方法文章

3D 染色细胞的包覆和超弹性蛋白样凝胶的制备

DOI：

10.3791/57739

⸱

2018年5月19日

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Stanford University, 2Department of Materials Science and Engineering, Stanford University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

重组蛋白工程水凝胶有利于3D 细胞培养, 因为它们允许完整的调谐的聚合物骨干, 因此, 细胞微环境。在这里, 我们描述了重组弹力蛋白样蛋白质纯化的过程及其在3D 水凝胶细胞封装中的应用。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

二维 (2D) 组织培养技术对于我们理解基本细胞生物学是必不可少的。然而, 传统的2D 组织培养系统缺乏三维 (3D) 矩阵, 导致在收集的体外和体内中的结果之间存在显著的脱节。为了解决这一限制, 研究人员设计了3D 水凝胶组织培养平台, 可以模拟体内细胞微环境的生物化学和生物物理特性。这项研究促使需要开发支持3D 细胞封装和下游生化检测的材料平台。重组蛋白工程为3D 水凝胶材料的设计和开发提供了独特的工具集, 允许对蛋白质序列进行特定的控制, 因此, 通过推广, 其潜在的机械和生化性质的结果矩阵。在这里, 我们提出了一个协议, 以表达 recombinantly 衍生弹性体样蛋白 (ELP), 它可以用来形成水凝胶具有独立可调谐的机械性能和细胞粘附物的浓度。我们进一步提出了 ELP 水凝胶内的细胞封装方法, 以及随后的嵌入细胞的免疫荧光染色, 用于下游分析和定量。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在过去的一个世纪中, 二维 (2D) 组织培养已发展成为一个完整的工具集, 研究基本细胞生物学在体外。此外, 相对低成本和简单的2D 细胞培养协议导致了它在许多生物和医学学科的应用。然而, 过去的研究表明, 传统的2D 平台可能导致结果与收集的在体内明显偏离, 导致宝贵的时间和资金浪费为临床研究1,2, 3。我们和其他人推测, 这种差异可能是由于缺乏对2D 表面培养的细胞所提供的本土生物化学和生物物理线索, 这可能是对各种细胞类型的最佳增殖和成熟所必需的。

为了解决这些限制并帮助弥合 2D体外和体内研究之间的差距, 研究人员开发了三维 (3D) 水凝胶平台, 用于细胞封装14,5 ,6。水凝胶是一种理想的材料, 用于重述细胞外基质 (ECM)在体内的内源性微环境, 因为它们的组织样的机械特性和水肿胀结构, 使养分迅速运输和信号因子

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ELP 表达式协议

  1. 1天: 成长的起始群体
    1. 用热处理25克 Luria 汤和15克琼脂每1升的超纯水制备氨苄西林和氯霉素琼脂板。一旦溶液冷却到摄氏60摄氏度, 加入1毫升氨苄西林 (100 毫克/毫升在超纯水) 和1毫升氯霉素库存 (34 毫克/毫升70% 乙醇) 至1升琼脂溶液的最终浓度100µg/毫升和34µg/毫升分别。用血清学吸管将20毫升最终溶液转移到10厘米培养皿中, 使琼脂凝固。包装培养皿与 parafilm, 并存储在4摄氏度。
      注: 培养皿可储存在4摄氏度, 长达两周。
    2. 从预先制作的细菌库存中条纹 BL21 (DE3) pLysS大肠杆菌的一个小样本, 其中含有 pET15b 的向量, 编码氨苄西林和氯霉素琼脂板上的 ELP。
      注: 氨苄西林和氯霉素分别选择含有 pET15b 和 pLysS 载体的细菌。
    3. 将条纹板倒在孵化器37摄氏度。让细菌菌落在一夜之间生长。
      注: 不要孵育超过16小时的板材, 因为氨苄西林会降解, 不携带氨苄西林抵抗的菌落可以形成。
  2. 2天: 起始文化和表达媒介的准备
    1. 从孵化器中移除大肠杆菌区域性。Parafilm 在4摄氏度的情况下, 在4天的时间内储存。
    2. 准备一个起始培养瓶 (250 毫升) 和表....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

此协议中使用的 ELPs 包括五区域: T7 标记、His6 标记、肠激酶 (克朗) 解切站点、生物活动区域和弹性蛋白样区域 (图1)。T7 和 His6 标签允许通过标准的西方印迹技术容易识别。如果需要的话, 引入克朗解理的地方允许酶去除标记区域。生物活性区域编码的扩展, 纤维连接蛋白衍生细胞胶粘剂 (' RGDS ') 或非胶粘剂 (' RDGS ') 序列。最后, 类似弹性蛋白的区域的中心重复包含了一个赖氨酸组在访客残渣站点, 使交联通过 THPC, 而侧翼重复含有异亮氨酸达到 LCST 32 °c31。

Post 表达式、SDS 页或西方印迹可用于可视化分子量并确认含有抗体标记的 ELPs 的标识, 如 T7 (MASMTGGQQMG) 或 His6 (HHHHHH) (图 2).......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

