方法文章

脓肿分枝杆菌在吞噬细胞内复制的毒力标志物鉴定

DOI：

10.3791/57766

⸱

2018年9月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
12I, UVSQ, INSERM UMR1173, Université Paris-Saclay, 2Institut Pasteur, Unité de Pathogénomique Mycobactérienne

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在此，我们介绍两种用于研究吞噬细胞-脓肿分枝杆菌 相互作用：通过转座子突变体文库筛选细菌胞内缺陷表型，以及利用RNA测序确定细菌胞内转录组。这两种方法均可揭示增强细菌胞内适应性的基因组优势与转录组适应机制。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacterium abscessus 与其他腐生性分枝杆菌的区别在于其能够抵抗人巨噬细胞的吞噬作用，并能在这些细胞内增殖。这些毒力特征使得 M. abscessus 具有致病性，尤其是在患有基础结构性肺部疾病的易感宿主中，例如囊性纤维化、支气管扩张或结核病患者。目前尚不清楚患者是如何感染 M. abscessus 的。与许多其他分枝杆菌不同，M. abscessus 并未在环境中被发现，但可能寄生于阿米巴原虫内，而环境中的吞噬性阿米巴可能是 M. abscessus 的潜在储存库。事实上，M. abscessus 对阿米巴的吞噬作用具有抗性，且在阿米巴细胞内的生存似乎可在实验感染模型中增强 M. abscessus 的毒力。然而，关于 M. abscessus 自身的毒力机制仍知之甚少。为了揭示赋予 M. abscessus 胞内生存优势的基因，研究人员建立了一种 M. abscessus 转座子突变文库的筛选方法。同时，还开发了一种在与阿米巴共培养后从胞内分枝杆菌中提取RNA的方法。该方法经过验证，能够对细胞内的完整 M. abscessus 转录组进行测序，首次全面揭示了 M. abscessus 对胞内生存环境的适应机制。这两种方法共同为我们理解 M. abscessus 的毒力因子提供了重要线索，这些因子使 M. abscessus 能够在人体呼吸道中定植。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

分枝杆菌属包括从无害的腐生生物到重要的人类病原体在内的多种物种。众所周知的致病性物种如 结核分枝杆菌, Mycobacterium marinum 和 Mycobacterium ulcerans 属于生长缓慢的分枝杆菌（SGM）亚群。相比之下，快速生长的分枝杆菌（RGM）亚群的特点是在琼脂培养基上可在少于7天内形成可见菌落。RGM群包含超过180个物种，主要为非致病性的腐生分枝杆菌。关于RGM与其宿主相互作用的研究主要集中于 Mycobacterium smegmatis 并证明这些分枝杆菌会因巨噬细胞的杀菌作用而被迅速清除。

Mycobacterium abscessus 是一种罕见的快速生长分枝杆菌（RGM），对人类具有致病性，可引起多种感染，从皮肤和软组织感染到肺部及播散性感染均有涉及。M. abscessus 与Mycobacterium avium 被认为是囊性纤维化患者中主要的分枝杆菌病原体1。

针对 M. abscessus 开展的多项研究表明，该分枝杆菌表现出胞内病原体的特性，能够在肺部和皮肤的巨噬细胞及成纤维细胞中存活，逃避其杀菌反应，这一特性在快速生长分枝杆菌（RGM）中通常并不常见2,3,4。M. abscessus 的基因组分析发现，其含有典型存在于与土壤、植物及水生环境接触的环境微生物中的代谢通路，而这些环境中常存在自由生活的阿米巴原虫5。研究还表明，M. abscessus 拥有多种在腐生性且非致病性的RGM中未发现的毒力基因，这些基因可能通过水平基因转移获得，发生在有利于基因交换的生态位中，该环境可能聚集了多种抗阿米巴的细菌。

