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用于细胞三维包封与免疫染色的弹性蛋白样蛋白水凝胶的制备

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DOI：

10.3791/57739

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2018年5月19日

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Stanford University, 2Department of Materials Science and Engineering, Stanford University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

重组蛋白工程水凝胶因其可完全调控聚合物主链，从而调控细胞微环境，故在三维细胞培养中具有显著优势。本文描述了重组弹性蛋白样蛋白的纯化过程及其在三维水凝胶细胞包封中的应用。

摘要

二维（2D）组织培养技术对我们理解基础细胞生物学至关重要。然而，传统的二维组织培养系统缺乏三维（3D）基质，导致所获得的结果与实际情况存在显著脱节 体外 和 体内为了解决这一局限性，研究人员开发了三维水凝胶组织培养平台，可模拟细胞外基质的生化与生物物理特性 在体内 细胞微环境。该研究推动了支持三维细胞包封及下游生化检测的材料平台的开发需求。重组蛋白工程技术为三维水凝胶材料的设计与开发提供了独特的工具集，通过精确控制蛋白质序列，进而调控所得基质的潜在力学性能和生化特性。本文介绍了一种重组弹性蛋白样蛋白（ELP）的表达方案，该蛋白可用于形成力学性能和细胞黏附配体浓度均可独立调控的水凝胶。此外，我们还提供了一种在ELP水凝胶中进行细胞包封的方法，以及对包埋细胞进行后续免疫荧光染色，以用于下游分析与定量。

引言

在过去的一个世纪中，二维（2D）组织培养已发展成为研究基础细胞生物学的重要工具。 体外此外，二维细胞培养相对低成本且操作简便的实验方案已使其被广泛应用于众多生物学和医学领域。然而，以往研究表明，传统的二维培养平台所得结果可能与实际生理条件下获得的结果存在显著偏差 体内，导致临床导向研究的宝贵时间和资金被浪费1,2,3我们及其他研究者推测，这种差异可能源于在二维表面培养细胞时，细胞无法获得必要的天然生化和生物物理信号，而这些信号对于多种细胞类型的理想增殖和成熟可能是必需的。

为了解决这些局限性并弥补二维与三维之间的差距 体外 和 体内 研究中，研究人员已开发出用于细胞包封的三维（3D）水凝胶平台1,4,5,6水凝胶是重现细胞外基质（ECM）内源性微环境的理想材料 体内 由于其类似组织的力学性能，以及能够快速传输营养物质和信号因子的水凝胶结构7,8此外，可设计三维水凝胶以独立调控支架的力学性能和生化特性。基质力学9,10,11,12 以及细胞黏附配体13,14,15 众所周知会影响细胞行为 体外 和 体内 因此，具有可调控特性的三维水凝胶为研究细胞与其微环境之间的因果关系提供了平台。理想的三维水凝胶基质应满足以下标准：能够简单、无细胞毒性地包封细胞，并可独立调节生理相关的力学性能以及模拟天然细胞黏附基序。

合成的（例如聚乙二醇、聚乳酸、聚（乙醇酸））以及天然来源的（例如．、海藻酸盐、胶原蛋白、Matrigel）水凝胶相较于二维 体外 培养平台；然而，它们也存在显著的缺陷，限制了其适用性。首先，许多合成及天然来源的平台需要使用强烈的交联条件，这些条件可能对哺乳动物细胞具有潜在毒性，从而导致细胞活力下降7此外，许多合成材料本身缺乏生物活性，需要通过二次化学反应进行功能化修饰，这会增加成本和操作复杂性16最后，尽管天然来源的材料通常含有内在的生物活性结构域，但往往存在批次间变异度高，且通常仅能形成相对较弱的凝胶。7,17.

