本文介绍了可视化由志贺氏菌（Shigella）感染HeLa细胞所引发的钙离子（Ca2+）反应的实验方案。通过优化细菌感染参数并结合Ca2+荧光探针进行成像，可表征细菌在较宽感染动力学范围内诱导产生的非典型全局性和局部性Ca2+信号。
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本文内容
摘要
摘要
Ca2+ 是一种普遍存在的离子，参与所有已知的细胞过程。虽然全局性的 Ca2+ 反应可能影响细胞命运，但细胞质中游离 Ca2+ 浓度的局部变化——与细胞内储存库的释放或质膜通道介导的内流相关——调控着细胞皮层区域的细胞活动。黏附或侵入宿主细胞的病原体会引发宿主质膜下方肌动蛋白细胞骨架的重组，这可能同时影响全局性和局部性的 Ca2+ 信号传导。由于这些事件可能以较低频率、近似随机的方式在较长时间的动力学过程中发生，因此对病原体诱导的 Ca2+ 信号进行分析带来了重大的技术挑战，亟需解决。
在此，我们报告了用于检测全局和局部 Ca2+ 信号在……时出现 志贺氏菌 上皮细胞感染。在这些方案中，与长时间暴露以及与钙离子荧光探针激发相关的光损伤所导致的假象2+ 通过在特定时间段内严格控制采集参数来对荧光探针进行故障排查 志贺氏菌 侵袭。通过严格的操作程序分析全细胞质钙离子的振幅和频率2+ 使用化学探针 Fluo-4 在延长的感染动力学过程中检测信号。
引言
Ca2+ 调控所有已知的细胞过程，包括细胞骨架重组、炎症反应以及与宿主-病原体相互作用相关的细胞死亡通路1,2,3。在生理条件下，细胞质基础 Ca2+ 浓度较低，处于数百 nM 范围内，但在激动剂刺激下可发生短暂升高。这些变化通常通过质膜和内质网膜上的泵和通道作用呈现出振荡行为。这些振荡的特征由 Ca2+ 升高的周期、持续时间和幅度决定，并被细胞解码，从而触发特定的细胞反应，这一机制被称为 Ca2+ 编码4,5。在病理条件下，细胞质 Ca2+ 浓度持续升高可能导致细胞死亡，其机制与线粒体膜通透性增加以及促凋亡或坏死因子的释放有关6,7。
Shigella 是细菌性痢疾的致病菌，通过III型分泌系统（T3SS）将效应蛋白注入宿主细胞，从而侵入上皮细胞8,
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方案
1. 准备工作
- 细菌准备
- 接种细菌——志贺氏菌 在含有0.01%刚果红（CR）的胰蛋白胨大豆（TCS）琼脂平板上接种表达AfaE黏附素的野生型菌株（M90T-AfaE），于37 °C培养18小时。
注意：为了提高其可重复性， 志贺氏菌 步骤1.1.1中获得的平板应保存在4 °C，且应在一周内使用，因为CR培养基上的所有菌落随时间推移最终都会变为红色。 - 从划线平板上挑取3个红色菌落接种于TCS肉汤中进行预培养。
注意：接种3个菌落以限制挑取单个克隆时其毒力质粒发生遗传重组的概率。 - 在37 °C、200 rpm条件下，于摇床培养箱中培养液体细菌培养物16小时。加入氨苄青霉素，使其终浓度为75 mg/mL。抗生素浓度不应超过最低抑菌浓度的3倍，因为过量抗生素可能导致大型毒力质粒的丢失。
注意：维持的 志贺氏菌 毒力质粒应通过将细菌培养物涂布于补充适当抗生素浓度的CR平板上来验证。白色菌落的出现表明质粒丢失。 - 以1:100的稀释比例将细菌预培养物接种至TCS培养基中。在37 °C、200 rpm条件下，于摇床培养箱中培养2小时。确保在600 nm处的光密度（OD600 nm0.2 - 0.4
- 在21 °C下以13,000 × g离心细菌培养物2分钟，....
- 接种细菌——志贺氏菌 在含有0.01%刚果红（CR）的胰蛋白胨大豆（TCS）琼脂平板上接种表达AfaE黏附素的野生型菌株（M90T-AfaE），于37 °C培养18小时。
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结果
志贺氏菌侵袭与非典型的持久性局部 Ca2+ 反应相关：
按照上述方案，用 Fluo-4 负载的 HeLa 细胞经野生型（WT）处理 志贺氏菌 并进行连续采集以分析 Ca2+ 信号。一个代表性实验如图所示。 图1，包含单个细胞在感兴趣区域内的Fluo-4探针荧光强度平均值的时间序列延时图像，以及相应的相差图像图1A，左侧面板）。 志贺氏菌 侵袭位点的特征是相差图像中检测到的细胞膜皱褶（图1A，箭头）。游离胞质 Ca 的非典型局部增加2+ 在...处观察到 志贺氏菌 侵袭位点的振幅变化，持续时间范围为 2.5 - 5 s（图1A
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讨论
本文描述了我们设计的实验方案，用于在Shigella侵袭过程中相对较短的动力学阶段监测局部Ca2+信号，以及在Shigella较长动力学过程中监测全局Ca2+反应。以下列出了为优化Ca2+信号检测并最大限度减少对生物过程干扰所需解决的关键问题。
化学 与 基因编码的 Ca2+ 探针：
为了成像局部 Ca2+ 的变化，我们采用了 Fluo-4 化学探针，因其具有较高的量子产率和快速的响应动力学。由于成像所需的速度较快，无法使用比率型探针，因为无法实现双波长同步采集。然而，病原微生物的使用可能会干扰基于 Ca2+ 化学探针的标准操作流程。例如，志贺氏菌（Shigella）持续感染细胞超过 60 分钟会阻碍细胞对化学探针的负载，这可能是由于病原体诱导的宿主细胞质膜结构改变所致。与此一致的是，在长时间感染过程中，可观察到细胞相关 Fluo-.......
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
我们感谢Jenny-Lee Thomassin在修改手稿过程中提供的帮助。本研究工作得到了ANR项目MITOPATHO和PATHIMMUN、Labex Memolife和PSL IDEX Shigaforce资助项目的资助。孙春晖获得了中国国家留学基金管理委员会的博士生奖学金。Laurent Combettes和Guy Tran Van Nhieu获得了WBI-France交流Tournesol项目的资助。°31268YG（比利时法语区国际关系署、科学研究中心基金、法国外交与欧洲事务部、法国高等教育与研究部，作为居里合作伙伴计划的一部分）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| Metamorph 版本 7.7 | Universal Imaging | ||
| CoolLED 照明系统 pE-2 | Roper Scientific | ||
| 35 mm 高底培养皿 | IBIDI | 81156 | |
| 胰蛋白胨大豆肉汤（TCS broth） | Thermofisher | B11768 | |
| TCS 琼脂 | Thermofisher | B11043 | |
| 刚果红 | Sigma-Aldrich | 75768 | |
| M90T-AfaE | Sun et al. 2017 | Shigella flexneri 血清型 V，表达 AfaE 黏附素 | |
| ipgD-AfaE | Sun et al. 2017 | 表达 AfaE 黏附素的同基因 ipgD 突变株 |
参考文献
- Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier. Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).
- Strehler, E. E.
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重印与许可