实验上，最早引人注目的结果之一是观察到 M. abscessus 与 M. tuberculosis 一样，能够在巨噬细胞内生长6。M. abscessus 还能抵抗吞噬体的酸化、细胞凋亡和自噬，这三种机制是细胞抵抗感染的关键环节2。甚至已有研究表明，M. abscessus 能够在吞噬体与细胞质溶胶之间建立直接通讯，而细胞质溶胶营养更丰富，可能更有利于细菌增殖2。目前对 M. abscessus 所具备或获得的、使其能在细胞内环境中存活的基因组优势了解甚少。阿米巴共培养是一种有效的方法，已用于分离出多种新的抗阿米巴细菌，例如 Mycobacterium massiliense7,8。在小鼠气溶胶化 M. abscessus 的模型中，观察到其在阿米巴内增殖的能力，这可能赋予 M. abscessus 更强的毒力4。一种假说是，M. abscessus 在该环境中演化出了某些遗传特征，使其能在吞噬细胞中存活，而这些特征不同于其他非致病性快速生长分枝杆菌（RGM）。这些获得性特征可能增强了其在人类宿主中的传播能力和毒力。

本报告介绍了用于揭示基因组赋予优势的工具和方法 M. abscessus 在变形虫环境中生存。为此，筛选 M. abscessus 转座子突变体的构建方法首次被描述，基于 Acanthamoeba castellanii 模式菌株，可用于鉴定在胞内生长方面存在缺陷的突变株。另有报道在巨噬细胞中进行第二轮筛选，以确认该缺陷在人体宿主中是否仍然存在。其次，为了理解所涉及的机制 M. abscessus 以适应吞噬细胞内的生活并增强其在动物宿主中的毒力，一种专门优化的方法 M. abscessus 已开发, 在与阿米巴共培养后，从中提取了胞内细菌的总RNA。因此，获得了全面的视图 M. abscessus 用于细胞内生存所必需的基因的研究方法已得到开发。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 文库筛选

