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一步亲和纯化并行分析蛋白质-蛋白质与蛋白质-代谢物复合物的2合1方法

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DOI：

10.3791/57720

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2018年8月6日

 ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质-代谢物相互作用对所有细胞功能至关重要。本文介绍了一种可对目标蛋白质的这些相互作用进行并行分析的实验方案。该方案针对植物细胞培养体系进行了优化，结合了亲和纯化与基于质谱的蛋白质及代谢物检测技术。

摘要

细胞过程由蛋白质、代谢物和核酸等生物分子之间的相互作用进行调控。尽管蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的研究已非新颖，但旨在表征内源性蛋白质-代谢物相互作用（PMI）的实验方法则是近年来才发展起来的。本文中，我们介绍一种可同时表征目标蛋白（称为“诱饵蛋白”）的PPI与PMI的实验方案。该方案针对拟南芥细胞培养体系优化，结合了亲和纯化（AP）与基于质谱（MS）的蛋白质和代谢物检测技术。简言之，首先裂解表达带有亲和标签融合诱饵蛋白的转基因拟南芥细胞系，以获得天然细胞提取物；利用抗标签抗体下拉与诱饵蛋白相互作用的蛋白质及代谢物伙伴；随后采用一步甲醇提取法对亲和纯化所得复合物进行提取 叔丁基叔丁基醚（MTBE）/甲醇/水法。代谢物分别进入极性相或疏水相，而蛋白质则存在于沉淀中。随后，采用超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS 或 UPLC-MS/MS）对代谢物和蛋白质进行分析。实验中使用空载体（EV）对照组以排除假阳性结果。本方案的主要优势在于可在接近生理条件（细胞裂解液）下，平行鉴定目标蛋白的蛋白质和代谢物互作伙伴。该方法操作简便、快速，且可轻松适用于植物细胞培养以外的其他生物体系。

引言

本文所述方法旨在近似生理条件下鉴定目标蛋白的代谢物和蛋白质相互作用伙伴。体内 细胞裂解液条件。据推测，除目前已鉴定的代谢物外，还有更多代谢物具有重要的调控功能1代谢物可作为生物开关，改变其受体蛋白的活性、功能和/或定位2,3,4在过去的十年中，出现了几种突破性方法，能够确定死亡时间（PMI） 体内 或在近-体内 条件，已得到开发5现有方法可分为两类。第一类方法采用已知代谢物作为诱饵，以捕获新的蛋白质互作伙伴。相关技术包括亲和层析6药物亲和力响应靶标稳定性测定7，化学蛋白质组学8，以及热蛋白质组分析9第二组包含一种单一的方法，该方法从一个已知的蛋白质出发，以鉴定小分子配体10,11.

采用亲和纯化联合基于质谱的脂质组学方法分析了Saccharomyces cerevisiae12 中的蛋白质-脂质复合物。作为研究起点，作者使用了表达21种参与麦角固醇生物合成的酶以及103种激酶的酵母菌株，这些蛋白均与串联亲和纯化（TAP）标签融合。研究发现，70%的酶和20%的激酶能够结合不同的疏水性配体，揭示了复杂的蛋白质-脂质相互作用网络。

此前，我们已证明，与脂质类似，极性和中等极性化合物也仍结合在从细胞裂解液中分离出的蛋白质复合物上13根据这些研究结果，我们决定优化先前发表的AP方法10,11 用于植物细胞和亲水性化合物14为此，我们使用了Van Leene等人描述的TAP载体 等 2010年，成功应用于植物蛋白质相互作用研究15为了缩短获得转基因品系所需的时间，我们选择了拟南芥细胞培养体系。我们采用了一步法甲基化 叔（tert-）叔丁基醚（MTBE）/甲醇/水提取法，可用于表征蛋白质（沉淀）、脂质（有机相）和亲水性代谢物（水相）16 在一次亲和纯化实验中。引入了EV对照组以排除假阳性结果， 例如 仅与标签结合的蛋白质。作为概念验证，我们对拟南芥基因组中存在的五种核苷二磷酸激酶中的三种（NDPK1-NDPK3）进行了标记。除其他发现外，我们能够证明NDPK1与谷胱甘肽相互作用 S转移酶和谷胱甘肽。因此，我们能够证实NDPK1会发生谷胱甘肽化修饰14.

总之，本方案是表征蛋白质-蛋白质及蛋白质-小分子相互作用网络的重要工具，相较于现有方法具有显著进步。

方案

转基因拟南芥细胞培养系的制备，包括克隆、转化、筛选及培养条件，详见于17请注意，建议使用EV对照组以校正假阳性结果。实验前，需通过蛋白质印迹分析确认诱饵蛋白的过表达。 例如 使用针对串联亲和标签中G蛋白部分的IgG抗体。必须将培养基与植物细胞培养物分离开来。

1. 实验前植物细胞材料的准备

  1. 培养过表达目标蛋白的PSB-L A. thaliana 细胞系18。
    1. 配制MSMO培养基，其中包含4.43 g/L MSMO与30 g/L蔗糖混合。用1 M KOH将缓冲液pH值调节至5.7，并对溶液进行高压灭菌。实验前，在培养基中添加0.5 mg/L α-萘乙酸、0.05 mg/L激动素和50 μg/mL卡那霉素。
    2. 将转化后的植物细胞培养物置于100 mL三角瓶中的50 mL MSMO培养基内，在摇床（转速130 rpm）上轻柔振荡培养。在培养室中于20 °C、光照强度为80 μmol m-2 s-1的条件下培养细胞。
    3. 每隔7天将细胞转接到新鲜培养基中，按1:10比例稀释。
  2. 使用玻璃漏斗配合真空泵，以尼龙滤网作为过滤装置，收集处于对数生长期的细胞。将滤过的细胞用铝箔包裹，并在液氮中速冻。
    注意：液氮温度极低，操作不当可能导致冻伤。请佩戴适当的个人防护装备，包括隔热手套、护目镜和实验服。