重组蛋白工程为材料设计提供了一套独特的工具，通过精确控制蛋白序列，进而调控最终水凝胶支架潜在的力学和生化特性18。此外，利用人们熟知的Escherichia coli（E. coli）生物表达系统来生产蛋白，可实现材料的低成本、高一致性制备，并显著减少批间和批内差异。本文所介绍的弹性蛋白样蛋白（ELP）包含三个经过工程化设计的功能域：（1）T7和His6标签，可用于荧光标记抗体进行标记；（2）“弹性蛋白样”区域，赋予材料弹性力学性能，并可实现化学交联；（3）“生物活性”区域，编码细胞黏附基序。

我们的弹性蛋白样区域基于经典的（Val-Pro-Gly-Xaa-Gly）5弹性蛋白序列，其中四个“Xaa”氨基酸位点为异亮氨酸（Ile），但也可设计为除脯氨酸以外的任何氨基酸。该序列赋予重组ELP下临界溶液温度（LCST）特性，可通过热循环实现表达后简单纯化19,20。通过修饰“Xaa”位点的客体残基，可调节该LCST特性，使其在不同温度下发生热聚集21,22。

在此，五个弹性蛋白样重复序列之一的“Xaa”位置被替换为带有氨基的赖氨酸（Lys）氨基酸，用于水凝胶的交联。我们先前的研究表明，通过与氨基反应性交联剂四（羟甲基）磷鎓氯化物（THPC）反应，可实现无细胞毒性且稳定的交联23。通过调节整体蛋白含量和交联剂浓度，我们能够制备出刚度范围在生理相关区间（约0.5–50 kPa）内可调的水凝胶9,23,24。除了调控机械性能外，细胞在水凝胶内的黏附是通过在ELP蛋白主链中整合经典的细胞黏附结构域实现的。例如，引入源自纤连蛋白的扩展氨基酸序列“RGDS”可促进细胞黏附并提供构象灵活性，而其打乱顺序且无结合能力的“RDGS”变体则限制细胞-基质黏附24。通过调节细胞黏附性蛋白与非黏附性蛋白的比例以及总蛋白浓度，我们能够有效制备出配体浓度范围广泛的水凝胶。因此，我们开发出一种生化性质与生物物理性质可解耦的水凝胶平台，其各项参数可独立调节，以优化多种细胞类型的三维培养条件。

除了基质刚度和黏附配体的可调控性外，重组水凝胶还能够设计特定的材料降解特性，这对于细胞在三维环境中的铺展、增殖和迁移至关重要4,9。这种降解特性依赖于细胞分泌的蛋白酶，这些蛋白酶可特异性地靶向“RGDS”序列9或类弹性蛋白序列25。研究表明，ELP水凝胶还支持后续研究细胞活力和功能所必需的多种生化检测，包括免疫细胞化学染色，以及用于定量逆转录-聚合酶链式反应（qRT-PCR）和Western blot的DNA/RNA/蛋白质提取9。此外，ELP的多种变体已在多种in vivo模型中得到应用，并被证实对免疫系统具有良好的耐受性26。

综上所述，与合成材料或天然来源材料平台相比，ELP 作为一种用于细胞包封研究的材料平台具有多种优势，后两类材料平台通常缺乏同等程度的生化与生物物理可调性及可重复性。此外，ELP 在多种细胞类型中均表现出简单且无细胞毒性的特点（例如，鸡背根神经节14,24、小鼠神经前体细胞9、人骨髓间充质干细胞27、新生牛软骨细胞28、人内皮细胞29,30），相较于二维细胞培养，能够构建更接近生理状态的内源性三维细胞外基质模型。本文中，我们提供了一种用于表达重组来源 ELP 的实验方案，以将其作为可调控的水凝胶平台用于三维细胞包封。我们还进一步介绍了对包封细胞进行下游荧光标记及共聚焦显微镜观察的方法学。