  1. 构建 Tn 突变体文库
    1. 获取转座子文库。
      注意：本实验所用转座子突变文库由美国波士顿哈佛公共卫生学院 E.J. Rubin 提供。该文库由一株光滑型临床菌株（43S）构建而成 M. abscessus 复合物（M. abscessus 亚种 massiliense）与一种噬菌粒共同引入 M. abscessus 允许单个随机插入 Tn 插入到TA二核苷酸中（共91,240个TA序列） M. abscessus 基因组）。更多细节请参见 Rubin 的参考文献 等9 和 Laencina 等10.
  2. 文库滴定与保存 M. abscessusTn 平板中的突变体
    注：此步骤需要一周时间。
    1. 将文库在冰上解冻。通过在1 mL水中进行系列稀释（10倍梯度）测定细菌浓度。-1 到 10-15)。将每个稀释度的菌液取一滴接种于含有250 mg/mL卡那霉素的7H11琼脂培养基平板上。将平板在37 °C培养3–4天。
      注意：此处为10的滴定11 细菌/mL被回收。
    2. 确定文库浓度后，将文库用10 mL 25%甘油-水溶液稀释至终浓度为3,000个细菌/mL。将文库溶液分装至10个冻存管中，每管1 mL。于-80 °C保存分装样品。
    3. 准备使用时，将一份稀释后的文库在冰上解冻，并取100 µL文库加入10块方形穆勒-欣顿（MH）琼脂平板（直径12 cm），于37 °C培养3–4天后，可回收200至300个单菌落。
    4. 使用无菌牙签将单个菌落（约6,000个菌落，分布在60块96孔板中）转移至含有200 µL 7H9培养基的96孔板中，培养基中添加0.2%甘油、1%葡萄糖和250 mg/mL卡那霉素。于37 °C静置培养5天。
    5. 将100 µL培养物（步骤1.2.4）转移至含有100 µL含40%甘油的7H9培养基的96孔板中。将有序文库储存于-80 °C。
    6. 重复步骤 1.2.3 至 1.2.5，直至获得 10,000 个独立克隆（约 100 块 96 孔板和 30 块 MH 板）。
  3. 阿米巴原虫的制备
    1. 培养阿米巴原虫 Acanthamoeba castellanii (AC) 在 75 厘米处2 室温（RT）下，在30 mL PYG培养基中培养组织培养瓶表1用于细胞系的扩增11.
      注意：在显微镜下可清晰观察到来自大型贴壁细胞的成熟滋养体，其含有多个食物泡。细胞倍增时间约为25小时。每3天将初始培养物的三分之一接种至75 cm²培养瓶中进行传代扩增。2 组织培养瓶
    2. 用25 mL移液管吸除PYG培养基。用10 mL AC缓冲液洗涤细胞表 2），不含任何碳源或氮源12重复洗涤两次。
      注意：AC 缓冲液不含碳源和氮源，可避免分枝杆菌在细胞外生长。这种最低限度培养基会导致阿米巴原虫形成包囊。为限制此现象，采用热灭活 E. coli 作为底物（步骤1.4）加入到阿米巴中，并采用极短的培养时间（突变体筛选培养48小时，RNA测序实验培养4小时或16小时）。或者，可使用该培养基并添加PYG培养基（通常为10%）进行富集。
    3. 通过剧烈振荡组织培养瓶一次，使变形虫从瓶底脱落。
    4. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并调整细胞浓度至 5 x 105 变形虫/mL，用AC缓冲液稀释。
  4. 热灭活的制备 大肠杆菌 感染后用于喂养变形虫的细菌
    1. 培养 大肠杆菌 从甘油保种管中取临床分离菌株，接种于100 mL LB液体培养基中，37 °C过夜培养。
    2. 通过离心收集细菌，离心条件为 1,835 x g 在50 mL离心管中离心10分钟。弃去上清液。用10 mL 10%甘油水溶液重悬沉淀。重复洗涤两次。
    3. 用5 mL 10%甘油水溶液重悬菌体沉淀。将悬液以每管0.5 mL分装至1.5 mL离心管中。通过梯度稀释法进行系列稀释，并将稀释液涂布于LB琼脂平板，测定每毫升细菌数量。将分装样品于-80 °C保存。
    4. 感染阿米巴前一日，将一份样品置于冰上解冻，随后将离心管在70 °C孵育60分钟以进行热灭活。
      注意：取100 µL灭活后的细菌涂布于LB琼脂平板，37 °C过夜培养以验证灭活效果。培养一晚后应无可见菌落。
    5. 将热灭活的细菌稀释至浓度为 107 将细菌置于50 µL AC缓冲液中稀释，并于4 °C保存，时间不超过一周。
  5. 阿米巴共培养M. abscessus Tn 突变体：初筛
    注：筛选6,000个突变体需要3–4个月。
    1. 铺板 5 × 104 将阿米巴虫/孔加入含100 µL AC缓冲液的96孔板中。在32 °C下孵育1小时，不振荡。让悬浮的阿米巴滋养体有时间贴附于孔壁。
      1. 孵育的同时，将细菌置于冰上解冻1小时。
    2. 使用电子多通道移液器加入5 µL解冻的细菌培养物。感染1.5小时。从96孔板中筛选约6,000个独立克隆。 Tn 突变体品系
      注意：在本实验步骤中，MOI 值尚不明确；然而，所有含有 Tn 突变体以完全相同的方式进行培养。该初筛旨在快速鉴定出细胞内缺陷的突变体，而不考虑接种密度的差异。
    3. 感染1.5小时后，在生物安全柜中将96孔板倒置于无菌金属托盘内的无菌纱布上，以去除AC培养基。随后每孔重新加入200 µL AC培养基。重复此洗涤步骤两次。