2. TAP 实验方案

注意：以下步骤改编自 Maeda et al. 201411 和 Van Leene et al. 201117。

  1. 使用混合球磨机（20 Hz下研磨2分钟）或研钵和研杵将收获并冷冻的植物细胞培养材料均质化，得到细粉。每份样品取约3 g研磨后的材料（相当于约90 mg总蛋白）。此步骤中使用液氮预冷的设备，避免样品解冻。
    注意：将研磨后的植物材料分装至50 mL离心管中，于–80 °C保存，直至开始进行亲和纯化（AP）实验。
  2. 在经液氮预冷的研钵中，加入3 mL冰浴预冷的裂解缓冲液（0.025 M Tris–HCl pH 7.5；0.5 M NaCl；1.5 mM MgCl2；0.5 mM DTT；1 mM NaF；1 mM Na3VO4；100倍稀释的商品化蛋白酶抑制剂混合液；1 mM PMSF），将样品反复研磨直至材料解冻。一旦样品解冻，立即进入下一步。
    注意：裂解缓冲液需新鲜配制。此步骤中可引入空白样品。不建议使用去垢剂，因其可能在质谱（MS）检测中引起问题。
  3. 为去除细胞碎片，将样品分装至2 mL微量离心管中，在4 °C下以20,817 × g离心10分钟。收集3 mL澄清裂解液至15 mL锥形离心管中。
  4. 在离心过程中，对IgG-Sepharose微珠进行平衡。每份样品取100 µL微珠，用1 mL裂解缓冲液洗涤。涡旋重悬微珠后瞬时离心。弃去裂解缓冲液，重复洗涤两次。最后将微珠重悬于400 µL裂解缓冲液中。
  5. 将微珠加入收集的植物裂解液中，在4 °C下于旋转摇床上孵育1 小时。
  6. 将混合物转移至通过鲁尔锁接头与滤孔大小为35 µm的离心柱连接的注射器中。施加压力使裂解液通过滤膜。结合有复合物的微珠将滞留在滤膜上，而裂解液则通过滤膜。
    注意：可选使用真空抽滤装置。务必施加轻柔压力，以免损伤微珠。
  7. 先用10 mL洗涤缓冲液（0.025 M Tris–HCl pH 7.5；0.5 M NaCl）洗涤微珠，再用1 mL洗脱缓冲液（10 mM Tris–HCl pH 7.5；150 mM NaCl；0.5 mM EDTA；1000倍稀释的E64和1 mM PMSF）洗涤。可使用连接在柱子上的注射器或真空抽滤装置进行洗涤。
    注意：若使用真空抽滤装置，务必施加轻柔压力，以免损伤微珠。
  8. 在400 µL含有50 U改良型烟草蚀刻病毒蛋白酶（AcTEV）的洗脱缓冲液中与微珠孵育。在16 °C下以1,000 rpm在摇床上孵育30分钟。
    注意：加入洗脱缓冲液时，务必使用堵头封闭柱子底部。
  9. 向柱中再加入一份额外的酶（50 U），在上述相同条件下继续孵育30分钟。
  10. 通过离心（1分钟，20,817 × g）或真空抽滤装置收集洗脱液至2 mL微量离心管中。为去除残留的复合物，可使用200 µL洗脱缓冲液进行额外一次洗脱。
    注意：样品可于–20 °C或–80 °C保存，或立即进行蛋白质和代谢物提取步骤。冷冻样品应在冰上解冻。

3. 蛋白质印迹分析

  1. 为确认收集的洗脱液中存在诱饵蛋白，取含蛋白质-代谢物的洗脱液10 µL进行SDS-PAGE及Western印迹分析。为鉴定目标蛋白，使用小鼠抗链霉亲和素结合蛋白一抗（1:200），该蛋白为TEV蛋白酶切割后TAP标签的残留部分，具体方法见Van Leene et al. 201117。随后，使用HRP标记的山羊抗小鼠二抗。

4. 代谢物和蛋白质提取

注意：本方案改编自 Giavalisco 等 201116。

注意：从这一步开始使用超高效液相色谱-质谱级溶液。

  1. 加入1 mL甲基 tert将收集的洗脱液与甲基叔丁基醚（MTBE）/甲醇/水溶剂（3:1:1）混合，并通过倒置混匀样品。确保溶剂在提取步骤前冷却至 –20 °C。
    警告：甲基叔丁基醚（MTBE）和甲醇为有害物质。提取步骤应在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。 例如， 手套
  2. 向每个样品中加入0.4 mL甲醇:水1:3溶液，通过倒置混匀样品内容物。
    注意：向混合物中添加甲醇：水溶液会导致相分离。上相含有脂质，下相含有极性和中等极性代谢物，而蛋白质则存在于沉淀中。
  3. 为分离相层，在室温下以20,817 × g离心2分钟，然后使用容量为1 mL的手动移液器收集上层相，用于脂质测定（本方案中未进行此步骤）。
  4. 加入0.2 mL甲醇，倒置混匀。
  5. 在室温下以20,817 × g离心2分钟，然后收集极性相用于代谢物测定（极性和中等极性化合物）。为避免扰动蛋白沉淀，请在离心管底部保留约50 µL液体相。
  6. 在离心蒸发仪中将收集的样品干燥过夜以用于代谢物测定。为避免蛋白沉淀过度干燥，在蒸发30–60分钟后及时取出样品。
    注意：将样品储存于 –20 °C 或 –80 °C，或立即进行蛋白质制备以用于 LC–MS/MS 分析。

