本文介绍了一种利用改良的整体原位杂交方法，对蜱肠道内可存活微生物群在空间和时间上的分布进行评估的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
节肢动物媒介传播的传染病继续对全球人类健康构成重大威胁。这些病原体在定植媒介生物时并非孤立存在，而是可能与肠道腔内常驻微生物发生相互作用。已有研究表明，媒介生物的微生物群在多种虫媒传染病的病原体传播过程中发挥着重要作用。肠道内常驻细菌是否影响病原体 Ixodes scapularis 蜱，多种人类病原体的传播媒介，包括 Borrelia burgdorferi 影响蜱传播病原体的因素尚未明确。我们需要方法来表征与蜱肠道相关的细菌组成，以促进对蜱肠道内潜在种间相互作用的深入理解。采用整体标本 原位 通过杂交技术对特定细菌物种相关的RNA转录本进行可视化，可获取关于完整组织中微生物群丰度与分布的定性数据。该技术可用于研究蜱虫吸血过程中肠道微生物群环境的变化，也可用于分析蜱虫基因的表达。对完整蜱虫肠道进行染色，能够在无需三维重建的情况下获得目标RNA在组织中的宏观空间分布信息，且受环境污染物干扰较小，而基于测序的方法在研究复杂微生物群落时常常受到此类污染的干扰。总体而言，该技术是一种有价值的工具，有助于深入理解媒介-病原体-微生物群之间的相互作用及其在疾病传播中的作用。
引言
通过节肢动物媒介传播的人类和家畜病原体在全球范围内广泛存在，约占全球传染病总数的20%1，但目前尚无针对大多数此类病原体的有效且安全的疫苗。人们对共生、互利及致病性微生物（统称为微生物组2）在调控和塑造几乎所有后生动物健康方面所起重要作用的理解正在不断深入3。目前已有明确证据表明，病原体的节肢动物媒介体内也存在肠道微生物群，且这些与媒介相关的微生物群已被证实可影响多种虫媒传播的病原体4,5。节肢动物的微生物组包括真细菌、古菌、病毒以及原生动物、线虫和真菌等真核微生物6。然而，由于存在可用于鉴定特定细菌成员的标记基因和参考数据库，当前的研究重点主要集中在真细菌上。
以……为重点 Ixodes scapularis，多种人类病原体的蜱传媒介，包括 Borrelia burgdorferi7, 莱姆病的病原体，旨在通过优化一种微生物可视化技术，以增进我们对蜱虫肠道微生物群在媒介-病原体相互作用背景下作用的理解。蜱微生物组领域仍有许多问题有待解答。对于水平传播的病原体而言，肠道是....
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方案
1. DNA模板的制备
- 从NCBI数据库下载每种细菌属特异性的16S rRNA序列，并设计适用于聚合酶链式反应（PCR）的正向和反向引物，以扩增属特异性的区域（长度约为200–250个碱基对），具体方法如前所述19。还可参考开源数据库SILVA20,21和probeBase22中的在线资源，获取靶向rRNA的寡核苷酸探针和引物信息，因为某些细菌属的RNA探针可能已有商业化产品。
注意：应选择仅针对特定属的基因区域，并确保所设计的引物不会扩增相关细菌属的序列。这对于获得基因/属特异性的探针杂交结果至关重要。 - 将蜱虫在小鼠身上分别寄生24、48或72小时，解剖蜱虫肠道，并按照先前所述方法23提取蜱虫肠道的RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板，使用热循环仪通过PCR扩增属特异性的扩增片段。取部分PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，利用凝胶成像系统在紫外（UV）光下观察，确认扩增片段大小是否符合预期。
- 将目标细菌16S核糖体RNA扩增片段克隆至市售的TA载体（材料表）中，该载体含有适用于噬菌体RNA聚合酶（SP6、T7或T3）的启动子。对克隆子进行测序，以确认扩增....
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结果
在开始染色之前，对RNA探针的质量进行测量和评估至关重要。In vitro转录效率在很大程度上取决于DNA模板的数量和质量。我们通常通过甲醛凝胶电泳观察RNA探针，以验证转录反应所产生的探针的纯度和产量。探针应呈现为明亮且清晰的条带（图2）。RNA浓度的分光光度测定结果能很好地反映探针质量，并与凝胶上条带的外观高度一致。因此，一旦熟悉了该实验方案，可视情况省略凝胶观察步骤。无论采用何种方式，都必须确保产生足量且高质量的RNA，因为后续所有步骤均依赖于探针的稳定性与有效性。
该技术的优势在于能够对蜱虫微生物群进行广泛的观察，包括细菌种类的有无、蜱虫吸血过程中细菌丰度随时间的变化，以及细菌在完整组织中的定位。图3显示，不同生物学重复样本之间，以及单个蜱肠的7对盲囊之间，染色程度和分布存在一定的正常变异，因此建议每种实验条.......