    4. 加入200 µL新鲜培养基，其中添加100 µg/mL阿米卡星，以清除残留的细胞外分枝杆菌。
    5. 孵育2小时后，进行额外3次洗涤（步骤1.5.3所述）。洗涤后，用含200 µL AC缓冲液和50 µg/mL阿米卡星的培养液维持培养。
    6. 加入 5 x 107 热灭活 大肠杆菌 在感染结束时及之后每24小时，对细菌（来自步骤1.4）进行处理，以防止阿米巴包囊形成。
    7. 共培养48小时后，每孔加入10 µL 10% SDS（十二烷基硫酸钠），在32 °C孵育30分钟以裂解细胞。随后进行系列稀释，并接种至含5%羊血的哥伦比亚琼脂平板（COS平板），以评估胞内分枝杆菌数量。用封口膜密封平板，在37 °C孵育。
    8. 当培养3-4天后琼脂平板上出现菌落时，拍摄平板照片，并通过观察细菌菌落数量最少的沉积区域，鉴定出胞内生长缺陷的突变株。
      注意：无需关注菌落的形状、高度或密度（图1A鉴定出136/6000个突变体。
  6. 阿米巴共培养M. abscessus Tn 突变体：对初筛中鉴定出的突变体进行的第二次筛选
    注意：此步骤需要2周时间。在初次筛选获得136株减毒突变株后，必须进行第二次筛选，以精确测定接种细菌数量及感染后2天的胞内存活细菌数量。
    1. 在含有20 mL 7H9培养基（补充0.2%甘油、1%葡萄糖和250 mg/mL卡那霉素）的50 mL试管中，分别培养每种受影响突变株的单个菌落。让细菌生长至对数期（OD600 ≈ 0.6）。<光密度<0.8).
    2. 通过离心（1,835 x g）洗涤培养物 g 在AC培养基中孵育10分钟，弃去上清液。用20 mL添加0.2%甘油、1%葡萄糖和250 mg/mL卡那霉素的7H9培养基重复洗涤两次。
    3. 用5 mL AC缓冲液重悬细菌。
    4. 测定突变株的菌落形成单位（CFU）浓度。在24孔板中，向最前面两行的各孔加入1 mL水。向第一孔加入100 µL细菌悬液，使用微量移液器吹吸混匀3次。然后吸取100 µL转移至第二孔。
    5. 使用新的枪头，从第二孔开始重复步骤1.6.4至第三孔。 等等。 直到第十二孔。
    6. 吸出 30 µL 的 10-12 稀释后加入COS板中。对其他稀释度重复相同操作。
    7. 用封口膜包裹COS培养板，在37 °C下孵育3–4天。通过计数菌落确定浓度。
    8. 在24孔板中按照上述方法进行三复孔共培养实验，每孔加入5 x 104 每孔加入1 mL AC共培养基中的阿米巴原虫。以感染复数（MOI）为10进行接种。
    9. 共培养48小时后，按照步骤1.5.7所述进行细胞裂解。在水中进行系列稀释（10-1 至 10-6）并将30 µL加入COS平板中。在进行菌落形成单位（CFU）计数前，于37 °C培养4天。
      注意：经过第二次筛选后，136个突变体中有60个被保留。
    10. 将影响细胞内存活的突变株保存起来。取单个菌落加入含有甘油（终浓度20%）的LB培养基的冻存管中，或加入含有商用保存溶液及微珠的冻存管中，以利于长期保存并方便后续接种，随后于-80 °C保存。
    11. 评估 体外 通过每2天测量600 nm处的光密度（OD）来评估突变体生长情况。
      1. 在含有20 mL 7H9培养基（补充0.2%甘油、1%葡萄糖和250 mg/mL卡那霉素）的50 mL试管中，分别培养每种受影响突变株的单个菌落。让细菌生长至对数期（OD600约为0.6）。<光密度<0.8）后，将OD值调至0.01以开始动力学测定。
      2. 排除具有以下特征的突变体 体外 与野生型菌株相比，在细胞内缺陷突变体组中表现出生长缺陷。
  7. 巨噬细胞共培养M. abscessus Tn 在阿米巴细胞内生活缺陷的突变体
    注：此步骤需要1个月。
    1. 铺板 5 × 104 每24孔板每孔接种1 mL含10%胎牛血清（FCS）的完全DMEM培养基，其中包含J774.2小鼠巨噬细胞。于37 °C、5% CO₂条件下培养24小时。2 以促进巨噬细胞贴壁。设置3个重复。
    2. 进行感染。接种 Tn 突变体以10的感染复数（MOI）接种，用含10%胎牛血清（FCS）的DMEM稀释至100 µL体积。
    3. 感染3小时后，用1 mL DMEM洗涤3次（可使用真空泵）。随后在含10%胎牛血清的DMEM中加入250 µg/mL阿米卡星，处理1小时，以清除残留的胞外分枝杆菌。
      1. 在用1 mL DMEM再洗涤3次后，将培养物维持在含有250 µg/mL阿米卡星（溶于含10% FCS的DMEM）的1 mL终体积中，以抑制胞外分枝杆菌的增殖。
    4. 共培养72小时后，移除培养基，加入1 mL冷蒸馏水裂解巨噬细胞，在4 °C孵育30分钟。
    5. 在COS平板上进行菌落形成单位（CFU）检测，以评估细胞内细菌数量。
      1. 在24孔板中，向最前面两行各加入1 mL水。向第一孔加入100 µL共培养裂解液，使用微量移液器吹打混匀三次。吸取100 µL转移至第二孔。
      2. 使用新的枪头，从第二孔到第三孔重复稀释操作。 等等。 直至第十二孔。然后从10中吸取30 µL-12 稀释后加入COS培养板中。
      3. 对其他稀释度重复上述操作。用封口膜包裹COS平板，静置3-4天后观察并计数菌落。
  8. 插入位点的鉴定与测序 Tn 在 M. abscessus 突变体
