本文介绍了一种利用JC-1染料检测细胞在缺氧/复氧处理（无论是否添加保护剂）后线粒体膜电位的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
及时有效地恢复闭塞冠状动脉的血流是缩小ST段抬高型心肌梗死患者心肌梗死面积的最佳策略。然而，再灌注 本身 可能导致心肌细胞进一步死亡，这一现象被称为再灌注损伤。线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放以及线粒体膜电位（MMP）的降低，即线粒体去极化，被普遍认为是再灌注损伤的最终环节，也是导致线粒体和心肌细胞死亡的关键因素。JC-1 是一种亲脂性阳离子染料，可依据 MMP 的大小在细胞器线粒体内聚集：MMP 越高，JC-1 在线粒体内的积聚越多。随着线粒体内 JC-1 含量的增加，其荧光发射波长会发生从绿色（约 530 nm）到红色（约 590 nm）的转变。因此，红/绿荧光强度比值的降低可反映线粒体的去极化状态。在此，我们利用 JC-1 染色结合流式细胞术，检测人源心肌细胞在缺氧/复氧处理后 MMP 的变化，即 mPTP 的开放情况。
引言
冠心病是全球死亡的首要原因。对于ST段抬高型心肌梗死患者，减少缺血性损伤并限制梗死面积的首选治疗方法是通过直接经皮冠状动脉介入治疗（PCI）实现及时有效的心肌再灌注1,2。然而，再灌注本身会造成额外损伤，其可占最终梗死面积的30%3。目前普遍认为，线粒体通透性转换孔（mPTP）不仅在缺血/再灌注（I/R）过程中的线粒体损伤和细胞死亡中起核心作用，同时也是心脏保护信号通路的共同作用靶点4,5。由于mPTP的开放会导致线粒体内膜电位（MMP）去极化4，因此我们采用5,5′,6,6′-四氯-1,1′,3,3′-四乙基咪唑羰花青碘化物（JC-1）检测法来检测mPTP的开放情况。
JC-1 检测是一种细胞荧光测定方法，兼具定性和定量特性，并已通过在单个线粒体水平上分析线粒体膜电位（MMP）得到进一步验证6。在具有正常 MMP 的线粒体基质中，JC-1 以聚集形式存在，产生红色至橙色荧光发射（590 ± 17.5 nm）；当 MMP 丧失时，JC-1 转变为单体形式，发出绿色荧光，发射波长为 530 ± 15 nm。因此，红/绿荧光强度比值的降低可能提示在缺血/再灌注（I/R）等条件下 MMP 的下降。
除了 JC-1 外，线粒体膜电位（MMP）还曾使用膜通透性脂溶性阳离子如罗丹明 123 和 3,3′-二己氧基羰花青碘化物 [DiOC6(3)] 进行研究。然而，与这两种探针相比，JC-1 在分析 MMP 时更为可靠。罗丹明 123 的灵敏度相对较低（尤其是在淬灭模式下7,8），且特异性较差。罗丹明 123 的荧光变化有时非常微弱，难以被研究人员或仪器观察或检测到。此外，在单个细胞中，罗丹明 123 可结合于线粒体的不同位点，从而可能产生不同的荧光发射信号9。DiOC6(3) 也不推荐用于检测 MMP，因为它对细胞膜去极化反应敏感10。
因此，本研究采用JC-1法检测在缺氧/复氧条件下（有或无保护剂处理）人心肌细胞（HCMs）的线粒体膜电位（MMP）。
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方案
1. 试剂与溶液的准备
- 根据制造商说明，将25 mL心肌细胞生长培养基补充剂混合液加入500 mL心肌细胞生长培养基中，配制人源心肌细胞（HCMs）完全培养基。4 °C保存，使用前预热至37 °C。
- 将通心络（TXL）超微粉溶解于无血清/无葡萄糖的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，配制通心络（TXL）溶液，并通过添加DMEM调节TXL浓度至400 µg/mL（更多细节参见11）。4 °C保存，使用前预热至37 °C。
- 在15 mL离心管中避光条件下，加入25 µL JC-1储备液（200倍）、4 mL超纯水和1 mL染色缓冲液储备液（5倍），混匀配制成5 mL JC-1工作液。轻轻吹打混匀数次，使用前预热至37 °C。
- 在50 mL离心管中，将6 mL染色缓冲液储备液（5倍）与24 mL超纯水混合，配制成30 mL工作染色缓冲液。使用时保持冰浴状态。
2. 缺氧/复氧模型的建立
