子作为微流控储液池：气动端口用于将空气压缩机产生的压缩空气导入玻璃瓶，流体端口用于将加压的油从玻璃瓶输送至微通道网络。将玻璃瓶与微流控装置的油入口之间用管路连接。
   1. 将管路连接至微流控装置的两个溶液入口，以便从注射泵输送两种溶液。将管路插入出口端口，以将生成的微球转移至烧杯中。
7. 将注射泵的流速设置为0.4–0.7 mL/h。使用调压阀调节空气压缩机的压缩空气压力（82–116 kPa）。将置于加热板上的玻璃烧杯内的磁力搅拌子转速设为500 rpm。启动注射泵，并通过电磁阀的开关控制，将外部压缩机产生的压缩空气通入玻璃瓶¹³。
8. 使用数字显微镜观察流动聚焦结构中微球的形成过程，以及在玻璃烧杯中生成微球的固化情况。
   注意：微球的尺寸和生成速度取决于溶液的流速以及施加于矿物油流动的压力 （表2）。

3. 进行聚丙烯酰胺寡核苷酸微球计数

1. 进行血细胞计数板定量时，取少量聚丙烯酰胺寡聚微球水溶液（约 100 μL），滴加至血细胞计数板的玻璃表面，并轻轻将微球悬液充满计数室的加样孔。
   注意：更多细节请参见 http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer。
2. 使用显微镜和手动计数器，对一组 16 个方格内的微球进行计数。随后移动血细胞计数板至计数室的下一组区域，继续计数，直至完成全部四组 16 个角格的计数。
3. 计算微球的平均数量，并推算原始微球悬液中的微球总数。
4. 将 100 μL 微球转移至 1.5 mL 微离心管中。通过轻柔离心（400 × g）并用移液器吸除上清液。

4. 在聚丙烯酰胺寡微球表面进行DNA杂交

注意：将一种相同的DNA探针（其5’端为-NH₂基团而非5’-丙烯酰基修饰）加入溶液I中，并平行检测含Ap的微球。DNA杂交结果见图2。Cy3标记的互补寡核苷酸探针（cAp）溶液应置于避光环境中。

1. 使用 100 μL 的 1×TE 缓冲液（TE 缓冲液：10 mM Tris 和 1 μM EDTA，pH 8.0）重悬 Cy3-cAp，以获得 100 μM 的终浓度。例如，将 1 pmol 的 cAp 溶于 100 mL TE 缓冲液中，并转移至包裹铝箔的微量离心管中。
   注意：链序列见表 3。
2. 向含有 Ap-共聚微球的无菌 1.5 mL 微量离心管中加入 100 μM 的 Cy3-cAp。
3. 轻轻敲击管壁数次以混匀，并在避光条件下室温孵育 1 小时。
4. 弃去上清液，并通过移液去除残留缓冲液。
5. 用 500 μL TE 缓冲液洗涤三次。
6. 轻轻敲击微量离心管以重悬微球，然后重复步骤 4.4。
7. 将微球置于载玻片（75 mm × 50 mm）上，并在成像前用铝箔覆盖。

5. 用于扩增单链DNA的不对称PCR

1. 准备用于扩增待分析单链DNA（ssDNA）的不对称PCR试剂混合物。将表4中的试剂在冰上解冻。Taq DNA聚合酶（50 U/µL）不得长时间置于冰上，应保存在-20 °C，待使用时再取出。
2. 轻轻涡旋混匀所有试剂，然后在10,000 × g下短暂离心10秒。
3. 按照表4所述比例混合所有试剂。
4. 将样品放入热循环仪中，并按以下条件启动不对称PCR程序：25个循环（95 °C变性30秒，52 °C退火30秒，72 °C延伸30秒），85 °C延伸5分钟，最后在4 °C保存。

6. 用于扩增单链DNA的微球PCR

注意：本节描述了在PCR反应管中扩增单链DNA（ssDNA）的实验方案。微球-PCR反应的总体积为50 μL。用于扩增单链DNA的具体序列列于表5中。在此过程中，微球表面的Ap可与随机DNA模板以互补方式退火。这一步骤对于生成互补DNA链（反义DNA链，图3）至关重要。延伸所得的DNA将作为微球-PCR扩增的模板。

