方法文章

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建人类疟原虫P. falciparum的条件性突变体

DOI：

10.3791/57747

⸱

2018年9月18日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular Biology, University of Georgia, 2Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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我们描述了一种利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术在Plasmodium falciparum中构建基于glmS的条件性基因敲低突变体的方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

疟疾是全球发病和死亡的重要原因。这种疾病主要影响生活在热带和亚热带地区的人群，由疟原虫（Plasmodium）寄生虫感染引起。通过加深对这种复杂寄生虫生物学特性的理解，可以加速开发更有效的抗疟药物。对这些寄生虫进行遗传操作是理解其生物学特性的关键；然而，历史上对恶性疟原虫（P. falciparum）基因组的遗传操作一直较为困难。近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术已被应用于疟原虫，使得蛋白标记、条件性蛋白敲降以及基因删除等操作更加便捷。CRISPR/Cas9基因编辑已被证明是推动疟疾研究领域发展的一项强大工具。本文中，我们描述了一种在恶性疟原虫（P. falciparum）中利用CRISPR/Cas9技术构建基于glmS的条件性敲降突变体的方法。该方法具有高度可扩展性，可适用于其他类型的遗传操作，包括蛋白标记和基因敲除。

引言

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疟疾是一种由疟原虫属原虫寄生虫引起的严重疾病 疟原虫. P. falciparum，这种对人类最致命的疟原虫每年导致约44.5万人死亡，其中大多数为五岁以下儿童1. 疟原虫 寄生虫具有复杂的生活周期，涉及蚊子媒介和脊椎动物宿主。人类最初是因受感染的蚊子吸食血液而被感染。随后，寄生虫侵入肝脏，在其中生长、发育并分裂约一周时间。此过程结束后，寄生虫被释放入血液，在红细胞（RBCs）中进行无性繁殖。寄生虫在红细胞内的增殖直接导致与疟疾相关的临床症状2.

直到最近，转基因恶性疟原虫（P. falciparum）的制备仍是一个费力的过程，需要经过多轮药物筛选，耗时数月且失败率较高。这一耗时的流程依赖于在目标区域产生随机的DNA断裂，并利用寄生虫通过同源修复机制修复其基因组的内源能力3,4,5,6。最近，成簇规律间隔短回文重复序列/Cas9（CRISPR/Cas9）基因组编辑技术已成功应用于P. falciparum....

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方案

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持续培养P. falciparum需要使用人红细胞，我们使用的是从商业渠道购买的、已去除所有标识信息并匿名化的血液单位。乔治亚大学机构审查委员会及生物安全办公室已审核并批准了我们实验室所使用的所有实验方案。

1. 选择gRNA序列

  1. 前往 CHOPCHOP（http://chopchop.cbu.uib.no/），选择 “Fasta Target”。在 “Target” 下方，粘贴基因开放阅读框（ORF）3’端的 200 个碱基对以及该基因 3’非翻译区（3’-UTR）起始处的 200 个碱基对。在 “In” 下拉菜单中选择 “P. falciparum”（3D7 v3.0），并在 “Using” 下选择 “CRISPR/Cas9”，然后点击 “Find Target Sites”。
  2. 从提供的选项中选择一条 gRNA 序列，优先选择最靠近修饰位点、脱靶位点最少且效率最高的 gRNA。
    注意：潜在的 gRNA 序列之所以被识别，是因为它们位于原间隔序列邻近基序（Protospacer Adjacent Motif, PAM）的紧上游，而 PAM 是 Cas9 结合 DNA 所必需的。克隆到 pMK-U6 载体（驱动 gRNA 表达的载体）中的序列是 PAM 紧上游的 20 个碱基。....

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结果

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本方法所用质粒的示意图以及一个保护突变示例见图1。为举例说明如何在转染后鉴定突变寄生虫，图2展示了用于检测HA-glmS构建体整合情况的PCR结果。一个克隆板的代表性图像见图3，用以展示寄生虫存在时培养基的颜色变化。图4展示了免疫荧光实验和蛋白质印迹实验的结果，用以验证HA标签的功能性以及基于glmS的寄生虫蛋白水平降低效果。图5展示了PCR产物上较短的同源臂无法对寄生虫基因组进行修饰并获得可存活突变体的情况。

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讨论

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与以往的基因操作方法相比，CRISPR/Cas9 在 P. falciparum 中的应用显著提高了基因组编辑的效率，并缩短了所需时间。本综合实验方案详细阐述了利用 CRISPR/Cas9 在 P. falciparum 中构建条件性突变体的关键步骤。尽管本方法主要针对 HA-glmS 突变体的构建，但该策略可灵活适用于多种需求，包括基因标记、基因敲除以及点突变的引入。

