方法文章

通过整体染色法观察蜱肠道微生物群 原位 杂交

DOI：

10.3791/57758

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2018年6月1日

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine, 2Program in Vertebrate Developmental Biology, Departments of Pediatrics and Genetics, Yale University School of Medicine, 3Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种利用改良的整体原位杂交方法，对蜱肠道内可存活微生物群在空间和时间上的分布进行评估的实验方案。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

节肢动物媒介传播的传染病继续对全球人类健康构成重大威胁。这些病原体在定植媒介生物时并非孤立存在，而是可能与肠道腔内常驻微生物发生相互作用。已有研究表明，媒介生物的微生物群在多种虫媒传染病的病原体传播过程中发挥着重要作用。肠道内常驻细菌是否影响病原体 Ixodes scapularis 蜱，多种人类病原体的传播媒介，包括 Borrelia burgdorferi 影响蜱传播病原体的因素尚未明确。我们需要方法来表征与蜱肠道相关的细菌组成，以促进对蜱肠道内潜在种间相互作用的深入理解。采用整体标本 原位 通过杂交技术对特定细菌物种相关的RNA转录本进行可视化，可获取关于完整组织中微生物群丰度与分布的定性数据。该技术可用于研究蜱虫吸血过程中肠道微生物群环境的变化，也可用于分析蜱虫基因的表达。对完整蜱虫肠道进行染色，能够在无需三维重建的情况下获得目标RNA在组织中的宏观空间分布信息，且受环境污染物干扰较小，而基于测序的方法在研究复杂微生物群落时常常受到此类污染的干扰。总体而言，该技术是一种有价值的工具，有助于深入理解媒介-病原体-微生物群之间的相互作用及其在疾病传播中的作用。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过节肢动物媒介传播的人类和家畜病原体在全球范围内广泛存在，约占全球传染病总数的20%1，但目前尚无针对大多数此类病原体的有效且安全的疫苗。人们对共生、互利及致病性微生物（统称为微生物组2）在调控和塑造几乎所有后生动物健康方面所起重要作用的理解正在不断深入3。目前已有明确证据表明，病原体的节肢动物媒介体内也存在肠道微生物群，且这些与媒介相关的微生物群已被证实可影响多种虫媒传播的病原体4,5。节肢动物的微生物组包括真细菌、古菌、病毒以及原生动物、线虫和真菌等真核微生物6。然而，由于存在可用于鉴定特定细菌成员的标记基因和参考数据库，当前的研究重点主要集中在真细菌上。

以……为重点 Ixodes scapularis，多种人类病原体的蜱传媒介，包括 Borrelia burgdorferi7, 莱姆病的病原体，旨在通过优化一种微生物可视化技术，以增进我们对蜱虫肠道微生物群在媒介-病原体相互作用背景下作用的理解。蜱微生物组领域仍有许多问题有待解答。对于水平传播的病原体而言，肠道是蜱与入侵病原体首次发生长期接触的部位；因此，阐明媒介肠道微生物群在调节媒介-病原体相互作用中的作用，将提供具有重要意义的科学见解。蜱具有独特的血液餐消化模式，其血液餐成分的处理过程在细胞内进行8肠道腔似乎在蜱虫吸血过程中起到容纳血餐的作用，营养物质的消化与吸收在数天的吸血过程中持续进行，并在吸血结束后继续进行。蜱虫在吸血期间获得的病原体随血餐一同进入肠道腔，因此肠道腔成为蜱虫、病原体以及常驻微生物群之间相互作用的主要场所。随着消化过程在饱血后持续进行 硬蜱科 蜱虫蜕皮过程中，肠道会发生结构和功能上的变化9肠道细菌的组成及其空间分布很可能随着肠道微环境的变化而协同改变。因此，深入了解蜱虫肠道中定植细菌的结构，对于全面理解蜱虫、病原体与肠道微生物群之间的相互作用至关重要。