    注：60个突变体需要1.5个月。
    1. 已鉴定样本的基因组提取 M. abscessus 突变体
      1. 在50 mL离心管中加入20 mL添加了0.2%甘油、1%葡萄糖和250 mg/mL卡那霉素的7H9培养基，将突变株培养至对数生长期（OD600=0.8).
      2. 收获 10 mL 培养物（2,396 × g，5 分钟）。弃去上清液。将细菌重悬于 500 µL 溶液 I（25% 蔗糖，50 mM Tris pH 8，10 mg/mL 溶菌酶，40 mM 硫脲）中。将溶液转移至带螺口盖的 2 mL 离心管中，于 37 °C 孵育 2 小时。
      3. 加入500 µL溶液II（25%蔗糖，50 mM Tris pH 8，50 mM EDTA）。用移液器上下吹打5–10次后，加入氧化锆珠，直至管内体积达到500 µL。
      4. 使用匀浆器进行细胞裂解（3次，每次6,000 rpm，45秒），每轮之间在冰上孵育1分钟。
      5. 加入5 µL 20 mg/mL蛋白酶K（终浓度100 µg/mL），55 °C过夜孵育样品。
      6. 在通风橱中加入1 mL冰冷的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）。涡旋混匀样品，随后在室温下以16,500 x g离心 g 30分钟。
      7. 离心后，收集水相，并在通风橱中加入等体积的冷酚/氯仿/异戊醇溶液。将样品在16,500 x g 30分钟，以再次回收水相。
      8. 在通风橱中，向回收的水相中加入0.7体积的室温异丙醇。缓慢倒置离心管以充分混匀，使DNA沉淀，室温孵育5分钟。随后在16,500 x g下离心10分钟。 g 以及室温（RT）。
      9. 去除上清液，在通风橱中用 500 µL 70% 乙醇洗涤沉淀。将离心管在 16,500 x g 条件下离心 10 分钟 g 在室温下放置，待乙醇去除后，孵育10分钟以使残留酒精挥发。
      10. 最后，将DNA沉淀重悬于100 µL无DNase/RNase的水中。使用分光光度计测定DNA的产量和纯度。
      11. 移除1 µg基因组DNA，并用10 U的 ClaI 用于亚克隆的过夜培养 Tn 插入位点。使用制造商提供的方案。
        注意： 克劳I酶是脓肿分枝杆菌基因组中限制性酶切位点最丰富的限制性内切酶之一（共2,173个限制性位点）。 克劳I 限制性位点也存在于 Tn 突变体中卡那霉素抗性盒上游的 Tn 序列中。因此，该 克劳I介导的亚克隆可用于鉴定Tn插入位点。
    2. 将含有 Tn 的基因组 DNA 亚克隆至质粒中
      注意：在继续操作之前 Tn-亚克隆至2,686 bp的pUC19氨苄青霉素抗性质粒中，添加一个 克劳在质粒的多克隆位点中存在 I 限制性酶切位点。pUC19 质粒的序列可通过以下链接获取：https://www.addgene.org/50005/sequences/。
      1. 按照制造商的说明，用限制性内切酶消化 pUC19 质粒 EcoR我与 后肢III，产生一个51 bp片段和一个2635 bp片段。使用商用PCR纯化试剂盒纯化双酶切载体，以去除释放的51 bp片段。
      2. 将1 µL（浓度为25 pmol/µL）的两种互补寡核苷酸（序列分别为5'AGCT TATA AGATCT TATA ATCGAT TATA3'和5'AAT TAA TAA TCG ATT ATA AGA TCT TAT A3'，各28 bp）混合，其中包含 克劳I 限制性酶切位点以及末端的 后肢III 和 EcoRI型限制性酶切位点。在100 °C加热10分钟，然后冷却以促进结合。
      3. 消化成对引物 EcoR我与 后肢III 按照制造商的说明书进行。
      4. 连接150 ng的 EcoRI/后肢III限制性pUC19质粒与不同浓度的成对引物（50 pmol/µL、25 pmol/µL、2.5 pmol/µL）在20 µL终体积中，加入1 U T4 DNA连接酶，于室温孵育1小时。通过不同的酶切消化验证克隆结果。
      5. 用限制性内切酶消化修饰后的质粒 克劳37 °C 下孵育 2 小时。
      6. 连接50 ng的 克劳I型限制性pUC19质粒和50 ng经Cla消化的基因组DNA在室温下用10 µL中含有1 U T4 DNA连接酶的溶液孵育1小时。
      7. 继续进行 E. coli 使用5-10 µL连接产物对电转感受态细菌进行电穿孔转化（2500 V，200 Ω，25 µF）。在含有50 µg/mL卡那霉素和50 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上筛选克隆，以获得携带含Tn序列片段的质粒的细菌。
      8. 在含有适当抗生素（50 µg/mL 卡那霉素和 50 µg/mL 氨苄青霉素）的 LB 液体培养基中过夜培养抗性克隆。
      9. 提取质粒DNA。通过酶切限制性酶切检测插入片段的存在，并对插入片段的3'端进行测序 Tn 通过与基因最后17个碱基对相对应的寡核苷酸（5' TTGACGAGTTCTTCTGA 3'）来鉴定发生断裂的基因 Tn 卡那霉素抗性盒
      10. 将序列与 M. abscessus 通过核苷酸序列比对（BLAST-N）分析GO 06株。