1. 配制微球-PCR试剂混合液。将表6中的试剂在冰上解冻；但Taq DNA聚合酶无需置于冰上，应保存在-20 °C直至使用。
2. 轻轻涡旋混匀所有试剂，然后在10,000 × g离心10秒。
3. 通过显微镜计数获取约~25个微球。
   注意：每根反应管中微球的数量使用40倍光学显微镜进行计算。微球-PCR扩增约使用~25个微球。更详细信息见步骤3。
4. 按照表6中所述组合所有试剂。
5. 将样品放入热循环仪中，并按以下条件启动不对称PCR：25个循环（95 °C 30秒，52 °C 30秒，72 °C 30秒），85 °C 5分钟，4 °C保存。
6. 扩增完成后，向每个样品中加入8 μL 6×上样缓冲液，取15 μL样品加入2%琼脂糖凝胶中。随后在1× TAE（Tris-乙酸-EDTA，40 mM Tris乙酸，1 mM EDTA，pH 8.2）缓冲液中以100 V电泳35分钟。

7. 共聚焦显微镜图像采集

注意：微球-DNA探针杂交结果在共聚焦显微镜下成像，图像分析使用ImageJ进行。

1. 将杂交后的微球固定在显微镜载物台的支架上。
2. 在激光控制中选择激光器（氦氖激光器，543 nm谱线）并启动。
3. 在显微镜控制中选择物镜。
4. 在配置控制中为Cy3选择所需的滤光片和通道。
5. 开始实验并观察样品。共聚焦显微镜的设置参数总结于表7中。

结果

所制备的基于聚合物液滴的微流控平台由两层PDMS组成（图1a）。生成微球使用了三种类型的微流控通道网络：1）如图1b所示的流动聚焦结构；2）用于混合溶液I和溶液II的蛇形通道；3）用于微球固化的聚合通道。所有通道的高度均为60 μm。混合通道和聚合通道的长度分别为74.35 mm和94.45 mm。用于两种不混溶流体流动的微通道宽度为100 μm，矿物油流动通道的宽度为200 μm。用于微球形成的孔口结构长度为50 μm，宽度为25 μm。扩散器结构的角度为37°。采用实验室气动控制系统驱动矿物油连续流动，并使用两台注射泵控制溶液流动（图1c），以在微流控平台中生成微球（图1d）。当溶液流速和施加压力分别为0.6 mL/h和108 kPa时，微球的生成速度约为每秒30个（表2）。微球在微通道中的直径为7...

讨论

双链DNA（dsDNA）的污染是单链DNA（ssDNA）扩增中的主要问题。在传统的不对称PCR扩增中，仍难以有效抑制双链DNA的扩增¹⁵。此外，尽管生成单链DNA的技术已有改进，使样本通量效率得以提高，但由于成本高昂且纯化得率不完全，单链DNA的分离纯化仍然存在困难。

不对称PCR是在处理单链DNA（ssDNA）时最具挑战性的方法之一。该方法使用不等量的引物（例如，20:1的比例），以大量生成ssDNA。然而，要优化每个扩增反应以获得ssDNA非常困难。因此，必须从产物中去除副产物（双链DNA，dsDNA）⁴。

为了在无需额外分离步骤的情况下生成单链DNA（ssDNA），我们采用基于丙烯酰基共聚法的聚丙烯酰胺微球来暴露DNA探针。我们的DNA固定方法通过使用基于液滴的微流控平台得以简便实现。成功制备了具有微米级直径的共聚寡聚微球。随后，采用微球-PCR在单管反应中扩增ssDNA。当然，若将该方法应用于其他PCR实验...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
液态聚二甲基硅氧烷，PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	芯片组分
40% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液（19:1）	Bio-rad	1610140	共聚可交联寡聚微球的组分
过硫酸铵，APS	Sigma Aldrich	A3678	丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液的固化剂
N,N,N′,N′-四甲基乙二胺，TEMED	Sigma Aldrich	T9281	过硫酸铵的催化剂
矿物油	Sigma Aldrich	M5904	表1. 溶液III. 微球试剂组分
Cy3标记的互补寡核苷酸探针	Bioneer	合成	表3. 序列信息
丙烯酰胺修饰的单链DNA探针	Bioneer	合成	表1. 溶液I. 微球试剂组分
Tris	Biosesang	T1016	TE缓冲液组分，pH缓冲溶液
EDTA	Sigma Aldrich	EDS	TE缓冲液组分，去除离子（Ca2+）
Ex taq	Takara	RR001A	单链DNA扩增
共聚焦显微镜	Carl Zeiss	LSM 510	识别微球表面暴露的寡核苷酸
光学显微镜	Nikon Instruments Inc.	eclipse 80i	计算微球数量
T100热循环仪	Bio-rad	1861096	单链DNA扩增
手持式电晕处理仪	Electro-Technic	BD-20AC Laboratory Corona Treater	亲水性表面处理
加热板	As one	HI-1000	用于液态PDMS固化的加热平台
注射泵	kd Scientific	78-1100	溶液I和溶液II的均匀流动
压缩机	Kohands	KC-250A	溶液III的流体控制
亮线血细胞计数板	Sigma Aldrich	Z359629	计算微球数量