方法文章

流式细胞仪测定缺氧/复氧后心肌细胞线粒体膜电位的实验研究

DOI：

10.3791/57725

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2018年7月13日

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1State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Department of Cardiology, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

本文内容

摘要

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在这里, 我们提出一个协议, 使用 JC-1 染料评估细胞线粒体膜电位后, 暴露在缺氧/复氧与或没有保护剂。

摘要

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及时有效地再灌注闭塞性冠状动脉是降低 st 段抬高心肌梗死患者心肌梗死大小的最佳策略。然而, 再灌注本身可能导致进一步的心肌细胞死亡, 这一现象被称为再灌注损伤。线粒体通透性过渡孔隙 (mPTP) 的开放, 随着线粒体膜电位 (基质) 的减少, 或线粒体的退极化, 被普遍认为是再灌注损伤的最后一步, 负责线粒体和心肌细胞死亡。JC-1 是一种脂溶性阳离子染料, 在线粒体中积累取决于基质的价值。基质金属蛋白酶越高, 线粒体中的 JC-1 积累越多。线粒体中 JC-1 含量的增加可以通过荧光发射从绿色 (~ 530 nm) 到红色 (~ 590 nm) 来反映出来。因此, 降低红/绿荧光强度比可以表明线粒体的退极化。在这里, 我们利用 JC-1 测量基质金属蛋白酶, 或在缺氧/复氧后的人心肌细胞中 mPTP 的开放, 通过流式细胞术检测。

引言

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冠心病是全世界死亡的主要原因。ST 段抬高心肌梗死患者减少缺血性损伤和限制梗死大小的选择是通过经皮冠状动脉介入治疗 (PCI) 的及时有效的心肌再灌注1, 2。然而, 再灌注导致额外的损伤, 可能占到最后梗塞大小的30% 的3。普遍认为线粒体通透性过渡孔隙 (mPTP) 不仅是缺血/再灌注过程中线粒体损伤和细胞死亡的中枢, 而且也是心肌梗死信号4的收敛目标。,5. 随着 mPTP 的开放将导致内线粒体膜电位的退极化 (基质金属蛋白酶)4, 我们检测到 mPTP 开放使用 5,5′, 6,6′四氯化碳 1,1′, 3,3′-四乙基 imidacarbocyanineiodide (JC-1) 化验。

JC-1 法是一种定性和定量的 cytofluorimetric 方法, 通过对单个线粒体6级的基质细胞进行分析, 进一步验证了它的有效性。JC-1 作为一种聚集形式存在, 在线粒体基质中产生红色到橙色的辐射 (590 17.5 nm);随着基质的丧失, JC-1 被转化为单体形式, 产生绿色荧光, 发射量为....

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方案

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1. 试剂和溶液的制备

  1. 根据制造商的指示, 加入25毫升肌细胞生长培养基补充剂, 以500毫升的细胞生长培养基, 制备人心肌肌 (母国) 全培养基。在使用前贮存在4°c 和温暖到37°c。
  2. 将 txl-特格尔超细粉溶于血清/葡萄糖 Dulbecco 修饰鹰的培养基 (DMEM) 中, 制备通心络 (txl-特格尔) 溶液, 并通过添加 txl-特格尔将µg 浓度调整为 400 DMEM/毫升 (详情见11)。在使用前贮存在4°c 和温暖到37°c。
  3. 在黑暗中, 在15毫升离心管中加入25µL JC-1 溶液 (200x)、4毫升超纯水和1毫升的库存染色缓冲器 (5x), 准备5毫升的 JC-1 工作溶液。在使用前用吸管将混合物上下数次, 加热到37摄氏度。
  4. 在50毫升离心管中加入24毫升的超纯水到6毫升的库存染色缓冲器 (5x), 制备30毫升工作染色缓冲器。使用此解决方案冰冷。

2. 建立缺氧/复氧模型

  1. 板 1.0 x 105细胞每井与 HCM 完全媒介在6个井板材。生长达到约70% 的融合在细胞孵化器包含 5% CO2和95% 空气在37°c。
  2. 用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗母国措施。使他们接触不同的治疗方法 (400 µg/毫升 txl-特格尔或....