5. 蛋白质组学分析样品的制备

注意：此步骤改编自 Olsen et al. 200419 以及胰蛋白酶/Lys-C 混合物的技术手册（见材料表）。

  1. 进行样品的酶解消化。
    注意：酶解消化和样品脱盐过程中使用的溶剂具有危害性。请在通风橱中操作，并穿戴适当的个人防护装备，例如手套。
    1. 将蛋白质沉淀溶解于30 µL新配制的变性缓冲液中（含2 M硫脲/6 M尿素的40 mM碳酸氢铵，pH 8）。为提高蛋白质溶解度，进行15分钟的超声处理。重复该步骤直至沉淀完全溶解。
    2. 在4 °C条件下以20,817 × g离心10分钟，然后将上清液转移至新的微量离心管中。
    3. 使用Bradford蛋白测定法测定蛋白质浓度。
    4. 为进行后续分析，取相当于100 µg蛋白质的体积，并用变性缓冲液补足至46 µL。
    5. 向样品中加入2 µL新配制的还原缓冲液（50 mM DTT溶于H2O中），在室温下孵育30分钟。
    6. 用2 µL新配制的烷基化缓冲液（150 mM碘乙酰胺溶于40 mM碳酸氢铵缓冲液中）处理样品，并在室温下避光孵育20分钟。
    7. 用30 µL的40 mM碳酸氢铵缓冲液稀释样品，然后加入20 µL的LysC/胰蛋白酶混合液。
    8. 在37 °C孵育4小时后，用300 µL的40 mM碳酸氢铵缓冲液稀释样品。
    9. 继续在37 °C过夜孵育。
    10. 用约20 µL的10%三氟乙酸（TFA）酸化样品，使pH < 2。使用pH试纸检测样品pH。
      注意：将样品储存于–20 °C，或直接进行下一步操作。
  2. 对消化后的蛋白质进行脱盐。
    注意：建议使用真空抽滤装置。避免柱子过度干燥。
    1. 用1 mL的100%甲醇冲洗C18固相萃取柱（见材料表），然后用1 mL含0.1% TFA的80%乙腈（ACN）水溶液冲洗。在此步骤及后续所有蛋白质脱盐步骤中，使用真空抽滤装置以加快流程。避免柱子过度干燥。
    2. 用1 mL含0.1% TFA的水溶液洗涤柱子两次，以平衡柱子。
    3. 将样品加载到柱子上。用额外的200 µL含0.1% TFA的水溶液冲洗离心管，并将洗液转移至柱子上。使溶液流经柱子。
    4. 用1 mL含0.1% TFA的水溶液洗涤柱子两次。
  3. 用800 µL含0.1% TFA的60%乙腈（ACN）溶液从柱子上洗脱脱盐后的肽段。在离心浓缩仪中干燥收集的组分，避免蛋白质组分过度干燥；在30–60分钟后将样品从浓缩仪中取出。
    注意：将样品储存于–20 °C或–80 °C，或立即进行下一步操作。在后续步骤中，将样品置于冰上。 

6. 使用超高效液相色谱-串联质谱法测定制备的蛋白质样品。

注意：在进行蛋白质组学和代谢组学检测之前，使用真空泵对所有缓冲液抽滤（0.2 µm 孔径）并脱气 1 小时。

  1. 使用容量为 200 µL 的手动移液器，将储存在 2 mL 微量离心管中的干燥肽沉淀重悬于 50 µL 缓冲液 C（3% v/v ACN，0.1% v/v 甲酸）中。将样品置于 35 kHz 超声频率的超声水浴中处理 15 分钟。
    注意：ACN 和甲酸为有害物质。请在通风橱内操作，并佩戴适当个人防护装备，例如手套。
  2. 在 4 °C 条件下，以 20,817 × g 离心 10 分钟，然后将 20 µL 上清液转移至玻璃小瓶中。
  3. 使用连接液相色谱系统的 C18 反相柱分离消化后的肽段，并利用质谱仪采集质谱数据。
    1. 以 300 nl/min 的流速在柱上进样 3 µL 样品。流动相使用缓冲液 C 和 D（63% v/v ACN，0.1% v/v 甲酸），建立梯度洗脱程序：在 20 分钟内乙腈浓度从 3% 升至 15%，随后在接下来的 10 分钟内升至 30%。
      注意：剩余样品可储存于 –20 °C 或 –80 °C，保存数月。在进行蛋白质组学检测前，需将样品置于冰上重新冷冻。
    2. 使用 60% ACN 洗脱污染物 10 分钟，并在下一个样品检测前用 5 µL 缓冲液 C 平衡色谱柱。
    3. 采用数据依赖的 MS/MS 方法采集质谱信号，设定分辨率为 70,000，AGC 目标值为 3e6 离子，最大注入时间为 100 ms，m/z 扫描范围为 300 至 1600。最多采集 15 次 MS/MS 扫描，分辨率为 17,500，AGC 目标值为 1e5，最大注入时间为 100 ms，填充率阈值为 20%，隔离窗口为 1.6 m/z，m/z 扫描范围为 200 至 2000。启用峰顶触发（6–20 s），设定动态排斥时间为 15 s，并排除电荷态为 1 和 > 5 的离子。