- 在6孔板中，每孔接种1.0 × 105个细胞，加入完全HCM培养基，在37 °C、含5% CO2和95%空气的细胞培养箱中培养，使细胞融合度达到约70%。
- 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤HCM细胞，在缺血清/葡萄糖的DMEM培养基（2 mL）中进行不同处理（加入或不加入400 µg/mL TXL），于37 °C、含5% CO2和95%空气的细胞培养箱中孵育30分钟，随后进行缺氧处理。
- 将HCM细胞置于密闭缺氧罐（2.5 L）中孵育18小时（图1A），罐内装有催化剂以清除游离氧以诱导缺氧状态，并配有厌氧指示剂以监测培养基中的氧张力11,12,13，同时将缺氧罐置于37 °C、含5% CO2和95%空气的细胞培养箱中。
注意：催化剂清除罐内游离氧约需1.5小时，因此在打开缺氧罐前，HCM细胞在罐内共孵育19.5小时。厌氧指示剂的颜色在常氧环境下为浅蓝色，在缺氧条件下变为淡白色（图1B）。 - 将6孔板转移至37 °C、含5% CO2和95%空气的培养箱中，复氧2小时。
3. 流式细胞术用人心肌细胞的制备
- 将0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液和PBS预热至37 °C。
- 吸除每个孔中的培养基，用1 mL PBS冲洗细胞，并沿孔壁加入0.5 mL 0.25%胰蛋白酶溶液。
- 在37 °C孵育，直至几乎所有HCMs几乎完全脱落（约1分钟）。
- 向孔中加入1 mL完全DMEM培养基（含10%胎牛血清的DMEM培养基）以中和胰蛋白酶。将细胞悬液转移至15 mL离心管中，并在室温下以500 × g离心3分钟，沉淀HCMs。
- 小心吸除上清液，避免扰动沉淀。
- 向每根离心管中加入0.5 mL HCM完全培养基和0.5 mL JC-1工作液。通过反复吹打重悬HCMs。
- 用铝箔包裹整个离心管，防止荧光指示剂褪色，并在正常培养条件下（37 °C，含5% CO2和95%空气）孵育HCMs 20分钟。
- 在4 °C下以500 × g离心3分钟，沉淀HCMs。
- 用2 mL冰预冷的JC-1染色缓冲液冲洗HCMs两次。
- 将HCMs重悬于样品管（12 mm × 75 mm）中，最终体积为300 µL的冰预冷染色缓冲液，并在30分钟内进行分析。
注意：使用强效呼吸链电子传递抑制剂羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）作为阳性对照，在20 µM浓度下处理HCMs 1小时。
4. 流式细胞仪设置
- 启动流式细胞仪，并确保软件已与其连接。
- 执行流路启动，开启液流并设置液滴断裂点。
- 在流式细胞术软件中打开两个散点图窗口。
- 在第一个散点图中，X 轴选择前向散射光（FSC），Y 轴选择侧向散射光（SSC），分别表示细胞的大小和颗粒度特征。
- 在第二个散点图中，使用对数刻度，X 轴选择 FITC（530 ± 30 nm）检测通道，Y 轴选择 PE（575 ± 26 nm）检测通道，用于检测细胞内 JC-1 染料的荧光强度。
5. 流式细胞术检测与数据分析
- 点击 Unload 以释放管支撑臂，并将未用 JC-1 染色的 空白 样品管放置于其上。点击 Load 将管支撑臂恢复至工作位置。
- 点击 Record 以从 空白 样品管的悬液中收集颗粒，并在第一个散点图中圈选细胞群（P1），用于后续分析（图3）。
- 收集其他样品管中的 HCMs，并通过调整荧光通道电压优化检测参数，确保细胞散点位于第二个散点图的中央区域。
- 显示各样品管的统计结果，并通过红色荧光强度与绿色荧光强度的比值计算各样品的线粒体膜电位（MMP）。
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结果
在进行JC-1实验以评估线粒体膜电位（MMP）变化之前，强烈建议先开展预实验，以验证研究人员所设定的实验条件是否成功。如流式细胞术结果（图2）所示，与正常组相比，缺氧/复氧（H/R）显著诱导了人心肌细胞（HCMs）的凋亡（Annexin V + /PI±），表明我们已成功建立了一种基于细胞的缺血/再灌注（I/R）模型（45.00 ± 2.13% vs. 正常组的11.50 ± 0.18%，p <0.05）。具有心脏保护作用的中药通心络可在H/R条件下抑制HCMs的凋亡（24.50 ± 1.13% vs. H/R组的45.00 ± 2.13%，p <0.05）。