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方案

1. ELP 表达方案

  1. 第1天：培养起始菌落
    1. 通过高压灭菌1 L超纯水中含25 g LB培养基和15 g琼脂的溶液来制备氨苄青霉素和氯霉素琼脂平板。当溶液冷却至约60 °C时，向每1 L琼脂溶液中加入1 mL氨苄青霉素储备液（100 mg/mL溶于超纯水）和1 mL氯霉素储备液（34 mg/mL溶于70%乙醇），使终浓度分别为100 µg/mL和34 µg/mL。用移液管将20 mL最终溶液转移至10 cm培养皿中，静置使琼脂凝固。用封口膜包裹培养皿，并于4 °C保存。
      注意：培养皿可在 4 °C 下保存长达两周。
    2. 划线接种少量 BL21(DE3)pLysS 样品 E. coli 从含有编码目标ELP的pET15b质粒的预存菌种中，在添加氨苄青霉素和氯霉素的琼脂平板上划线培养。
      注意：氨苄青霉素和氯霉素分别用于筛选含有 pET15b 和 pLysS 载体的细菌。
    3. 将划线平板倒置放入37 °C培养箱中，过夜培养细菌菌落。
      注意：培养时间不要超过16小时，否则氨苄青霉素会降解，导致不携带氨苄青霉素抗性基因的菌落生长。
  2. 第2天：启动培养物和表达培养基的制备
    1. 移除 E. coli 从培养箱中取出培养物。用封口膜封住培养板，于4 °C保存，最多可保存4天。
    2. 准备一个种子培养瓶（250 mL）和表达培养瓶（12个1 L），并进行高压灭菌。在2 L带挡板的培养瓶中，向1 L超纯水中加入47.6 g terrific broth和4 mL甘油，配制成1 L表达培养基，用铝箔封口。
      注：典型的产量为每升表达培养基可获得60-100 mg蛋白质。
    3. 将灭菌后的起始培养物放入预热至37 °C的摇床培养箱中，静置培养，不进行振荡。
    4. 向起始培养物中加入250 µL经无菌过滤（0.22 µm滤器）的氨苄青霉素储备液（100 mg/mL，溶于超纯水），使终浓度为100 µg/mL。立即以250 rpm开始振荡培养起始培养物。
      注意：氯霉素仅用于琼脂平板上的菌落筛选，液体培养中不添加。
    5. 接种含有单个ELP质粒的起始菌种 E. coli 从划线平板上挑取单菌落，接种于培养液中，37 °C 摇床培养 16 h。
    6. 将表达培养基的培养瓶放入预热至37 °C的摇床培养箱中，静置过夜培养，次日早晨即可用于接种。
  3. 第3天：诱导蛋白表达 E. coli
    1. 制备新鲜的氨苄青霉素储备液（100 mg/mL，溶于超纯水），经无菌过滤。向每瓶表达培养基中加入1 mL氨苄青霉素储备液，终浓度为100 µg/mL。
    2. 以250 rpm的速度开始振荡培养表达培养基。
    3. 从任意表达烧瓶中取 2 mL 培养基样品，加入比色皿中，作为在 600 nm 处测定光密度（OD600）的空白对照600).
    4. 在16小时的种子培养物培养结束后，使用血清移液管将20 mL种子培养物转移至每个表达培养瓶中，以接种各表达培养瓶。
    5. 完成1小时振荡后，测定OD值600 其中一个表达培养瓶。完成此步骤后，测定OD600 每20分钟检查一次，每次检查不同的烧瓶。
    6. 在 OD600 当OD值达到0.6时，将装有表达培养瓶的摇床温度降至32 °C。
    7. 检测 OD600 每10分钟。在OD600 当OD600达到0.8时，向每瓶表达培养基中加入1 mL用超纯水配制并经无菌过滤的1 M β-异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），以诱导表达。
    8. 静置 E. coli 在表达瓶中表达7小时。
    9. 表达结束前20分钟，将一台大型落地式离心机预冷至4 °C。
    10. 将全部12 L表达培养基收集至各自的离心容器中并平衡。
    11. 离心表达培养基 >使用台式离心机在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。
    12. 倒掉每个离心容器中的上清液。使用刮勺将细胞沉淀收集到预先称重的自封袋中。
    13. 将沉淀重悬于无菌过滤的TEN缓冲液中（每25 g沉淀使用100 mL缓冲液），并通过轻轻揉搓沉淀去除多余的气泡。配制1 L TEN缓冲液时，将5.8 g氯化钠、1.21 g三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）和0.37 g乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）加入900 mL超纯水中，调节pH至8.0，定容至1 L。此步骤中使用pH试纸即可。