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结果

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在进行 JC-1 试验以评估基质金属蛋白酶的变化之前, 强烈建议进行实验以确认研究人员成功确定的条件。如流式细胞术结果 (图 2) 所示, 与正常组相比, 缺氧/复氧 (H/r) 显著诱导了母国措施 (蛋白 V +/PI±) 的凋亡, 表明我们建立了一个基于细胞的 I/R (45.00 2.13% vs) 模型。11.50, 0.18% 在正常组, p < 0.05)。通心络是一种具有心肌作用的中药, 在 h/r 组 ( p < 0.05) 的条件下, 防止母国措施的凋亡 (24.50 @ 1.13% vs 45.00 @ 2.13%)。

CCCP 是一种 protonophore, 它能抑制线粒体中的氧化磷酸化, 并将电子转运链中电子载体正常活动时建立的质子梯度 (基质损耗) 解耦。因此, 用 CCCP 处理的母国措施被设置为积极控制。如

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讨论

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在这里, 我们提出一个协议, 使用 JC-1 染料来评估细胞的基质干细胞暴露后, 通过 JC-1 检测发现, 细胞的基质干细胞是独立的因素, 如线粒体大小, 形状和密度可能影响单组分荧光信号14。因此, JC-1 化验结果比较可靠。同时, 对 JC-1 的检测具有很方便、省时的性能。这种检测对材料和试剂的要求很低, 一般情况下, 从细胞分离到基质金属蛋白酶的测量, 其染色需要少于1.5 小时。

如果研究人员想要获得可靠和满意的结果, 那么在执行 JC-1 分析时, 一些关键步骤是不能被夸大的。首先, 装满 JC-1 的细胞应储存在冰冷的染色缓冲中, 直到它们被流式室采集。温度对基质金属蛋白酶的稳定性有很大影响, 在室温下, 一个样品的值在短时间内变化很大。此外, 还建议初步实验确定 CCCP 的预处理时间和浓度, 确保阳性对照的红/绿比为0。值得注意的是, 羰基氰化物 4-(三氟甲氧基) 苯腙 (FCCP), 这也可以消除基质金属蛋白酶和抑制氧化磷酸, 是一种替代 CCCP, 也可以用来建立积极的控制

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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本研究由中国国家重点研究开发项目 (2017YFC1700503)、全国基础研究计划 (973 计划)、中国国家自然科学基金 (81370223 号) 资助。81573957号), 以及北京协和医学院研究生创新研究基金会 (2016-1002-01-02)。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
含 JC-1 的线粒体膜电位测定试剂盒Beyodtime， 中国C2006试剂盒中有 JC-1 储备液（200 次;）、原液染色缓冲液（5 次;）和 CCCP（10 mM）
同心罗超细粉末石家庄伊岭药业有限公司071201
膜联蛋白 V-FITC/PI 试剂盒Becton-Dickinson，美国556547
DMEMLife Technologies，Grand Island Biological Company，美国11966-025
人心肌细胞Promocell，德国C-12810
肌细胞生长培养基
（SupplementMix）		Promocell，德国C-39275
心肌细胞生长培养基（即用型）Promocell，德国C-22070与肌细胞生长培养基 SupplementMix
GENbox生物Mérieux， Marcy l'星辰， 法国961272.5L
催化剂 （AnaeroPack）三菱气体化学 COMPANY， INC. ， 日本 C-1
厌氧指示剂BioMérieux， Marcy l'星辰， 法国96118
流式细胞仪Becton-Dickinson， 美国FACSAria 2
BD FACSDiva 软件Becton-Dickinson， 美国版本8.0.1
样品管康宁科学， 美国35205412*75mm
PBS海克隆， 美国SH30256.01

参考文献

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  1. Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
  2. Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for th....

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JC 1

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