重组蛋白的表达和纯化是制备高重现性生物材料的有力工具。由于商业化分子克隆的出现, 自定义的重组质粒可以从几个供应商购买, 这大大减少了使用 ELPs 等材料的时间。同样, 当原始的工作得到联邦合同的支持, 未来的工作将用于非营利用途时, 可以直接从原始实验室请求质粒。以前已为几个 ELP 变体31发布了完整的 ELP 氨基酸序列。然而, 从表达到最终纯化重组蛋白的过程涉及一些关键步骤, 通常可以导致产量下降或质量较低的产品。ELP 制剂的一些最常见的问题有以下几种: (1) 储存的细菌种群的质量, (2) 第一次冻融循环破坏细菌膜, (3) 通过热循环进行蛋白质纯化。

蛋白质表达与其他非生物生产方法的主要区别在于, 我们正在利用重组宿主的生物机械来合成聚合物。随后, 这种技术具有独特的局限性: 细胞死亡或损伤。细胞死亡最常见的表现是在裸板或异常小的菌落生长相对缓慢后, 细菌菌落数量减少。细菌类股如果保持谨慎, 可维持多年稳定;然而, 由于反复使用或冷冻衰竭而连续的冻融循环可以降低细胞的生存能力或导致 DNA 损伤。典型的 BL21 细.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢 t. 帕尔默和 h. (斯坦福神经外科) 提供小鼠 npc. 矢量艺术在图 4被使用了和适应了从施维雅医学艺术在创造性的共同性归属 3.0 Unported 执照 (https://creativecommons.org/许可证/3.0/legalcode)。这项工作的一部分是在斯坦福纳米共享设施 (SNSF), 在国家科学基金会的支持下, ECCS-1542152 奖。N.A.S. 承认国立卫生研究院 (32GM008412) 国立医学科学院的支持。C.M.M. 承认 NIH NRSA 博士研究生奖学金 (F31 EB020502) 和 Siebel 学者计划的支持。S.C.H. 承认国家卫生研究院 (U19 AI116484 和 R21 EB018407)、国家科学基金会 (DMR 1508006) 和加利福尼亚再生医学研究所 (RT3-07948) 提供的支持。这项研究获得了再生康复研究 & 培训联盟 (AR3T) 的资助, 该协会得到了尤尼斯肯尼迪发育研究院国家儿童健康和人类发展研究所 (国家研究所) 的支持。神经系统疾病和中风 (NINDS), 和国家生物医学成像和生物工程研究所 (NIBIB) 的国家卫生研究院的奖励号 P2CHD086843。内容完全是作者的责任, 不一定代表国家卫生研究院的意见。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
弹性蛋白样蛋白表达和纯化
10 cm 培养皿Thermo Fisher ScientificFB0875713
70% 乙醇RICCA 化学2546.70-1
硫酸铵Sigma-AldrichA3920-500G
氨苄青霉素Thermo Fisher ScientificBP1760-25G
Bacto 琼脂Thermo Fisher Scientific9002-18-0 
BL21（DE3）pLysS 感受态细胞InvitrogenC606003
氯霉素Amresco0230-100G 
来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶I Sigma-AldrichDN25
EDTA 二钠盐，二水合Thermo Fisher ScientificO2793-500
甘油Thermo Fisher ScientificBP229-4
异丙醇Thermo Fisher ScientificA451-4
异丙基&β;-D-1-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG） Thermo Fisher ScientificBP1755-10G
Luria 肉汤EMD Millipore1.10285.5007
石蜡膜VWR52858-000
苯基甲磺酰氟 （PMSF）MP 生物医学195381
氯化钠Thermo Fisher ScientificBP358-212
氢氧化钠Sigma-AldrichS 8045-1KG
针头过滤器装置 （0.22 &μ;m）MilliporeSLGP033RB
极好的肉汤Millipore71754-4
Tris BaseThermo Fisher ScientificBP152-1
Cell 封装在 3D ELP 水凝胶中
0.22 μm 针式过滤器MilliporeSLGV004SL
0.5 mm 厚的硅胶片电子显微镜科学70338-05
24 孔组织培养板 康宁353047
一次性穿刺活检打孔器 （2 mm）Integra Miltex33-31
一次性穿刺针 （4 mm）Integra Miltex33-34
一次性穿刺针 （5 mm）Integra Miltex33-35
Dulbecco'磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 康宁21-031-CM
No. 1 12 mm 玻璃盖玻片Thermo Fisher Scientific12-545-80
四羟甲基氯化膦 （THPC）Sigma-Aldrich404861-100ML
0.5% Tryspin/EDTAThermo Fisher 15400054
<强>3D ELP水凝胶中细胞的免疫细胞化学
16% （w/v） 多聚甲醛（PFA）电子显微镜科学15701
牛血清白蛋白 （BSA）罗氏3116956001
DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）分子探针D1306 
驴血清Lampire Biological Labs7332100
山羊抗小鼠二抗 （AF488）Molecular ProbesA-11017
山羊抗兔二抗 （AF546）Molecular ProbesA-11071
山羊血清Gibco16210-072
小鼠巢蛋白一抗BD Pharmingen556309
小鼠 Sox2 一抗细胞信号传输技术23064S
指甲油电子显微镜科学72180
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Vectashield 硬质封固剂 Vector LabsH-1400 
试剂 物

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  2. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-d....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

Elastin like ProteinHydrogel FormationCell EncapsulationImmunofluorescent StainingProtein PurificationConfocal MicroscopySDS PAGE AnalysisWestern BlotNeural Progenitor CellsExtracellular Matrix

相关文章