    14. 将含有重悬细胞沉淀的自封袋放入次级容器中，并于 -80 °C 冻存过夜。
  4. 第4–6天：通过冻融循环裂解细菌细胞壁
    1. 从冰箱中取出冷冻的沉淀物，在4 °C下用摇床轻轻振荡，使其缓慢融化。
    2. 让沉淀物解冻至出现部分液体。向解冻的裂解液中加入约30–40 mg脱氧核糖核酸酶I（DNase）。此外，每100 mL细胞裂解液中加入1 mL异丙醇中含100 mM苯甲基磺酰氟（PMSF；一种蛋白酶抑制剂）。将裂解液振荡过夜。
      注意：仅在第一次冻融循环时需要添加DNase和PMSF。
      警告：PMSF 粉末若被吸入具有毒性，操作时应佩戴口罩。
    3. 细胞裂解液完全解冻后，将其在 -80 °C 冻结过夜，或直至完全冻结。
    4. 重复冻融步骤，共进行三个循环。最后一次冻融后，将裂解液在 4 °C 下保持解冻状态。纯化过程结束时，保留 100 µL 原始裂解液用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。
    5. 最后一次解冻后，使用 1 M NaOH 将解冻裂解液的 pH 调至 9.0。此步骤可使用 pH 试纸进行测定。在 4 °C 下于旋转摇床上孵育至少 1 小时（过夜孵育亦可）。
  5. 第7至9天：通过冷热旋转热循环纯化ELP
    1. 在离心前20分钟将落地式离心机冷却至4 °C。
    2. 将解冻的裂解液分装并平衡至离心容器中。
    3. 将样品离心 >15,000 × g，4 °C 离心 1 小时。纯化完成后，保留 100 µL 上清液用于 SDS-PAGE 分析。
      注意：离心后，由于ELP蛋白在低于其LCST的温度下具有高水溶性，应保留在上清液中<32 °C
    4. 将上清液转移至新的离心管中，并适当平衡。
    5. 将氯化钠（NaCl）分三批加入，直至终浓度为 1 M（每 100 mL 上清液加入 5.84 g NaCl）。确保分三批加入 NaCl，以保证充分溶解。
    6. 在37 °C、250 rpm条件下，于摇床培养箱中振荡3小时。
    7. 在振荡结束前1小时，将落地式离心机预热至37°C。
    8. 离心处理 >15,000 × g，37 °C 离心 1 小时。纯化完成后，保留 100 µL 上清液用于 SDS-PAGE 分析，弃去其余上清液。
      注意：离心后，由于ELP蛋白在高于其低临界溶解温度（LCST）时在水中的溶解度较低，应形成沉淀。>32 °C
    9. 将沉淀物按每1 g加入10 mL经高压灭菌的超纯水重新悬浮。使用金属刮勺研磨沉淀物，以促进蛋白质溶解。
    10. 使用 1 M NaOH 将解冻的裂解液 pH 值调节至 9.0。此步骤中，pH 试纸已足够使用。
    11. 在4 °C下于摇床中振荡过夜。
    12. 重复冷热旋转热循环步骤，共进行三个循环（即，重复步骤 1.5.1 至 1.5.11，共进行三个循环。
  6. 第10-15天：ELP透析与冻干
    1. 将重悬的沉淀物在预冷的离心机中离心 >4 °C、15,000 × g 离心 1 小时。纯化完成后，保留 100 µL 上清液用于 SDS-PAGE 分析。
    2. 使用3.5 kDa透析膜在4 °C条件下，将剩余上清液置于4 L预冷的超纯水中透析以脱盐。每天更换透析液两次，持续3天，共更换6次。
      注意：上清液的典型体积在 5 至 30 mL 之间。
    3. 将透析后的溶液在预冷的离心机中离心 >4 °C 条件下，15,000 × g 离心 1 小时。纯化过程结束时，保留 100 µL 上清液用于 SDS-PAGE 分析。
    4. 将所得上清液分装至预称重的锥形管中，于 -80 °C 冻存。
    5. 将冷冻溶液冻干3天，称量最终产物以确定蛋白得率。
    6. 用Parafilm密封含有最终冻干ELP产物的管子，并于4 °C保存。
    7. 通过SDS-PAGE检测蛋白质纯度。
      注意：SDS-PAGE 的实验方案将根据具体的琼脂糖凝胶条件而有所不同。在我们的实验中，最终冻干的蛋白质用去离子水溶解至浓度为 0.5 mg/mL，并在变性条件下于 12%（w/v）丙烯酰胺凝胶中以 140 V 电泳 70–100 分钟。