7. 蛋白质组学数据的处理

  1. 从 http://www.uniprot.org/ 下载最新的 Arabidopsis thaliana 蛋白质组数据库，并包含污染物数据库。使用 MaxQuant 软件及其集成的 Andromeda 肽段搜索引擎分析 LC–MS 运行获得的原始数据，采用默认设置并启用 LFQ 标准化20,21,22。有关所用参数的详细信息见表 S1。
  2. 打开“protein groups.txt”输出文件。为进一步分析，筛选出至少含有两个唯一肽段鉴定的蛋白质组。剔除 MaxQuant 标记为潜在污染物的蛋白质组，并筛选数据库中存在于 A. thaliana（Fasta 头文件列中标记为 ARATH）的蛋白质。
  3. 为检验样品间蛋白质富集的显著性，使用 LFQ 标准化强度值进行非配对双尾 Student's t 检验，并进行多重比较校正（例如 Benjamini & Hochberg 错误发现率（FDR）校正或 Bonferroni 校正）。
    1. 通过比较 EV 对照组与 NDPK1 组的 LFQ 强度值计算 p 值。剔除所有未确定的数值。将 p 值按升序排列，并使用 R 脚本或在线计算器（例如 https://www.sdmproject.com/utilities/?show=FDR）计算 FDR 校正值。筛选 FDR 值低于 0.1 的结果。
      注意：应根据研究需求选择合适的数据分析方式。对于定量研究（分析样品间蛋白质富集程度），使用“LFQ 强度”值；而对于定性研究（特定蛋白质的存在与否），则选择“强度”值。
    2. 筛选在 NDPK1 组中比 EV 对照组更丰富的蛋白质组。利用 SUBA 数据库23确定潜在蛋白互作伙伴的亚细胞定位，并排除与 NDPK1 共定位的蛋白质。

8. 使用超高效液相色谱-质谱法测定含极性相的样品。

  1. 将第4.5步得到的干燥极性相用200 µL水重悬，并对样品进行5分钟超声处理。
  2. 在4 °C条件下以20,817 × g离心10分钟，然后将上清液转移至玻璃小瓶中。
    注意：将剩余样品在–20 °C或–80 °C保存，可保存数月。在进行代谢组学检测前，需先将样品置于冰上重新冷冻。
  3. 采用超高效液相色谱（UPLC）连接C18反相柱进行分离，并通过质谱（MS）采集质谱数据。
    1. 每种电离模式（正离子和负离子模式）每次进样注入2 µL样品，使用400 µL/min流速进行组分分离。为建立代谢物检测所需的梯度条件，配制如下流动相溶液：缓冲液A（含0.1%甲酸的H2O）和缓冲液B（含0.1%甲酸的乙腈）。
    2. 以400 µL/min流速进行代谢物分离，采用以下梯度程序：1分钟时为99%缓冲液A，11分钟内线性梯度从99%缓冲液A变为60%缓冲液A，13分钟内线性梯度从60%缓冲液A变为30%缓冲液A，15分钟内线性梯度从30%缓冲液A变为1%缓冲液A，保持1%浓度至16分钟。从17分钟开始，使用线性梯度从1%缓冲液A升至99%缓冲液A。在分析下一个样品前，用99%缓冲液A重新平衡色谱柱3分钟。
    3. 采集质谱数据时，扫描质量范围为100至1500 m/z，分辨率设定为25,000，最大进样时间限制为100 ms。自动增益控制（AGC）目标值设为1e6，毛细管电压设为3 kV，鞘气流速和辅助气流速分别设为60和20。毛细管温度设为250 °C，锥孔电压设为25 V。