利用高通量并行测序策略是描述宿主相关微生物群的常规分子技术10 扩增并测序细菌16S核糖体DNA（rDNA）。这些测序策略避免了获取特定细菌纯培养物的需要，并能够深入描述样本中存在的全部细菌成员。然而，这些策略因无法区分环境污染物与真实样本中的细菌而受到干扰。 真正有效的 居民。此外，在检测蜱虫等体积较小、因而微生物特异性DNA含量较低的样本时，环境污染物被扩增的可能性会增加11 并导致对微生物组构成的模糊解读。因此，结合特定可存活细菌的可视化进行功能表征，对于在时间和空间上明确界定和区分蜱虫微生物组至关重要。为实现这一目标，我们利用了整体RNA原位杂交技术 原位 杂交。该技术通常用于评估器官和胚胎中的基因表达模式12,13,14 并允许对整个目标样本进行半定量表达分析。这与传统的 原位 利用组织切片的杂交技术，通常需要对切片材料进行大量分析，并通过计算组装来预测整个器官中的表达情况15虽然整体染色通常指对完整生物体的染色12，此处“whole-mount”指完整的肠道或器官。使用完整器官进行RNA原位杂交的优势在于 原位 评估蜱虫肠道微生物群结构的杂交方法具有多重优势。蜱虫肠道由7对盲囊组成，每对盲囊在大小上各不相同16这些憩室在蜱类生物学、蜱微生物群或蜱-病原体相互作用背景下的功能差异（如果存在）尚不明确。对肠道进行操作时若导致肠道憩室破裂，会扰乱存在于肠腔内的微生物群或与肠道松散结合的微生物，从而导致对微生物群空间定位的误判。荧光标记的RNA 原位 杂交技术先前已被用于检测蜱虫肠道转录本17 通过固定并打开单个肠道憩室，以确保探针杂交并实现定位 B. burgdorferi 通过切片石蜡包埋的完整蜱虫获取转录本18这两种方法均需在杂交前对蜱虫组织进行操作，从而影响肠道微生物群的结构。

在本报告中，我们详细描述了利用整体标本技术检测活体蜱肠道微生物群的实验方案 原位 杂交（WMISH）。使用整装RNA 原位 杂交技术能够全面了解特定肠道细菌在蜱虫肠道不同区域的存在及其丰度，有助于深入理解蜱虫肠道生物学，特别是在病原体定植与传播背景下的相关机制。此外，使用针对特定细菌RNA的RNA探针可实现对蜱虫肠道中活菌的检测。

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方案

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1. DNA模板的制备

  1. 从NCBI数据库下载每种细菌属特异性的16S rRNA序列，并设计适用于聚合酶链式反应（PCR）的正向和反向引物，以扩增属特异性的区域（长度约为200–250个碱基对），具体方法如前所述19。还可参考开源数据库SILVA20,21和probeBase22中的在线资源，获取靶向rRNA的寡核苷酸探针和引物信息，因为某些细菌属的RNA探针可能已有商业化产品。
    注意：应选择仅针对特定属的基因区域，并确保所设计的引物不会扩增相关细菌属的序列。这对于获得基因/属特异性的探针杂交结果至关重要。
  2. 将蜱虫在小鼠身上分别寄生24、48或72小时，解剖蜱虫肠道，并按照先前所述方法23提取蜱虫肠道的RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板，使用热循环仪通过PCR扩增属特异性的扩增片段。取部分PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，利用凝胶成像系统在紫外（UV）光下观察，确认扩增片段大小是否符合预期。
  3. 将目标细菌16S核糖体RNA扩增片段克隆至市售的TA载体（材料表）中，该载体含有适用于噬菌体RNA聚合酶（SP6、T7或T3）的启动子。对克隆子进行测序，以确认扩增片段的身份及其相对于各启动子的方向性。据此确定用于生成正义或反义RNA探针的启动子（图1）。
  4. 使用适当的限制性内切酶，在制造商推荐的温度下，于最多30 µL反应体系中酶切1 mg质粒，反应2小时。根据将用于生成正义或反义探针的启动子来选择相应的限制性内切酶（图1）。取2 µL酶切反应产物在1%琼脂糖凝胶上电泳观察，验证线性化是否成功。
  5. 使用市售的PCR产物柱纯化试剂盒纯化剩余的28 µL酶切DNA，并通过分光光度计测定DNA浓度。
    注意：某些正义探针可能导致背景染色显著高于相应的反义探针，此时可能需要探索其他选项。替代的阴性对照可包括编码样本中不存在序列的质粒，或产生明显不同杂交模式的其他探针。