2. 三维弹性蛋白样蛋白水凝胶中的细胞包封

  1. 硅胶模具的制备
    1. 使用所需直径的穿刺活检打孔器在厚度为 0.5 mm 的硅胶片上打孔，并在每个孔周围剪出方形区域。根据所需模具数量重复操作。
      注意：模具的直径和厚度可根据具体应用和细胞培养条件进行调整。实践中，对于浓度为 50 × 106 个细胞/mL 的细胞培养，建议分别使用直径为 4 mm 和 5 mm、厚度为 0.5 mm 的模具，以充分提取 DNA/RNA 和蛋白质。对于免疫染色，可使用直径为 2 mm 的穿刺活检打孔器，在每个方形模具上制作三个相邻的孔，以便每个孔中可进行三个重复染色。
    2. 用镊子去除单个模具两侧的塑料保护膜。
      注意：避免接触暴露的硅胶表面，以免污染，从而降低后续等离子体键合效率。
    3. 使用镊子将相同数量的裸硅胶模具和玻璃盖玻片（No. 1，直径 12 mm）交替排列在 48 孔板的倒置盖子上。完成后，盖上 48 孔板盖子以防止污染。
    4. 对整个 48 孔板盖子（即，模具和玻璃载片）进行氧气等离子体处理。处理后立即用镊子将硅胶模具翻转并贴合到相邻的玻璃盖玻片上。用力按压模具以确保键合牢固。让模具在室温下孵育 1 小时。
      注意：氧气等离子体处理时间因所用仪器而异。本实验所用仪器的典型条件为：工作气压范围 0.3–4 mbar，氧气流速 20 cm3/min，样品暴露于等离子体 10–20 秒。
    5. 通过高压灭菌对模具进行灭菌。将模具储存在室温下的无菌环境中，直至使用。
      注意：此阶段的模具可长期储存。
  2. 弹性蛋白样蛋白储备液的制备
    1. 从 4 °C 储存条件下取出冻干的 ELP。在打开管盖前将蛋白升温至室温，以确保在多次使用过程中蛋白表面不会产生冷凝水。
    2. 在 4 °C 条件下，将 ELP 溶解于杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中，并持续搅拌（即，旋转）过夜。
      注意：ELP 储备液的浓度将在加入交联剂溶液后按用户定义的体积比进一步稀释。例如，若最终 ELP 浓度为 3%（w/v），则应配制浓度为 3.75%（w/v）的 ELP 储备液，随后以 4:1 的体积比（ELP 溶液 : 交联剂溶液）进行稀释。根据具体应用需求调整浓度。
    3. 使用 0.22 µm 注射式滤器对 ELP 储备液进行无菌过滤。不使用时应将 ELP 置于冰上保存。
  3. 在生物安全柜中，使用无菌镊子将灭菌后的模具转移至 24 孔组织培养板中。
  4. THPC 储备液的制备
    1. 在使用前，将 THPC 用 DPBS 稀释。根据最终 ELP 浓度和所需的交联比例调整 THPC 溶液的浓度。
      注意：在本方案中，最终 ELP 浓度为 3%（w/v），通过以 4:1 的体积比混合 ELP 储备液与 THPC 溶液实现。可根据需要进行调整。
    2. 将 2.6 µL THPC 溶液（80% 水溶液）加入 997.4 µL DPBS 中。
      注意：该 THPC 浓度对应于在所述 4:1 体积比混合条件下，THPC 上的羟甲基与 ELP 蛋白上的伯胺之间达到 1:1 的化学计量比，最终形成 3%（w/v）ELP 水凝胶。THPC 溶液黏稠，液滴可能附着在移液枪头壁上。为确保浓度准确，在稀释至 DPBS 时应避免此类液滴残留。向 THPC 储存容器中通入氮气以防止膦基氧化及交联剂失活。
    3. 涡旋混合溶液，并置于冰上保存。
    4. 使用 0.22 µm 注射式滤器对 THPC 储备液进行无菌过滤。再用无菌 DPBS 进一步稀释 THPC 储备液，以获得较低的化学计量交联比（例如，0.5:1 或 0.75:1）。
      注意：THPC 对氧气敏感，稀释后的溶液应在配制后数小时内使用完毕。
  5. 用胰蛋白酶-EDTA 处理细胞，使其解离为单细胞悬液，离心收集细胞，并用血细胞计数板对悬浮于培养基中的细胞进行计数。
    注意：此步骤的具体操作方案将高度依赖于目标细胞类型和应用。在本方案中使用的神经前体细胞，采用 0.025% 胰蛋白酶-EDTA 在室温下孵育 1.5 分钟。细胞在 200 × g 条件下离心 2 分钟。为提高细胞存活率，细胞应悬浮于常规培养基中。用于细胞包封的典型细胞密度范围为每毫升最终水凝胶体积含 1–50 × 106 个细胞。可根据需要调整。
  6. 将所需数量的细胞分装至无菌的 1.5 mL 离心管中。
  7. 在约 200 × g 条件下离心 3 分钟。小心吸除上清液，并将细胞沉淀置于冰上保存。
    注意：必须彻底吸除所有上清液，以避免 ELP 和 THPC 交联剂的进一步稀释。具体离心速度将因细胞类型而异。
  8. 将细胞沉淀重悬于 ELP 储备液中，使其体积占最终体积的 80%（假设 ELP 溶液 : THPC 溶液的体积比为 4:1）。吹打混合 20–25 次，使细胞与 ELP 均匀混合。
    注意：避免用手握住离心管底部，以防温度升高导致 ELP 发生相变。每个含三个重复孔的 2 mm 模具需要 7.5 µL 的最终体积（即，6 µL ELP 储备液和 1.5 µL THPC 储备液），平均分配至三个孔中（即，每孔 2.5 µL 最终体积）。对于 4 mm 和 5 mm 模具，分别需要 7.5 µL 和 15.5 µL 的最终体积。
  9. 向细胞/ELP 悬液中加入 THPC 储备液，补足剩余 20% 的最终体积。吹打混合 20–25 次，使混合均匀。
  10. 立即以环形方式将相应最终体积的细胞/ELP/THPC 混合液加入各模具中。对所有模具重复此操作。
  11. 将样品在室温下孵育 15 分钟，随后在 37 °C 下继续孵育 15 分钟。
    注意：第一阶段的孵育有助于在升高温度至 ELP 的低临界溶解温度（LCST）以上并引发其热致相分离之前，促进水凝胶的初步交联。
  12. 缓慢向 24 孔板的每孔中加入 750 µL 预热的细胞培养基，注意避免破坏凝胶。
  13. 将水凝胶在 37 °C 下孵育 7 天。
    注意：建议根据细胞类型每 1–2 天更换一次完全培养基。为减少对凝胶的扰动，吸除培养基时应使用连接 200 µL 移液枪头的玻璃巴斯德吸管。