9. 代谢组学数据处理

  1. 处理从两种电离模式下采集的色谱图。使用软件提取相关峰的质荷比（m/z）、保留时间（RT）和强度。 例如， 商业软件（参见 材料表或替代方案24.
    1. 双击 .exe 文件以启动处理软件
    2. 创建新工作流，搜索“Load from File”活动，并通过“拖放”方式将该活动移至空白工作流区域。用鼠标右键点击该活动，打开其设置选项。
      1. 在包含“常规”设置的选项卡中，于“名称”字段内输入实验名称，然后点击“选择文件和文件夹”，并标记原始色谱图文件。
      2. 在包含“Advanced”设置的选项卡中，将“Profile Data Cutoff”设置为0强度。点击“Apply”和“OK”。
    3. 搜索并添加“Data Sweep”活动。用鼠标右键点击该活动，然后打开活动的设置。
      1. 在包含“常规”设置的选项卡中，勾选“质心数据”和“MS/MS 数据”。在选择面板中选择“全部”，以删除所有 MS/MS 数据。
    4. 搜索并添加“Chromatogram Chemical Noise Subtraction”活动。用鼠标右键点击该活动，并打开其设置。
      1. 在包含“常规”设置的选项卡中，勾选“色谱图平滑”，将扫描次数设置为“3”，“估算器”设置为“移动平均”。将“保留时间窗口”设为51次扫描，“分位数”设为50%，减法“方法”设为750，“强度阈值”设为750。
      2. 在包含“Advanced”设置的选项卡中，勾选“RT Structure Removal”，并将“Minimum RT Length”设置为5次扫描。
      3. 在包含“高级”设置的选项卡中，勾选“m/z 结构去除”，并将“最小 m/z 长度”设置为 3 个点。
    5. 搜索并添加“色谱图保留时间对齐”活动。用鼠标右键点击该活动，并打开其设置选项。
      1. 在包含“常规”设置的选项卡中，将“比对方案”设置为“成对比对基础树”，将“RT搜索间隔”设置为0.5 min。
      2. 在包含“Advanced”设置的标签页中，使用默认参数。
    6. 在“色谱图”活动组中搜索并添加“峰检测”活动。用鼠标右键点击该活动，然后打开活动设置。
      1. 在包含“常规”设置的选项卡中，将“积分时间窗”设为 0.09 min，“最小峰面积”设为 0.03 min，“最大合并距离”设为 5 个点，“合并策略”设为“中心法”。在“峰保留时间分割”框中，将“间隙/峰比值”设为 50%。
      2. 在包含“高级”设置的选项卡中，将“平滑窗口”设为5个点，“优化阈值”设为80%，“一致性阈值”设为1。将“中心计算”设为“强度加权”，并将其“强度阈值”设为70%。
    7. 在“色谱图”活动组中搜索并添加“同位素聚类”活动。用鼠标右键点击该活动，然后打开活动设置。
      1. 在包含“常规”设置的选项卡中，将“RT 容差”设为 0.015 min，“m/z 容差”设为 5 ppm。
      2. 在包含“Envelope fitting”设置的选项卡中，将“Method”设为“No Shape Restriction”，将“Ionization”设为“Protonation”（正离子模式）和“Deprotonation”（负离子模式）。将“Minimum and Maximum charge”分别设为1和4。
      3. 在包含“Advanced”设置的选项卡中，使用默认参数。
    8. 搜索并添加活动“Singleton Filter”。
    9. 要导出数据处理结果，请在“导出”活动组中搜索并添加“Analyst”活动。
      1. 在包含“常规”设置的选项卡中，将“类型”设置为“簇”，将“可观察值”设置为“总强度”。选择“自定义目标”，并指定导出文件的目录。
      2. 在包含“Advanced”设置的标签页中，使用默认参数。
  2. 使用内部参考化合物数据库注释质谱特征。
    1. 使用UPLC-MS分析一种或多种MS级参考化合物。采用相同的LC-MS方法分析参考化合物以及与目标蛋白共纯化的代谢物。
      注意：本研究分析并使用了近300种二肽作为参考化合物库。
    2. 使用分析（参见 材料表使用软件打开原始色谱文件，并搜索与所测参考化合物相关的特定质荷比（m/z）和保留时间（RT）（参见用户指南）。
      注意：次级代谢产物的离子化类型各不相同。可通过搜索质量数分别为 M-1.007276、M+1.007276、M+18.033823 和 M+22.989218 的离子，检测常见加合物的存在，分别对应 [M-H]、[M+H]、[M+NH4] 和 [M+Na]，分别。
    3. 使用电子表格打开色谱图处理后导出的“Analyst”文件，查找特定离子质量。比较实验中测得的质量特征保留时间（RT）与参考化合物的保留时间。允许 m/z 偏差为 0.005 Da，RT 偏差为 0.1 分钟。
  3. 为了检验特定蛋白质在不同样本间共纯化代谢物富集的显著性（过表达目标蛋白的株系 versus 空载体对照），采用双尾非配对 Student's t 检验比较峰强度值，并进行多重比较校正（例如 Benjamini & Hochberg 错误发现率校正或 Bonferroni 校正。

结果

在原始研究中，三个 A. thaliana NDPK 基因在组成型 35S 启动子的调控下于 PSB-L 细胞悬浮培养物中过表达14（图 1）。将串联亲和标签融合至诱饵蛋白的羧基端或氨基端。通过 MTBE/甲醇/水提取法处理亲和纯化的复合物16。使用质谱法鉴定亲和捕获的蛋白质和小分子（表 S2 和 S3）。

为校正假阳性结果，使用空白样品排除来自化学试剂和实验耗材的小分子污染物。此外，通过使用空载体（EV）对照组，排除了与亲和标签或树脂单独结合的代谢物和蛋白质。为获得真实阳性结果，采用双尾非配对 Student's t 检验并结合 Benjamini & Hochberg 错误发现率（FDR）校正方法，鉴定在 NDPKs 免疫沉淀实验（N 端和 C 端标记的 NDPKs）中相较于空载体对照组显著富集的代谢物（表 S4）和蛋白质（表 S5）（FDR < 0.1）。需要注意的是，在先前的研究中，我们采用存在/缺失标准来界定蛋白质和小分子相互作用物。

以NDPK1为例展示代表性结果，而代谢物数据则聚焦于二肽——这是我们课题组研究的一类新型小分子调节剂。蛋白质组学分析鉴定出26种NDPK1的潜在蛋白互作伙伴。通过进一步筛选与NDPK1共定位于相同亚细胞区域（细胞质）的蛋白，候选列表缩小至13种潜在的蛋白互作分子。所鉴定出的蛋白包括谷胱甘肽S-转移酶、两种翻译延伸起始因子、微管蛋白和乌头酸水合酶。代谢组学分析发现四种二肽Val-Leu、Ile-Glu、Leu-Ile和Ile-Phe能够特异性地与NDPK1共洗脱（图2）。值得注意的是，这四种二肽的N端均含有一个疏水性残基，提示其具有共同的结合特异性。