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讨论
这是整体装片技术的首次应用 原位 杂交（WMISH）技术来研究病原体节肢动物载体的微生物群。我们的方案改编自一种用于研究发育的方案 果蝇 以及在青蛙胚胎中25,26整体RNA原位杂交 原位 杂交技术已常规用于在时空上定位基因转录本27 以及转录本的可视化可通过明场显微镜或荧光显微镜完成。我们已采用前者用于检测蜱虫肠道中的微生物群。需要注意的是，尝试进行整体样本 原位 使用去除头部以便固定液和杂交溶液渗透的完整蜱虫进行杂交未获成功。本文所述方案采用分离的蜱肠组织，已用于研究特定蜱虫蛋白对中肠内细菌定植的影响。23. WMISH 获得的信息可与免疫组织化学相媲美，但其优势在于无需针对目标基因或蛋白产生相应的蛋白和抗体。基因组信息足以用于生成 WMISH 所需的试剂。WMISH 和 FISH（荧光原位杂交）均可检测基因表达。然而，由于 WMISH 是一种基于酶反.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们衷心感谢耶鲁大学的Mustafa Khokha博士提供其实验室资源。感谢吴明杰先生在技术上的出色协助。EF是霍华德·休斯医学研究所（HHMI）的研究员。本工作得到了John Monsky与Jennifer Weis Monsky莱姆病研究基金捐赠的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 赛法 NITEX 尼龙网，110 微米 | 亚马逊 | 03-110/47 | |
| pGEM-T Easy 载体系统 | 宝生物工程（Promega） | A1360 | |
| 地高辛-11-UTP | 罗氏（Roche） | 1209256910 | |
| dNTP | 新英格兰生物实验室（New England Biolabs） | N0447S | |
| DNase I（无RNase） | 新英格兰生物实验室（New England Biolabs） | M0303S | |
| HiScribe SP6 RNA 合成试剂盒 | 新英格兰生物实验室（New England Biolabs） | E2070S | |
| HiScribe T7 高产 RNA 合成试剂盒 | 新英格兰生物实验室（New England Biolabs） | E2040S | |
| 无RNase水，DEPC处理 | 美国生物分析公司（American Bioanalytical） | AB02128-00500 | |
| EDTA，0.5 M，pH 8.0 | 美国生物分析公司（American Bioanalytical） | AB00502-01000 | |
| 甲醛，37% | JT Baker | 2106-01 | |
| 甲酰胺 | 美国生物分析公司（American Bioanalytical） | AB00600-00500 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
| DPBS，10X | 吉比科（Gibco） | 14300-075 | |
| 吐温-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
| 蛋白酶K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
| 三乙醇胺盐酸盐 | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
| 乙酸酐 | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
| 多聚甲醛 | 赛默飞世尔科技/派斯（ThermoScientific/Pierce） | 28906 | |
| SSC，20X | 美国生物分析公司（American Bioanalytical） | AB13156-01000 | |
| 酿酒酵母RNA | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
| 肝素钠 | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
| Denhardt溶液，50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
| CHAPS水合物 | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| RNase T1 | 赛默飞世尔科技（ThermoScientific） | EN0541 | |
| 马来酸 | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
| 封闭试剂 | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
| 抗地高辛-碱性磷酸酶，Fab片段 | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
| 左旋咪唑盐酸盐 | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
| 碱性磷酸酶显色底物 | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
| 波因溶液（Bouin's solution） | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| 过氧化氢 | 马林克罗特公司（Mallinkrodt Baker, Inc） | 2186-01 | |
| 单链RNA分子量标准 | Ambion -Millenium | AM7151 | |
| #11 高碳钢刀片 | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
| PCR仪 | 伯乐（BioRad, CA） | 1851148 | |
| 分光光度计 | 赛默飞世尔科技（ThermoScientific） | NanoDrop 2000C | |
| 旋转摇床 | VWR | DS-500E 数字旋转摇床 | |
| 振荡水浴箱 | BELLCO 玻璃公司（BELLCO Glass, Inc） | Hot Shaker-7746-12110 | |
| 凝胶成像系统 | 伯乐（BioRad） | Gel Doc XR+ 凝胶成像系统 | |
| 明场显微镜 | 尼康（Nikon） | NikonSM2745T | |
| 明场显微镜 | 蔡司（Zeiss） | AXIO Scope.A1 | |
| 解剖显微镜 | 蔡司（Zeiss） | STEMI 2000-C | |
| 光源箱 | VWR | 102097-658 | |
| PCR纯化试剂盒 | 凯杰（Qiagen） | 28104 | |
| 图像采集软件 | 蔡司（Zeiss） | Zen lite | |
| 图像编辑软件 | Adobe | Adobe Photoshop CS4 版本 11.0 | |
| 图像分析软件 | 美国国立卫生研究院（National Institutes of Health） | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
| 自动化兼容仪器 | 德国图宾根Intavis生物分析仪器公司（Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany） | Intavis, Biolane HT1.16v |
参考文献
- Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107(2015).
- Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science
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重印与许可