3. 三维ELP水凝胶中细胞的免疫细胞化学

  1. 将10 mL 16%（w/v）多聚甲醛（PFA）与30 mL DPBS混合，配制固定液。将溶液预热至37 °C。
  2. 吸除24孔板中的培养基，用1 mL DPBS轻轻洗涤。
  3. 向每个孔中加入 750 µL 固定液，在 37 °C 下孵育 30 分钟。请勿使用组织培养箱，以避免 PFA 蒸气污染其他培养物。
  4. 小心吸取每个孔中的固定液，并将PFA弃置到适当的危险废物容器中。
    警告：接触PFA可能引起皮肤和眼睛刺激。请佩戴手套和护目镜，并在化学通风橱中操作。
  5. 向每个样本中加入 1 mL DPBS。立即吸除 DPBS 并弃入含 PFA 的废液容器中。
  6. 用1 mL DPBS将样品洗涤两次，每次10分钟。
    注意：样品在用封口膜密封后，可在4 °C的DPBS中保存长达一周时间。
  7. 每个样本加入750 µL通透化溶液（100 mL DPBS加0.25 mL Triton X-100；PBST），在室温下以15 rpm转速于摇床上孵育1小时。
  8. 吸去 PBST，向每个样品中加入 750 µL 封闭液（95 mL PBS，5 g 牛血清白蛋白（BSA），5 mL 血清，0.5 mL Triton X-100），在室温下以 15 rpm 振荡孵育 3 小时。
    注意：封闭液应包含用于制备二抗的宿主物种的血清（例如．、山羊、驴）并经0.22 µm滤膜过滤除菌后使用。
  9. 配制抗体稀释液（97 mL DPBS、2.5 g BSA、2.5 mL 血清（来源与步骤 3.8 中相同宿主物种）和 0.5 mL Triton X-100）。用抗体稀释液稀释一抗，并向每个样本加入 500 µL 稀释液。用 Parafilm 封膜，于 4 °C 摇床上孵育过夜。
    注意：Nestin 和 Sox2 一抗从厂家原始浓度用抗体稀释液按 1:400 比例稀释。
  10. 吸弃每个样本中的抗体溶液，将样本在室温下置于摇床上以15 rpm的速度用PBST洗涤60分钟。重复洗涤步骤3次。
  11. 使用抗体稀释液稀释二抗和5 mg/mL储备液DAPI（1:2,000），每种样品加入500 µL稀释液。用铝箔包裹24孔板，于4 °C在摇床中孵育过夜。
    注意：由于二抗对光敏感，后续所有步骤中均需避免样品暴露于光线下以防止荧光淬灭。羊抗小鼠和羊抗兔二抗使用厂家原液浓度，按1:500比例用抗体稀释液稀释。
  12. 吸弃每个样本中的抗体溶液，将样本在室温下用PBST在摇床上孵育30分钟进行洗涤。重复洗涤步骤3次。
  13. 在载玻片表面滴加一滴硬封固封片介质。用镊子夹住模具边缘，在纸巾上轻轻蘸去多余溶液。将模具小心地倒置在封片介质上，避免产生气泡。
  14. 让封片剂在室温下硬化 48 小时。将样品存放在室温或 4 °C 环境中。成像前需确保封片剂完全固化 48 小时，因为封片剂的折射率在硬化过程中会发生变化。使用透明指甲油将样品密封至玻璃盖玻片，以减少污染或样品移位。
  15. 使用共聚焦显微镜对样品进行成像。