为了寻找已知的蛋白质-蛋白质和蛋白质-代谢物复合物，我们将13种已鉴定的蛋白质和4种二肽与Stitch数据库进行比对。25 (图3）。可以得出以下几点观察结果：（i）这些互作蛋白均未见先前在NDPK1中报道过。（ii）APX1的直系同源蛋白曾被报道与醛脱氢酶家族成员ALDH7B4相互作用，而翻译起始因子FBR12则与由基因AT2G40290编码的另一翻译起始因子相互作用。（iii）所鉴定出的二肽此前未见有任何已报道的蛋白质互作伙伴。共洗脱的二肽此前也未见报道与任何所获得的植物蛋白相关联。然而，它们在其他生物体中具有重要作用：Leu-Ile， 例如在人源细胞系中具有激活神经营养因子的作用26请注意，该实验无法确定系统的精确拓扑结构。例如，二肽可能直接与NDPK1相互作用，但也可能与任何共纯化的蛋白质相关。

综上所述，我们的结果表明，采用AP联合质谱技术的既定方法有助于鉴定蛋白质-蛋白质及蛋白质-小分子相互作用物，并能够获取关于目标蛋白质互作组的大量信息。

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图1. AP-MS 工作流程示意图。（A） 从植物细胞培养物中制备天然可溶性组分。（B） AP 实验流程的后续步骤。将样品上样至层析柱后，与TAP标签融合的目标蛋白（POI）会结合到固定在琼脂糖微珠上的IgG抗体。通过洗涤层析柱可去除未结合的蛋白质和代谢物。经AcTEV酶切后，洗脱出目标蛋白-代谢物复合物。（C） 将复合物分离为蛋白质组分和代谢物组分，随后进行半定量质谱分析。本图部分内容改编自 Luzarowski et al. 201714。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2. 与NDPK1特异性共洗脱的二肽。 在亲和纯化实验中检测到的四种二肽Val-Leu (A)、Ile-Glu (B)、Leu-Ile (C) 和 Ile-Phe (D) 的平均强度被绘制出来。与空载体对照组（EV）相比，这四种二肽在NDPK1样本中均显示出显著富集（星号表示FDR < 0.1）。误差条表示6次测量值的标准误差（包括N端和C端标签蛋白各3个重复）。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图3. NDPK1共洗脱的所有分子与STITCH数据库中已有实验及数据库证据（置信度 > 0.2）所揭示的相互作用网络。 置信度越高，表示发生相互作用的可能性越大，其数值基于已收录的数据计算得出。请点击此处查看该图的放大版本。

表 S1. MaxQuant 输出文件“parameters.txt”。 该表格包含用于鉴定和定量的阈值，以及所用数据库的相关信息。请点击此处下载该文件。

表 S2. MaxQuant 输出文件“proteinGroups.txt”中的信息。该表格包含所有鉴定到的蛋白质组列表、强度值以及额外信息，例如唯一肽段数量和评分。请点击此处下载该文件。

表 S3. 含极性代谢物分析结果的输出文件。该表格包含所有已鉴定的质量特征列表，每个特征由特定的 m/z、保留时间（RT）和强度表征。请点击此处下载该文件。

表 S4. 以 NDPK1、NDPK2 或 NDPK3 为诱饵时在 AP 样本中发现的二肽。 空白样本中存在的二肽已从列表中排除。每种 NDPK 分别使用两个独立的株系（N 端或 C 端标记）进行三重复实验。采用 Student t 检验，并通过 Benjamini & Hochberg 方法对 p 值进行进一步校正，以确定与 NDPK 显著富集的相互作用伙伴（FDR < 0.1）。表中给出的 ΔRT 是相对于参考化合物计算的结果，Δppm 是相对于 Metlin27 提供的单一同位素质量计算的结果。请点击此处下载该文件。

表 S5. 与 NDPK1 共纯化的蛋白质。 每种 NDPK 分别构建了两个独立的株系（N 端或 C 端标记），每组实验均进行三次重复。采用学生氏 t 检验，并通过 Benjamini & Hochberg 方法对 p 值进行进一步校正，以确定与 NDPKs 显著富集的相互作用蛋白（FDR < 0.1）。请点击此处下载该文件。

讨论

本方案可平行鉴定目标蛋白的PP和PM复合物。从克隆到获得最终结果，实验可在8至12周内完成。针对12至24个样本的一整套亲和纯化（AP）过程约需4至6小时，因此本方案适用于中等通量分析。

尽管该实验方案整体较为简单，但仍包含若干关键步骤。（i）足够的输入蛋白量和亲和 beads 用量对于实现代谢物检测的动态范围至关重要。因此，高效的细胞裂解是该实验流程中的关键步骤。蛋白得率过低可能是由于材料研磨不充分或裂解缓冲液与材料比例不理想所致。（ii）应确保所用试剂适合质谱检测。应避免使用强去污剂、甘油或过量盐类，因为它们会干扰质谱检测。（iii）在洗涤步骤中，琼脂糖 beads 不应过度干燥；当使用真空 manifold 时，应控制较低的流速，以避免破坏 beads 或影响复合物的稳定性。

