本方案描述了量热呼吸法，即对热量耗散和呼吸作用进行直接且同步的测量，该方法可无创地评估能量代谢。通过监测细胞总能量流，该技术可用于评估有氧和无氧途径在能量利用中的各自贡献。
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摘要
摘要
在基础生物学和生物医学研究中，许多细胞系通过有氧呼吸和无氧呼吸相结合的方式来维持能量稳态。然而，这两种代谢途径在细胞能量生成中的具体贡献程度却常常被忽视。在葡萄糖饱和条件下培养的转化细胞通常表现出对氧化磷酸化产生ATP的依赖性降低，这一缺陷通过底物水平磷酸化的增强得以补偿。这种代谢平衡的改变使得细胞即使在存在线粒体毒素的情况下仍能增殖。若忽略转化细胞代谢平衡的改变，则药物筛选实验的结果可能被误读，因为在高葡萄糖浓度下培养的模型细胞系可能无法检测到潜在的线粒体毒性作用。本实验方案描述了两种强大技术——呼吸测定法和量热法的联合应用，可实现对细胞ATP生成过程中有氧和无氧贡献的定量、非侵入性评估。有氧呼吸和无氧呼吸均会产生热量，这一过程可被监测 通过 量热法。同时，通过测量氧气消耗速率可评估有氧呼吸的程度。当热量散失和氧气消耗同时被测量时，便可确定热量呼吸商。将实验获得的数值与理论氧热当量进行比较，即可判断无氧呼吸的程度。因此，热量呼吸联合测定法提供了一种独特的方法，可用于分析多种生物学问题，包括药物开发、微生物生长以及常氧和低氧条件下的基础生物能量学研究。
引言
在生物系统中，代谢过程中释放的热量或焓变通常通过直接方式监测（通过 直接量热法）或通过 O2 消耗和/或 CO2 产热（通过呼吸测定法）。遗憾的是，当这些技术单独使用时，一些关键信息会丢失，例如无氧途径对细胞代谢的贡献。量热呼吸联合测定法（calorespirometry）是一种强大的技术，依赖于对热耗散和呼吸作用的同步测量。早期的量热呼吸联合测定研究揭示了在完全氧合的哺乳动物细胞中存在无氧代谢，并证明即使在充分供氧的环境中，转化细胞的能量稳态仍同时依赖于有氧和无氧代谢途径的共同贡献1此后，热-呼吸测量法已被应用于多种生物学问题的研究，例如低氧条件下动物能量学的研究、除草剂和雌激素对双壳类动物鳃部的影响、陆生生物的代谢，以及微生物对土壤有机质的分解作用2,3,4,5,6此外，量热呼吸测定法揭示了冻存前的代谢预处理如何改善哺乳动物细胞的冷冻保存效果7每种方法，无论是量热法还是呼吸测定法，都独立地增进了我们对细胞和有机体生物能量学的认识。然而，通过热量-呼吸....
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方案
1. 细胞培养
- 在细胞培养箱（5% CO2、95% 空气、100% 湿度）中，于 37 °C 条件下，使用含 10% 胎牛血清（FBS）及额外底物（10 mM 葡萄糖、2 mM 谷氨酰胺和 1 mM 丙酮酸）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）培养人肝细胞癌（HepG2）细胞。
注意：在后续呼吸测定和量热测定步骤中，凡提及使用 DMEM 时，均应采用上述配方。 - 将细胞以每 100 mm 培养皿 1 × 106 个细胞的密度接种，每 7 天传代一次，或在细胞融合度达到 90% 前进行传代，并每 3–4 天更换一次培养基。
- 在细胞融合度为 60–80% 时进行实验。
2. 呼吸计和量热计的准备
- 将2.2 mL DMEM移液至呼吸测定室中，完全插入塞子，并使用塞子间隔工具进行调整，以促进氧气从空气向培养基中的最佳扩散。
- 在37 °C下持续搅拌，直至氧浓度（蓝色轨迹）和氧通量（红色轨迹）稳定。确保呼吸计的软件已设置为考虑实验所用培养基的氧溶解度。
注意：不同培养基的氧气溶解度系数不同（例如，DMEM = 0.92。 - 在培养箱打开状态下，待DMEM中的氧浓度稳定后，选取氧浓度曲线的稳定部分，并将其校准为100%空气饱和度。
- 在腔室内无氧气存....