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结果

本方案中使用的弹性蛋白样多肽（ELP）包含五个区域：T7标签、His6标签、肠激酶（EK）切割位点、生物活性区域以及类弹性蛋白区域（图1）。T7标签和His6标签可通过标准的Western印迹技术进行便捷鉴定。引入EK切割位点可在需要时通过酶切去除标签区域。生物活性区域编码扩展的、来源于纤连蛋白的细胞黏附序列（“RGDS”）或非黏附序列（“RDGS”）。最后，类弹性蛋白区域的中心重复序列在客体残基位置含有一个赖氨酸基团，可通过四羟甲基磷onium氯化物（THPC）实现交联；而两侧的重复序列含有异亮氨酸，以获得约32 °C的低临界溶解温度（LCST）31。

表达后，可通过 SDS-PAGE 或 Western 印迹检测分子量，并确认含有抗体标签（如 T7（MASMTGGQQMG）或 His6（HHHHHH））的 ELP 的身份（

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讨论

重组蛋白的表达与纯化是合成具有高重复性生物材料的有力工具。由于商业化分子克隆技术的出现，研究人员可从多家供应商处购买定制的重组质粒，这显著缩短了使用如弹性蛋白样多肽（ELP）等材料所需的时间。类似地，当原始研究由联邦合同资助且后续研究用于非营利目的时，也可直接向原始实验室申请获取质粒。多种ELP变体的完整氨基酸序列此前已有发表31。然而，从蛋白表达到最终纯化的整个过程包含多个关键步骤，常见问题可能导致产量降低或产品质量下降。ELP制备中最常见的问题通常出现在以下环节之一：（1）保存的菌种质量；（2）用于破坏细菌膜的首次冻融循环；（3）通过热循环进行的蛋白纯化。