2. 地高辛标记-UTP RNA 探针的构建

  1. 在1.5 mL离心管中，加入7.5 µL 100 mM UTP、25 µL 10 mM digoxygenin-UTP，以及各10 µL的100 mM ATP、GTP和CTP，混匀制备核苷酸混合液。
  2. 执行 体外 使用市售的T7或Sp6 RNA聚合酶试剂盒进行转录，加入1 µL核苷酸混合液（步骤2.1）和0.25–1 µg模板DNA。加水至终体积为20 µL。轻轻弹动离心管混匀，短暂离心。在37 °C孵育2.5–3小时。
    注意：探针构建在质粒消化后浓度低至7 ng/µL时也可成功，但此步骤的典型浓度范围为15–25 ng/µL。体外转录反应也可在37 °C孵育过夜，但RNA产量并未显著增加。
  3. 加入1 µL DNase（2,000单位/µL），37 °C孵育10分钟。孵育时间不得超过10分钟，否则该酶可能开始降解RNA。
  4. 加入30 µL预冷的7.5–8 M氯化锂和30 µL预冷的无核酸酶水以沉淀RNA。轻弹管壁混匀。于-20 °C过夜沉淀RNA。
  5. 在4 °C条件下，以17,000 × g离心20分钟收集RNA。用1 mL新配制的含二乙基焦碳酸酯（DEPC）水的75%乙醇洗涤沉淀一次，然后再次离心。
  6. 移除并弃去上清液，将离心管倒置于干净的纸巾上，静置干燥10分钟。用无核酸酶水重悬沉淀。若沉淀清晰可见，则用25 µL重悬；若沉淀非常微小或不可见，则用15–20 µL重悬。使用分光光度计测定RNA浓度的估算值。
    注：典型的 RNA 浓度范围为 200 - 500 ng/µL。

3. 通过RNA甲醛凝胶电泳可视化RNA探针以评估RNA纯度

警告：甲醛具有吸入性危害，因此配制RNA凝胶分析所需溶液时应在通风橱中进行。溴化乙锭为疑似致癌物，操作时需小心谨慎。

  1. 按照先前所述方法制备1%甲醛琼脂糖凝胶24，并在无RNase的胶槽中灌胶。待凝胶冷却后，向胶槽中加入1×电泳缓冲液（pH 7.0的1×MOPS，含5%甲醛）。
  2. 制备上样缓冲液（5 µL 400 mg/mL溴化乙锭，20 µL 10×MOPS，35 µL甲醛，以及100 µL甲酰胺）。将2 µL RNA探针（步骤2.6）与8 µL上样缓冲液混合，于70 °C孵育10分钟。
  3. 通过混合5 mL 50%甘油、1 mL 10%甲醛、40 mg溴酚蓝、40 mg二甲苯青、以及20 µL 0.5 M EDTA（pH 7.5）来制备RNA上样缓冲液。使用后，将该缓冲液储存于-20 °C。
  4. 向步骤3.2中的RNA样品加入3 µL上样缓冲液并混匀。将样品管置于冰上保存。
  5. 将步骤3.4中的全部样品体积上样至凝胶中。同时加入单链RNA分子量标记物的一个等分试样，以确认RNA大小。在100 V或更低电压下电泳，直至蓝色染料迁移至凝胶约75%的位置。使用凝胶成像系统在紫外光下观察RNA。 
    注意： 高质量的RNA探针应呈现为一条清晰、界限分明的条带，其迁移率对应于探针的预期大小（图2，泳道1）。若探针呈现为弥散且拖尾的条带（图2，泳道2），则不应使用。