对本方案存在一些重要的可能修改：（i）我们使用组成型 CaMV35S 启动子以最大化诱饵蛋白的表达量。尽管过表达非常有用，但可能对细胞稳态产生严重影响28，并导致形成无生理意义的相互作用。使用内源启动子表达带标签蛋白，并在可能的情况下于功能缺失背景下进行，被认为更有利于获得真实的生物学互作蛋白。对于在植物细胞培养中通常不表达的蛋白，可能需要使用植物整体背景以鉴定相关的互作蛋白。（ii）在处理膜蛋白时，裂解缓冲液需添加与质谱兼容的去垢剂。（iii）引入第二步亲和纯化步骤可提高真阳性与假阳性的比例，并消除对空载体对照（EV controls）的需求29。一种具有两个独立蛋白酶切割位点的新型串联标签，为 Maeda et al. 201411 所采用的尺寸排阻色谱步骤提供了一种更具吸引力的替代方案，后者既费力又耗时。

AP 最严重的缺点是假阳性率较高。原因多种多样。前文已提到组成型过表达的问题。另一个导致生理上无关相互作用的原因是，除非使用分离的细胞器，否则制备的全细胞裂解液会包含来自不同亚细胞区域的蛋白质和代谢物混合物。应利用亚细胞定位信息来筛选真实的相互作用蛋白。然而，大多数假阳性结果源于蛋白质与琼脂糖树脂之间的非特异性结合。如上所述引入第二步纯化是解决该问题的最佳方案，但会增加实验耗时并降低通量。此外，随着实验流程延长，较弱的相互作用可能会丢失。AP 的另一个局限性在于，尽管它能全面提供目标蛋白相互作用组的信息，却无法区分诱饵蛋白的直接作用靶点和间接作用靶点，因此需要通过靶向的双分子实验方法来验证相互作用。

采用亲和纯化（AP）结合基于质谱的代谢组学方法，用于研究酿酒酵母（S. cerevisiae）中的蛋白质复合物12。该研究与我们先前的观察结果13共同为本方案提供了概念基础，即类似于脂质，极性和中等极性化合物在从细胞裂解液中分离的蛋白质复合物上仍保持结合状态。本方案具有三个独特之处：（i）与先前在酵母中的研究12相比，本方案表明，亲和纯化不仅适用于获取疏水性蛋白配体，也适用于获取亲水性蛋白配体；（ii）通过引入一种“三合一”提取方案，可利用单次亲和纯化同时研究诱饵蛋白的相互作用蛋白和相互作用代谢物；（iii）我们将该方案优化并适配于植物细胞。

未来的研究将致力于构建一种具有两个独立蛋白酶切割位点的新型串联标签。我们还希望探索该方案在低丰度小分子（如植物激素）中的适用性。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们谨向 Lothar Willmitzer 教授表示诚挚的感谢，感谢他参与本项目、富有成效的讨论以及出色的指导。我们感谢 Daniel Veyel 博士在蛋白质组质谱检测方面的协助。我们感谢 Änne Michaelis 女士在液相色谱-质谱检测中提供的宝贵技术支持。此外，我们感谢 Monika Kosmacz 博士和 Ewelina Sokołowska 博士在原始稿件撰写工作中的帮助与参与，并感谢 Weronika Jasińska 提供的技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
含最低限度有机物的Murashige和Skoog基础盐Sigma-AldrichM6899
1-萘乙酸Sigma-AldrichN1641
激动素溶液Sigma-AldrichK3253
Tris 碱Sigma-Aldrich10708976001
NaClSigma-AldrichS7653
MgCl2卡尔·罗特2189.1
EDTASigma-Aldrich3609
NaFSigma-AldrichS6776
DTTSigma-AldrichD0632
PMSFSigma-AldrichP7626
E-64 蛋白酶抑制剂Sigma-AldrichE3132
蛋白酶抑制剂混合物Sigma-AldrichP9599
Na3VO4Sigma-AldrichS6508
AcTEV蛋白酶赛默飞世尔科技12575015
罗蒂电泳 凝胶 30 (37.5:1)卡尔·罗特3029.2
TEMED卡尔·罗特2367.3
PageRuler 预染蛋白标准品赛默飞世尔科技26616
SBP标签抗体（SB19-C4）Santa Cruz Biotechnologysc-101595
山羊抗小鼠 IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2005
Bradford 试剂Sigma-AldrichB6916
胰蛋白酶/Lys-C 混合物，质谱级Promega V5071
尿素Sigma-AldrichU5128
硫脲Sigma-AldrichT8656
碳酸氢铵Sigma-Aldrich9830
碘乙酰胺Sigma-AldrichI1149
MTBE Biosolve138906
甲醇 Biosolve136806
水Biosolve232106
乙腈Biosolve12006
三氟乙酸 Biosolve202341
甲酸 Biosolve69141
Unimax 2010 平板摇床Heidolph5421002000
尼龙网筛（丝径 34 µM，厚度 55 µM，开放区域 14%Prosepa定制订单
玻璃漏斗，47 mm，300 mlRestekKT953751-0000
500 mL 0.2 微孔滤膜瓶顶过滤器 µM Pes StVWR International GmbH514-0340
Mixer Mill MM 400Retsch GmbH207450001
IgG Sepharose 6 Fast FlowGE Healthcare Life Sciences17-0969-02
Mobicol “Classic” 带两种不同螺旋盖，不含滤器MoBiTec GmbHM1002
过滤（小型）35 µM 型孔径，适用于 Mobicol M 1002、M1003、M1050 && M1053MoBiTec GmbHM513515
可变速度试管旋转仪 SB 3卡尔·罗斯Y550.1
用于旋转器的旋转盘 SB 3卡尔·罗斯Y555.1
Resprep 24孔固相萃取装置Restek 26080
Finisterre C18/17% SPE 柱 100mg / 1mlTeknokromaTR-F034000
自动进样器 小瓶Klaus Trott 色谱法配件ör40 11 01 740
Acclaim PepMap 100 C18 液相色谱柱赛默飞世尔科技164534
EASY-nLC 1000 液相色谱仪赛默飞世尔科技LC120
Q Exactive Plus 混合四极杆-轨道阱质谱仪赛默飞世尔科技IQLAAEGAAPFALGMBDK
Acquity UPLC 系统 沃特斯 定制订单
ACQUITY UPLC HSS C18 色谱柱，100Å，1.8 μm µM, 2.1 mM X 100 mM, 1/包沃特斯 186003533
用于水基清洗溶液的高功率超声波清洗仪BandelinRK 31
Genedata ExpressionistGenedataNaN
Xcalibur 软件赛默飞世尔科技NaN
MaxQuantNaNNaN