本方案中的一个关键早期步骤是选择gRNA序列。在选择gRNA时，需考虑多个因素，例如gRNA的位置、其编辑效率以及是否存在脱靶效应的潜在风险。gRNA序列应尽可能靠近修饰位点，理想情况下应在200个碱基对以内。这可以降低寄生虫利用修复模板修复基因组而不整合标签的可能性。本研究中用于定位gRNA的工具是一种名为CHOPCHOP的免费在线服务22。另一种可用的在线工具是真核病原体CRISPR向导RNA/DNA设计工具（EuPaGDT；http://grna.ctegd.uga.edu/）

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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感谢佐治亚大学（UGA）生物医学显微成像中心的 Muthugapatti Kandasamy 提供的技术支持，以及 Jose-Juan Lopez-Rubio 分享 pUF1-Cas9 和 pL6 质粒。本研究得到了 ARCS 基金会授予 D.W.C. 和 H.M.K. 的奖项、UGA 启动资金、美国出生缺陷基金会（Basil O'Connor 新兴学者研究奖）授予 V.M. 的资助，以及美国国立卫生研究院（NIH）授予 V.M. 的基金（R00AI099156 和 R01AI130139）和授予 H.M.K. 的基金（T32AI060546）的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Gene Pulser Xcell 电穿孔仪Bio-Rad1652660
Gene Pulser Xcell 电穿孔仪Bio-Rad165-2086我们购买的是独立包装的产品
乙酸钠Sigma-AldrichS2889-250g
DSM1由 Akhil Vaidya 实验室赠送Ganesan 等 Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34
TPP 细胞培养 6 孔板MIDSCITP92006
TPP 100 mm 细胞培养皿（12 mL 板）MIDSCITP93100
TPP 细胞培养 96 孔板MIDSCITP92096
TPP 细胞培养 24 孔板MIDSCITP92024
NEBuffer 2New England Biolabs#B7002S
NEBuffer 2.1New England Biolabs#B7202S
BtgZINew England Biolabs#R0703L
SacIINew England Biolabs#R0157L
HindIII-HFNew England Biolabs#R3104S
Afe1New England Biolabs#R0652S
Nhe1-HFNew England Biolabs#R3131L
T4 DNA 聚合酶New England Biolabs#M0203S
500 mL Steritop 瓶顶过滤器装置MilliporeSCGPU10RE可根据需要选择任意尺寸
EGTASigmaE4378-100G
KClSigma-AldrichP9333-500g
CaCl2Sigma-AldrichC7902-500g
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100g
K2HPO4FisherP288-500
HEPESSigma-AldrichH4034-500g
pMK-U6由 Muralidharan 实验室构建n/a
pHA-glmS由 Muralidharan 实验室构建n/a
pUF1-Cas9由 Jose-Juan Lopez-Rubio 实验室赠送Ghorbal 等 Nature Biotech 2014
葡萄糖Sigma-AldrichG7021-1KG
碳酸氢钠Sigma-AldrichS5761-500G
丙酮酸钠Sigma-AldrichP5280-100G
次黄嘌呤Sigma-AldrichH9636-25g
庆大霉素试剂Gibco15710-064
胸苷Sigma-AldrichT1895-1G
PL6-eGFP BSD由 Muralidharan 实验室构建
Puf1-cas9 eGFP gRNA由 Muralidharan 实验室构建
NucleoSpin 凝胶与 PCR 产物纯化试剂盒Macherey-Nagel740609.250
Albumax ILife TechnologiesN/A建议尝试多个批次，以确定寄生虫生长最佳的批次
人红细胞Interstate Blood Bank, Inc请通过电子邮件或电话直接联系订购通常使用 O+ 型血
3D7 寄生虫株系可应要求提供N/A
LB 培养基（Lysogeny Broth）FisherBP1426-2可自行配制，无需严格使用此产品
氨苄青霉素FisherBP1760-25我们配制 1000 倍浓缩液（100 mg/mL 水溶液），储存于 -20°C
氨苄青霉素ClonetechR050A
抗 EF1alpha 抗体Daniel Goldberg 博士实验室华盛顿大学圣路易斯分校可用于 Western blot 的内参抗体可根据偏好选择，此为本实验室常用抗体
大鼠抗 HA 单克隆抗体（克隆 3F10）Roche 生产，Sigma 销售11867423001可使用您偏好的抗 HA 抗体
0.6 mL 离心管FisherAB0350
Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* 手动染色系统（固定剂 + 溶液 I 和 II）Fisher22-122-911也可使用吉姆萨染色
Fisherfines Premium 带磨砂区显微镜载玻片 - 规格：3 × 1 英寸Fisher12-544-3

参考文献

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  1. World Health Organization. World Malaria Report. , World Health Organization. Geneva. (2017).
  2. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
  3. Florentin, A., et al.

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GlmS

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