4. 蜱肠道的采集与固定

  1. 采集在小鼠身上取食了特定时间的Ixodes scapularis若虫。
    注意：本技术中，取食48或72小时的蜱虫效果最佳。 
  2. 在解剖显微镜下，将蜱虫的肠道解剖至载玻片上的MEMFA中（表1），尽量避免损伤器官。将一只蜱虫置于洁净的显微镜载玻片上，加入20–30 µL MEMFA。使用无菌的高碳钢11号刀片，从蜱虫盾板处切下头部，保留虫体部分。轻轻按压虫体，使肠道盲囊和唾液腺从体壁切口处挤出。分离唾液腺与肠道，并用刀片将肠道挑起。 
  3. 将肠道收集至含有500 µL MEMFA的1.5 mL离心管中。室温下轻轻振荡孵育1小时，或在4 °C下过夜孵育。
    注意：蜱虫唾液腺也可进行解剖，并以类似方式固定和染色。
  4. 用1 mL预冷的100%乙醇轻柔洗涤组织3次，以进行脱水处理。每次洗涤后让肠道自然沉降至管底，避免离心造成组织损伤。如需长期保存，可将样品置于-20 °C的100%乙醇中。

5. 网格样品篮和24孔篮架的构建

  1. 使用手术刀上的加热单刃剃须刀片，将2 mL或5 mL带卡扣盖的离心管底部切除。
    注意：在完成切割前，刀片可能需要多次重新加热。
  2. 裁剪略大于新管口的110 µm尼龙网片。将网片与管底轻轻压合，置于中低温度的加热板上，加热至形成良好密封。待冷却后，检查网片与管壁之间无间隙，并修剪边缘多余的网片。 
  3. 在24孔板的盖子上打孔，使5.2步骤中制作的样品篮边缘能够卡在孔上而不掉落，从而确保当样品篮放置于盖子的孔中时，其底部能完全浸入孔板的孔内。
  4. 使用此配套的篮架可相对轻松地将篮子从一个板转移到另一个板，适用于整个过程 原位 杂交实验方案。使用两个24孔板，以便在一个板进行孵育的同时，准备另一个板进行下一次洗涤。

6. 原位 杂交：第1天（用时：4–5小时）

  1. 将肠道组织转移至标记好的样品篮中，按实验条件和预定使用的RNA探针进行分组。
    注意：每个实验条件至少处理5个肠道样本，以涵盖生物学重复间的自然差异。
  2. 通过逐步增加磷酸盐缓冲液（含0.1%非离子型表面活性剂，PTw；表1）与乙醇的体积比，轻柔地对样品进行再水化，避免组织中引入气泡。
    注意：除非另有说明，所有洗涤步骤均在24孔篮式支架中、室温下轻轻振荡进行。向支架的每个孔中加入500–600 µL洗涤液，确保每个篮中的肠道组织完全浸没。所有溶液均使用DEPC处理过的水配制，以防止RNA降解。
    1. 用500 µL 100%乙醇洗涤样品5分钟。
    2. 为每个样品篮分别准备至少500 µL的75%、50%和25%乙醇（溶于PTw）。按乙醇浓度从高到低依次洗涤，每种浓度洗涤5分钟，完成再水化过程。
    3. 在PTw中洗涤样品4次，每次5分钟。
  3. 用含蛋白酶K（10 µg/mL）的PTw溶液处理样品5分钟，以实现组织通透化。
  4. 为组织进行RNA探针杂交前的预处理。
    1. 在24孔篮式支架中，按步骤6.2所述方法，于室温下轻轻振荡，分别用500 µL三乙醇胺缓冲液（0.1 M，pH 7.0–8.0）（表1）洗涤样品两次，每次5分钟，以维持无胺环境。
    2. 用500 µL含0.25%乙酸酐的三乙醇胺缓冲液（0.1 M，pH 7.0–8.0）处理样品两次，每次5分钟，随后在PTw中洗涤两次，每次5分钟。
      注意：乙酸酐可乙酰化游离胺基以中和正电荷，这对防止非特异性静电相互作用、确保探针与mRNA的特异性结合至关重要。
    3. 用500 µL含4%多聚甲醛的PTw溶液固定肠道组织20分钟，随后在PTw中洗涤5次，每次5分钟。
    4. 在24孔板的24孔篮式支架中，加入500 µL杂交缓冲液，于60 °C轻轻振荡孵育1.5–2.5小时，进行预杂交。保留此步所用的杂交缓冲液，用于第二天的实验流程（步骤7.1）。（表1）
    5. 将RNA探针用杂交缓冲液稀释至终浓度1 µg/mL，配制探针杂交液。  将样品置于24孔篮式支架中，加入探针杂交液，在60 °C轻轻振荡条件下于摇床水浴中过夜孵育（表2）。用铝箔紧密包裹承载篮式支架的培养板，防止杂交液蒸发。