参考文献

  1. Li, X., Snyder, M. Metabolites as global regulators: A new view of protein regulation. Bioessays. 33 (7), 485-489 (2011).
  2. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. Journal of Molecular Biology. 3 (3), 318-356 (1961).
  3. Schlattner, U., et al. Dual Function of Mitochondrial Nm23-H4 Protein in Phosphotransfer and Intermembrane Transfer a cardiolipin-dependent switch. Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 111-121 (2013).
  4. Ramírez, M. B., et al. GTP binding regulates cellular localization of Parkinson's disease-associated LRRK2. Human Molecular Genetics. , ddx161(2017).
  5. Jung, H. J., Kwon, H. J. Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery. Archives of Pharmacal Research. 38 (9), 1627-1641 (2015).
  6. Harding, M. W., Galat, A., Uehling, D. E., Schreiber, S. L. A receptor for the immunosuppressant FK506 is a cis-trans peptidyl-prolyl isomerase. Nature. 341 (6244), 758-760 (1989).
  7. Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
  8. Manabe, Y., Mukai, M., Ito, S., Kato, N., Ueda, M. FLAG tagging by CuAAC and nanogram-scale purification of the target protein for a bioactive metabolite involved in circadian rhythmic leaf movement in Leguminosae. Chemical Communications. 46 (3), 469-471 (2010).
  9. Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. Journal of Biomolecular Screening. 6 (6), 429-440 (2001).
  10. Li, X., Snyder, M. Analyzing In vivo Metabolite-Protein Interactions by Large-Scale Systematic Analyses. Current Protocols in Chemical Biology. , 181-196 (2010).
  11. Maeda, K., Poletto, M., Chiapparino, A., Gavin, A. -C. A generic protocol for the purification and characterization of water-soluble complexes of affinity-tagged proteins and lipids. Nature Protocols. 9 (9), 2256-2266 (2014).
  12. Li, X., Gianoulis, T. A., Yip, K. Y., Gerstein, M., Snyder, M. Extensive in vivo metabolite-protein interactions revealed by large-scale systematic analyses. Cell. 143 (4), 639-650 (2010).
  13. Veyel, D., et al. System-wide detection of protein-small molecule complexes suggests extensive metabolite regulation in plants. Scientific Reports. 7, (2017).
  14. Luzarowski, M., et al. Affinity purification with metabolomic and proteomic analysis unravels diverse roles of nucleoside diphosphate kinases. Journal of Experimental Botany. , (2017).
  15. Van Leene, J., et al. Targeted interactomics reveals a complex core cell cycle machinery in Arabidopsis thaliana. Molecular systems biology. 6 (1), 397(2010).
  16. Giavalisco, P., et al. Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using 13C, 15N and 34S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry. The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).
  17. Van Leene, J., et al. Isolation of transcription factor complexes from Arabidopsis cell suspension cultures by tandem affinity purification. Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. , 195-218 (2011).
  18. Van Leene, J., et al. A tandem affinity purification-based technology platform to study the cell cycle interactome in Arabidopsis thaliana. Molecular & Cellular Proteomics. 6 (7), 1226-1238 (2007).
  19. Olsen, J. V., Ong, S. -E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular & Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
  20. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  21. Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
  22. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301(2016).
  23. Hooper, C. M., et al. SUBAcon: a consensus algorithm for unifying the subcellular localization data of the Arabidopsis proteome. Bioinformatics. 30 (23), 3356-3364 (2014).
  24. Katajamaa, M., Orešič, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. Journal of Chromatography A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).
  25. Szklarczyk, D., et al. STITCH 5: augmenting protein-chemical interaction networks with tissue and affinity data. Nucleic Acids Research. 1277, (2015).
  26. Tanaka, K. -i, et al. Dipeptidyl compounds ameliorate the serum-deprivation-induced reduction in cell viability via the neurotrophin-activating effect in SH-SY5Y cells. Neurological Research. 34 (6), 619-622 (2012).
  27. Smith, C. A., et al. METLIN: A metabolite mass spectral database. Therapeutic Drug Monitoring. 27, 747-751 (2005).
  28. Bhattacharyya, S., et al. Transient protein-protein interactions perturb E. coli metabolome and cause gene dosage toxicity. Elife. 5, (2016).
  29. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).

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MTBE IgG Sepharose

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