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结果
量热-呼吸联合测量的可重复性取决于正确且一致的样品制备。若培养皿中细胞过度生长，则不应使用由此制备的样品，因为细胞聚集会导致细胞计数不准确。此外，聚集的细胞可能导致底物扩散受限，从而降低热流量。因此，在使用贴壁细胞时，关键是要选择细胞融合度在60%至80%之间的培养皿，并在实验前24小时更换培养基。
正确的仪器校准和维护对于获得具有信息性和可重复性的量热-呼吸测量结果也至关重要。应遵循呼吸仪制造商规定的清洗方案，使用乙醇进行充分清洗，以确保清除残留的疏水性解偶联剂和抑制剂，避免其对线粒体产生部分抑制或解偶联作用，从而影响测量结果。在呼吸仪样品测量开始前，氧浓度和氧通量曲线均应保持稳定，如图1所示。若POS（氧传感器）需要维护，氧通量将无法稳定，如图2所示。当POS未得到适当维护时，不应进行测量。此外，量热仪中使用的安瓿瓶在使用前应进行清洗、灭菌和干燥，因为生物污染可能干扰样品的产热。
在完成呼吸计和量热计的适.......
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讨论
热量呼吸测定法的目的是定量评估有氧和无氧途径对代谢活动的贡献，并获得细胞能量通量的综合视图。该目标通过同时测量热耗散和氧通量，随后将计算得到的呼吸商（CR）比值与理论上的氧热当量进行比较来实现。为获得可重复且可靠的数据，必须注意若干关键步骤。无菌且健康的细胞培养体系的维持至关重要。细菌或真菌污染可能导致热产生或耗氧量的错误归因，从而使CR比值失去意义。此外，细胞计数不准确、样品混合不充分或细胞成团聚集，也可能导致CR比值不准确。关于呼吸仪使用的一个关键步骤是正确的样品制备，以确保加样体积低于50 µL。该体积可最大限度减少反应室中培养基的置换量，从而准确将耗氧量归因于2 × 106个细胞。当观察到基础呼吸稳定后，本方案还可兼容后续两次滴定（寡霉素和FCCP），以分别揭示线粒体的泄漏呼吸和电子传递链（ETS）容量。在此应用中，过量添加FCCP可能抑制呼吸并阻碍 最大非耦合呼吸通量的实现；因此，应进行至少3至5次梯度滴定，以达到最大非耦合呼吸状态。
呼吸计和量热计的维护与正确校准对于热-呼吸联合测定至关重要。强烈推荐采用逐步滴定连二亚硫酸盐的方法进行背景.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分由美国国家科学基金会资助，资助号为 CHE-160944，授予 Mary E. Konkle 和 Michael A. Menze。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HepG2 细胞 | American Type Culture Collection | HB-8065 | 用于热量-呼吸联合测定的细胞 |
| O2k-呼吸仪 | Oroboros Instruments | 10022-02 | 呼吸仪 |
| LKB 2277 热活性监测仪 (TAM) | Thermometric AB | Thermometric 已被 TA Instruments 收购 | |
| 丙酮酸钠 (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | 添加至 DMEM 培养基中的 100 倍浓缩液 |
| 胎牛血清 - Premium Select | Atlanta Biologicals | S11550 | 添加至 DMEM 培养基中至终浓度 10% |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | 细胞解离试剂 |
| 来自 Streptomyces diastatochromogenes 的寡霉素 | Sigma Aldrich | O4876 | 线粒体抑制剂 |
| 羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙 | Sigma Aldrich | C2920 | 线粒体解偶联剂 |
| Corning 100 mm 经组织培养处理的培养皿 | Corning Corporation | 430167 | 组织培养皿 |
| 葡萄糖，粉末 | Thermo Fisher Scientific | 15023021 | 用于 DMEM 培养基的葡萄糖 |
| 半乳糖，粉末 | Fisher Scientific | BP656500 | 用于 DMEM 培养基的半乳糖 |
| L-谷氨酰胺 (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | 用于 DMEM 培养基的谷氨酰胺 |
| 无葡萄糖 DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11966025 | 细胞培养基 |
参考文献
- Gnaiger, E., Kemp, R. B. Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux. Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).
- Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S.
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重印与许可