7. 原位 杂交：第2天（用时：4.5 - 5.5 小时）

  1. 从探针杂交溶液中取出样品，放入前一日预留的杂交缓冲液中。在60 °C下轻轻振荡孵育3分钟。
    注意：探针杂交溶液可在-20 °C保存，最多可重复使用3次。
  2. 通过将20x SSC用DEPC处理水稀释制备2x SSC缓冲液（表1）。用2x SSC在60 °C下洗涤样品两次，每次3分钟，随后再洗涤三次，每次20分钟，以彻底去除探针和杂交缓冲液的残留。
  3. 在2x SSC缓冲液中加入RNase A（20 µg/mL）和RNase T1（10 µg/mL），于37 °C处理30分钟，以降解未杂交的单链RNA探针。
  4. 在室温下用2x SSC洗涤一次，每次10分钟。通过将2x SSC用DEPC处理水稀释制备0.2x SSC缓冲液，然后在60 °C下用0.2x SSC洗涤两次，每次30分钟，以去除多余的RNase。
  5. 用500 µL马来酸缓冲液（MAB；表1）洗涤两次，每次10分钟。
  6. 用封闭液（2%封闭试剂溶于MAB中）孵育样品1.5–2小时。
    注意：封闭试剂溶解较困难，轻微加热有助于溶解。
  7. 将封闭液替换为抗地高辛碱性磷酸酶偶联抗体（用封闭液按1:3,000稀释）500 µL，于室温孵育约4小时，或在4 °C过夜孵育。

8. 原位 杂交：第3天（时间：6小时至过夜）

  1. 用 500 µL MAB 缓冲液至少洗涤样品 5 次，每次 30 分钟，以去除过量抗体。
    注意：这些洗涤步骤具有灵活性，可延长至每次 1–2 小时，或用一次在 4 °C 下过夜的洗涤替代 3–4 次洗涤，对效果影响极小。
  2. 用碱性磷酸酶缓冲液（pH 9.5，AP 缓冲液；表 1）洗涤两次，每次 5 分钟。
  3. 用 500 µL 碱性磷酸酶显色底物（材料表）替换最后一次洗涤液，开始显色反应。用铝箔包裹样品板，在室温下反应 3- 5 小时，或在 4 °C 下过夜。定期在体视显微镜下观察组织，以避免过度染色。
    注意：当染色完成时，在显微镜下可肉眼观察到反义探针样品呈现紫色，但组织不应变得过深。在 4 °C 下染色进程非常缓慢，可能需要 20–24 小时。
  4. 用 500 µL MAB 缓冲液洗涤 5 分钟以终止显色反应，然后在 Bouin 溶液中固定组织过夜。
    警告：Bouin 溶液需在通风橱中操作；其具有腐蚀性且为致癌物。