CCCP 是一种质子载体，可通过解偶联电子传递链中电子载体正常活动期间建立的质子梯度（线粒体膜电位丧失），从而抑制线粒体中的氧化磷酸化。因此，将经 CCCP 处理的 HCMs 设为阳性对照...
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讨论
本文介绍了一种利用JC-1染料检测细胞经H/R处理后线粒体膜电位（MMP）的实验方案。通过JC-1检测法测定的细胞MMP不受线粒体大小、形态和密度等因素的影响，而这些因素可能干扰单组分荧光信号的检测14。因此，JC-1检测结果相对可靠。此外，JC-1检测操作简便且节省时间。该方法对材料和试剂的需求较低，通常从细胞脱离到完成MMP检测，染色过程耗时不到1.5小时。
在进行JC-1实验时，若研究人员希望获得可靠且满意的结果，则有几个关键步骤尤为重要。首先，用JC-1染色后的细胞应保存在冰上预冷的染色缓冲液中，直至通过流式细胞仪进行检测。温度对线粒体膜电位（MMP）的稳定性具有显著影响，样本在室温下放置短暂时间后其检测值可能发生显著变化。此外，建议预先开展实验以确定CCCP的预处理时间和浓度，确保阳性对照组的红/绿荧光比值接近于0。值得注意的是，羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）同样能够消除MMP并抑制氧化磷酸化，可作为CCCP的替代物用于建立阳性对照10。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到中国国家重点研发计划（编号：2017YFC1700503）、中国国家基础研究计划（973计划）（编号：2012CB518602）、国家自然科学基金（编号：81370223 和 81573957）以及北京协和医学院研究生创新研究基金（编号：2016-1002-01-02）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| JC-1线粒体膜电位检测试剂盒 | Beyodtime, 中国 | C2006 | 试剂盒内含JC-1储存液（200×）、染色缓冲液（5×）和CCCP（10 mM） |
| 通心络超微粉 | 石家庄以岭药业股份有限公司，中国 | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒 | Becton-Dickinson, 美国 | 556547 | |
| DMEM培养基 | Life Technologies, Grand Island Biological Company, 美国 | 11966-025 | |
| 人心肌细胞 | Promocell, 德国 | C-12810 | |
| 心肌细胞生长培养基 （添加剂混合物） | Promocell, 德国 | C-39275 | |
| 心肌细胞生长培养基（即用型） | Promocell, 德国 | C-22070 | 需与心肌细胞生长培养基添加剂混合物联合使用 |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, 法国 | 96127 | 2.5 L |
| 催化剂（AnaeroPack） | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , 日本 | C-1 | |
| 厌氧指示剂 | BioMérieux, Marcy l’Etoile, 法国 | 96118 | |
| 流式细胞仪 | Becton-Dickinson, 美国 | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva 软件 | Becton-Dickinson, 美国 | 版本8.0.1 | |
| 样品管 | Corning science, 美国 | 352054 | 12*75 mm |
| PBS缓冲液 | Hyclone, 美国 | SH30256.01 |
参考文献
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