本文展示了如何利用邻近连接实验（PLA）以高灵敏度在固定细胞中可视化MST1/MST2异源二聚体的形成。
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本文内容
摘要
摘要
受调控的蛋白质-蛋白质相互作用是许多信号转导事件的基本原则，检测此类相互作用对于理解信号通路的组织方式和功能机制具有重要意义。目前已有多种方法可用于细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的检测，但能够用于检测内源性蛋白质之间相互作用的方法相对较少。其中一种方法——邻近连接实验（proximity ligation assay, PLA）——具有多项优势，值得推广应用。与其他常见的蛋白质-蛋白质相互作用分析方法相比，PLA 具有较高的灵敏度和特异性，实验过程中对细胞的干预最小，在本方案中仅需使用两种来源于不同物种的靶标特异性抗体。例如来自小鼠和兔的抗体）以及一种专用试剂：一组与特定寡核苷酸共价连接的二抗，当这些二抗彼此靠近时，可形成可扩增的平台 原位 PCR 或滚环扩增。在本演示中，我们展示了如何应用 PLA 技术在固定细胞中可视化 MST1 与 MST2 之间邻近关系的变化。本文所述技术特别适用于细胞信号转导研究的分析。
引言
MST1/ Hippo 信号通路的失调与发育障碍及致癌作用相关1在哺乳动物中，激酶MST1和MST2可激活（磷酸化）MOB1和LATS1/2，后者进一步磷酸化并失活转录共激活因子Yes相关蛋白（YAP）。2在活性（去磷酸化）状态下，YAP 具有促癌活性，可增强细胞增殖相关基因的转录；相反，当 YAP 被 Hippo 通路失活时，细胞增殖受到抑制，同时促进细胞凋亡3在组织中，MST1 和 MST2 主要以活性同源二聚体形式存在，但致癌刺激可增加 MST1/MST2 异源二聚体的水平，而此类异源二聚体无活性。4然而，MST1/MST2 异源二聚体的调控机制仍不清楚。同源和异源二聚体均通过 通过 MST1与MST2的C端卷曲螺旋区域（称为SARAH结构域）之间的相互作用5. 使用一个 原位 本文通过邻近连接实验（PLA）展示了人施万细胞（HSC）和人胚胎肾细胞（HEK-293）中存在MST1/MST2异源二聚体。PLA相较于其他蛋白质相互作用检测方法具有优势，因其能够检测内源性蛋白质相互作用，且无需外源基因表达或表位标签的使用即可实现对相互作用的识别与定量。6.
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方案
1. 溶液的配制
- 配制固定液：将4%多聚甲醛（PFA）溶于1×PBS中。配制10 mL溶液时，取2.5 mL的16% PFA，加入7.5 mL的1×PBS。
危险性：PFA在低剂量下具有致癌性，其蒸气和皮肤接触均有危害。储存于-20 °C。 - 配制通透液：将0.1% Triton X-100溶于1×PBS中。配制100 mL溶液时，将100 µL Triton X-100加入100 mL的1×PBS中。室温（RT）保存。
- 配制洗涤缓冲液：1×TBST。配制1 L溶液时，取100 mL的10×TBS、890 mL的dH2O和10 mL的Tween 20（10%）。
- 使用试剂盒提供的封闭液进行配制。或者，使用含2% BSA的1×PBS溶液。
- 使用试剂盒提供的抗体稀释液进行配制。或者，使用含1% BSA的1×PBS溶液。
2. 细胞接种
注意：在本研究中，我们使用了永生化的人源施万细胞（iHSC）和人胚胎肾293细胞（HEK 293）；然而，该方法也可用于多种类型的贴壁细胞。
- 在添加了10%胎牛血清（FBS）、0.2%葡萄糖、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素G和100 µg....
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结果
我们采用 PLA 检测法检测 MST1 与 MST2 在 HEK-293 和 iHSC 细胞中的相互作用。细胞经固定、透化处理后，使用多种抗体进行染色，随后 原位 根据PLA方案进行扩增（图1）。为检测MST1/MST2异源二聚体的水平，使用MST1和MST2抗体对细胞进行染色（图1A，1C，和1G）。作为阳性对照，我们还使用了ERK和pERK抗体，这两种抗体在ERK激活的细胞中应处于邻近位置（图1B 和 1F）。缺乏 MST1 和 MST2 的细胞未显示 PLA 信号（图1C）。仅用两种抗体中的一种进行染色的细胞同样不显示 PLA 信号（图1G这些结果表明，HEK-293细胞和iHSC细胞中.......
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讨论
我们发现本实验使用玻璃腔室载玻片非常方便，因为可以同时对多个（14-16个）细胞系进行实验，且在显微镜分析过程中无需每次更换样品。然而，该方法也可能带来一些问题，例如抗体交叉污染的风险增加。因此，尽管会延长实验时间，我们建议对每个孔进行单独清洗，而不是使用考普林瓶（Coplin jar）。此外，移除硅胶垫圈是一个精细的操作，必须小心且耐心地进行。即使操作极为细致，有时在移除垫圈后仍可能看到少量硅胶残留物。因此，必须彻底清除硅胶垫圈，必要时可使用刀片，因为残留过多的硅胶会影响显微镜观察时的共聚焦焦距。在移除硅胶垫圈后，用划线标记各孔的边界以帮助在显微镜下定位细胞，也可能有所帮助。
必须使用非交叉反应的一抗，每种一抗仅特异性识别异源二聚体中的一个成员（例如， MST1 抗体不应同时识别 MST2 反之亦然）。此外，需要注意使用不同的枪头以避免一抗和PLA探针之间的交叉污染，避免触碰孔板底部，并避免在样品上方直接移液。我们发现，对于iHSC，使用0.01%的多聚赖氨酸溶液包被培养皿效果更佳；而对于HEK-293细胞，则使用10 µg/mL的小鼠层粘连蛋.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢Chernoff实验室全体成员为本方案的优化和验证所做的贡献，特别是Maria Radu和Galina Semenova。我们还感谢Fox Chase癌症中心细胞成像中心的Andrey Efimov。本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金（R01 CA148805）对JC的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 培养皿载玻片 | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16孔，玻璃载片 |
| PLA探针 抗小鼠负链 | Sigma-Aldrich | DUO92004 | 包含1×封闭液、1×抗体稀释液 |
| PLA探针 抗兔正链 | Sigma-Aldrich | DUO92002 | 包含1×封闭液、1×抗体稀释液 |
| 荧光洗涤缓冲液 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | 包含洗涤缓冲液A和洗涤缓冲液B |
| 含DAPI的封片介质 | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| 红色检测试剂 | Sigma-Aldrich | DUO92008 | 包含5×连接反应液、1×连接酶、5×红色扩增液、1×聚合酶 |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) 抗体 | Cell Signaling | 9102s | |
| 磷酸化p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK抗体 |
| MST2抗体 | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1抗体 |
| 16% 戊二醛 | Electron microscopy sciences | 15710 | 用PBS稀释至4% PFA作为固定液 |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | 用1×PBS配制0.1% Triton X-100作为通透溶液 |
| 共聚焦显微镜 | Leica TCS SP8, 63x | 使用ImageJ软件进行图像分析 |
参考文献
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J.
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