9. 原位 杂交：第4天（用时：3 - 3.5 小时）

  1. 每个样本篮准备至少 7 mL 的 1x SSC，方法是将 20x SSC 用经 DEPC 处理的水稀释。用 70% 乙醇的 1x SSC 溶液洗涤样本 4 至 6 次，直至组织不再呈黄色，以去除波因溶液。
  2. 每份样本篮准备 500 µL 的 75%、50% 和 25% 乙醇溶液（溶于 1x SSC）。将样本依次从高浓度到低浓度乙醇溶液中各洗涤 5 分钟，以重新水化组织。随后在 1x SSC 中洗涤两次，每次 5 分钟。
  3. 将样品置于漂白液中孵育（表1在通风橱内的光源箱上照射90分钟。
    注意：此步骤可去除样本中的色素沉着或Bouin溶液造成的着色，从而增强探针信号，实现清晰的可视化。
  4. 用500 µL的1x SSC溶液清洗样品两次，每次5分钟。
  5. 将样品篮倒置放入新的24孔板的一个孔中，使用移液管通过网底用70%乙醇洗涤，以尽量减少对组织的损伤。如需保存，置于-20 °C。
  6. 为了获得如图所示多个样本的染色模式的总体情况 图3, 将肠道组织置于24孔板中的70%乙醇中保存，并使用明场显微镜观察。如图所示，在明场显微镜下检查单个肠道组织 图 4, 图5，以及 图6将肠道组织置于100%甘油中，用盖玻片封片。使用塑料刮刀轻柔操作组织，尽量减少损伤。
    注意：甘油的高黏度有助于保护组织免受挤压损伤，并可精细调整憩室的位置，从而在高倍镜下实现组织的最佳观察。
  7. 使用显微镜专用的图像采集软件在显微镜上采集图像（材料表）并导出为Tiff图像至通用图像编辑软件。为量化不同实验处理之间的染色差异，请下载通用图像分析软件（材料表）。在分析软件中打开图像，并按照软件内的说明测量染色的像素强度，计算染色的直方图。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在开始染色之前，对RNA探针的质量进行测量和评估至关重要。In vitro转录效率在很大程度上取决于DNA模板的数量和质量。我们通常通过甲醛凝胶电泳观察RNA探针，以验证转录反应所产生的探针的纯度和产量。探针应呈现为明亮且清晰的条带（图2）。RNA浓度的分光光度测定结果能很好地反映探针质量，并与凝胶上条带的外观高度一致。因此，一旦熟悉了该实验方案，可视情况省略凝胶观察步骤。无论采用何种方式，都必须确保产生足量且高质量的RNA，因为后续所有步骤均依赖于探针的稳定性与有效性。