蛋白质表达与其他非生物材料生产方法之间的一个主要区别在于，我们利用重组宿主的生物系统来合成聚合物。因此，该技术存在一个独特的限制因素：细胞死亡或损伤。细胞死亡最常见的表现是在平板划线后细菌菌落数量减少，或出现异常微小且生长相对缓慢的菌落。如果妥善维护，细菌菌种可长期保持稳定达数年之久；然而，由于反复使用或冰箱故障导致的多次冻融循环，可能会降低细胞活力或引起DNA损伤。典型的BL...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢斯坦福大学神经外科的 T. Palmer 和 H. Babu 提供小鼠NPCs。文中的矢量图由 图4 由Servier Medical Art提供并改编自知识共享署名3.0未本地化许可协议（https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/legalcode）。本工作的部分研究在斯坦福纳米共享设施（SNSF）完成，该设施获得美国国家科学基金会资助（项目编号ECCS-1542152）。N.A.S. 感谢美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所的支持（32GM008412）。C.M.M. 感谢美国国立卫生研究院NRSA博士前奖学金（F31 EB020502）及Siebel学者计划的支持。S.C.H. 感谢美国国立卫生研究院（U19 AI116484 和 R21 EB018407）、美国国家科学基金会（DMR 1508006）以及加州再生医学研究所（RT3-07948）的支持。本研究获得再生康复研究联盟的资助 & 培训（AR3T），由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）下属的尤妮斯·肯尼迪·施莱佛国立儿童健康与人类发展研究所（Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NICHD）、国家神经疾病与中风研究所（National Institute of Neurological Disorders and Stroke, NINDS）以及国家生物医学成像与生物工程研究所（National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, NIBIB）根据资助编号P2CHD086843提供支持。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
弹性蛋白样蛋白的表达与纯化
10 cm 培养皿Thermo Fisher ScientificFB0875713
70% 乙醇RICCA Chemical2546.70-1
硫酸铵Sigma-AldrichA3920-500G
氨苄青霉素Thermo Fisher ScientificBP1760-25G
细菌琼脂Thermo Fisher Scientific9002-18-0 
BL21(DE3)pLysS 感受态细胞InvitrogenC606003
氯霉素Amresco0230-100G 
牛胰脱氧核糖核酸酶 ISigma-AldrichDN25
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物Thermo Fisher ScientificO2793-500
甘油Thermo Fisher ScientificBP229-4
异丙醇Thermo Fisher ScientificA451-4
异丙基 β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷 (IPTG) Thermo Fisher ScientificBP1755-10G
LB 培养基EMD Millipore1.10285.5007
封口膜VWR52858-000
苯甲基磺酰氟 (PMSF)MP Biomedicals195381
氯化钠Thermo Fisher ScientificBP358-212
氢氧化钠Sigma-AldrichS 8045-1KG
注射器滤器（0.22 μm）MilliporeSLGP033RB
TB 培养基Millipore71754-4
Tris 碱Thermo Fisher ScientificBP152-1
细胞在三维弹性蛋白样蛋白水凝胶中的包封
0.22 μm 注射器滤器MilliporeSLGV004SL
0.5 mm 厚硅胶片Electron Microscopy Science70338-05
24 孔组织培养板 Corning353047
一次性活检打孔器（2 mm）Integra Miltex33-31
一次性活检打孔器（4 mm）Integra Miltex33-34
一次性活检打孔器（5 mm）Integra Miltex33-35
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 (DPBS) Corning21-031-CM
直径 12 mm 的 1 号玻璃盖玻片Thermo Fisher Scientific12-545-80
四羟甲基磷鎓氯化物 (THPC)Sigma-Aldrich404861-100ML
0.5% 胰蛋白酶/EDTAThermo Fisher 15400054
三维弹性蛋白样蛋白水凝胶中细胞的免疫细胞化学染色
16% (w/v) 多聚甲醛 (PFA)Electron Microscopy Sciences15701
牛血清白蛋白 (BSA)Roche3116956001
DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐)Molecular ProbesD1306 
驴血清Lampire Biological Labs7332100
山羊抗小鼠二抗 (AF488)Molecular ProbesA-11017
山羊抗兔二抗 (AF546)Molecular ProbesA-11071
山羊血清Gibco16210-072
小鼠 Nestin 一抗BD Pharmingen556309
小鼠 Sox2 一抗Cell Signaling Technology23064S
指甲油Electron Microscopy Sciences72180
吐温 X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Vectashield 硬封片剂 Vector LabsH-1400 

参考文献

  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  2. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
  3. Gómez-Lechón, M. J., et al. Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix. Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  5. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  6. Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays. Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
  7. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  8. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  9. Madl, C. M., et al. Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling. Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).
  10. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  11. Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells. PLoS ONE. 7 (5), e37178(2012).
  12. Ehrbar, M., et al. Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling. Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).
  13. Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).
  14. Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth. Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).
  15. Kilian, K. A., Mrksich, M. Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface. Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).
  16. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).
  17. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  18. DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering. Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).
  19. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  20. Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues. Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).
  21. McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels. Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).
  22. McMillan, R. A., Conticello, V. P. Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor. Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).
  23. Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).
  24. Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth. Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).
  25. Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles. Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).
  26. Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).
  27. Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels. Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).
  28. Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration. Biomaterials. , 132-140 (2017).
  29. Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation. Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).
  30. Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides. Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).
  31. Straley, K. S., Heilshorn, S. C. Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering. Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).
  32. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  33. Graumann, K., Premstaller, A. Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems. Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).
  34. Tashiro, K., et al. A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).

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