该技术的优势在于能够对蜱虫微生物群进行广泛观察，包括细菌种类的存在与否、蜱虫取食过程中细菌丰度随时间的变化，以及细菌在整块组织中的定位。在生物学重复样本之间，以及在单个蜱虫肠道的7对盲囊之间，染色程度和分布存在一定的自然变异（图3），因此，为了解平...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这是整体装片技术的首次应用 原位 杂交（WMISH）技术来研究病原体节肢动物载体的微生物群。我们的方案改编自一种用于研究发育的方案 果蝇 以及在青蛙胚胎中25,26整体RNA原位杂交 原位 杂交技术已常规用于在时空上定位基因转录本27 以及转录本的可视化可通过明场显微镜或荧光显微镜完成。我们已采用前者用于检测蜱虫肠道中的微生物群。需要注意的是，尝试进行整体样本 原位 使用去除头部以便固定液和杂交溶液渗透的完整蜱虫进行杂交未获成功。本文所述方案采用分离的蜱肠组织，已用于研究特定蜱虫蛋白对中肠内细菌定植的影响。23. WMISH 获得的信息可与免疫组织化学相媲美，但其优势在于无需针对目标基因或蛋白产生相应的蛋白和抗体。基因组信息足以用于生成 WMISH 所需的试剂。WMISH 和 FISH（荧光原位杂交）均可检测基因表达。然而，由于 WMISH 是一种基于酶反...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们衷心感谢耶鲁大学的Mustafa Khokha博士提供其实验室资源。感谢吴明杰先生在技术上的出色协助。EF是霍华德·休斯医学研究所（HHMI）的研究员。本工作得到了John Monsky与Jennifer Weis Monsky莱姆病研究基金捐赠的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
赛法 NITEX 尼龙网，110 微米亚马逊03-110/47
pGEM-T Easy 载体系统宝生物工程（Promega）A1360
地高辛-11-UTP罗氏（Roche）1209256910
dNTP新英格兰生物实验室（New England Biolabs） N0447S
DNase I（无RNase）新英格兰生物实验室（New England Biolabs）M0303S
HiScribe SP6 RNA 合成试剂盒新英格兰生物实验室（New England Biolabs）E2070S
HiScribe T7 高产 RNA 合成试剂盒新英格兰生物实验室（New England Biolabs）E2040S
无RNase水，DEPC处理美国生物分析公司（American Bioanalytical）AB02128-00500
EDTA，0.5 M，pH 8.0美国生物分析公司（American Bioanalytical）AB00502-01000
甲醛，37%JT Baker2106-01
甲酰胺美国生物分析公司（American Bioanalytical）AB00600-00500
EGTASigma AldrichE-4378
DPBS，10X吉比科（Gibco）14300-075
吐温-20Sigma AldrichP1379-25ML
蛋白酶KSigma Aldrich3115879001
三乙醇胺盐酸盐Sigma AldrichT1502-100G
乙酸酐Sigma Aldrich320102-100ML
多聚甲醛赛默飞世尔科技/派斯（ThermoScientific/Pierce）28906
SSC，20X美国生物分析公司（American Bioanalytical）AB13156-01000
酿酒酵母RNASigma AldrichR3629-5G
肝素钠Sigma AldrichH3393-10KU
Denhardt溶液，50XSigma AldrichD2532-5ML
CHAPS水合物Sigma AldrichC3023-1G
RNase ASigma Aldrich10109142001
RNase T1赛默飞世尔科技（ThermoScientific） EN0541
马来酸Sigma AldrichM0375-100G
封闭试剂Sigma Aldrich11096176001
抗地高辛-碱性磷酸酶，Fab片段Sigma Aldrich11093274910
左旋咪唑盐酸盐Sigma Aldrich31742-250MG
碱性磷酸酶显色底物Sigma Aldrich11442074001
波因溶液（Bouin's solution）Sigma AldrichHT10132-1L
过氧化氢马林克罗特公司（Mallinkrodt Baker, Inc）2186-01
单链RNA分子量标准Ambion -MilleniumAM7151
 #11 高碳钢刀片 C and A Scientific Premiere#11-9411
PCR仪伯乐（BioRad, CA）1851148
分光光度计赛默飞世尔科技（ThermoScientific） NanoDrop 2000C
旋转摇床VWRDS-500E 数字旋转摇床
振荡水浴箱BELLCO 玻璃公司（BELLCO Glass, Inc）Hot Shaker-7746-12110
凝胶成像系统 伯乐（BioRad）Gel Doc XR+ 凝胶成像系统
明场显微镜 尼康（Nikon）NikonSM2745T
明场显微镜 蔡司（Zeiss）AXIO Scope.A1
解剖显微镜 蔡司（Zeiss）STEMI 2000-C
 光源箱VWR102097-658
PCR纯化试剂盒 凯杰（Qiagen）28104
图像采集软件蔡司（Zeiss）Zen lite
图像编辑软件 Adobe Adobe Photoshop CS4 版本 11.0
图像分析软件美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/
自动化兼容仪器德国图宾根Intavis生物分析仪器公司（Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany） Intavis, Biolane HT1.16v

参考文献

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