2. 用于RNA测序分析的胞内分枝杆菌RNA提取

注意：实验部分耗时4个月，RNA测序分析部分同样耗时4个月。

  1. 批量共培养阿米巴原虫与M. abscessus
    注意：在以下实验中，共培养在50 mL离心管中进行，并通过振荡促进细菌与细胞的接触。
    1. 在补充有0.2%甘油和1%葡萄糖的7H9培养基中，于120 rpm条件下将M. abscessus培养至对数中期。
    2. 用10 mL AC缓冲液洗涤细菌两次。
    3. 通过测定OD600nm 估算细菌浓度（1 OD600 = 4 × 108 条分枝杆菌）。将8.5 × 108 条分枝杆菌加入含8.5 × 106 个阿米巴原虫的10 mL AC培养基中。
    4. 在30 °C下轻轻振荡（约80 rpm）孵育1小时。
    5. 以253 × g离心12分钟收集细胞，弃去上清液，并将细胞重悬于10 mL AC缓冲液中。重复洗涤两次。
    6. 将细胞重悬于10 mL含50 µg/mL阿米卡星的AC缓冲液中，以消除胞外细菌，在30 °C下轻轻振荡（80 rpm）孵育4小时。再次洗涤细胞两次。
  2. 从胞内M. abscessus中提取总RNA
    注意：由于使用有毒试剂，步骤2.2.1–2.2.3需在通风橱内操作。
    1. 最后一次洗涤后，将感染的阿米巴原虫重悬于4 mL冷溶液III（表3）中，并新鲜加入280 µL β-巯基乙醇以裂解阿米巴原虫。此为硫氰酸胍（GTC）步骤。将悬液置于冰上10分钟。在4 °C、2,396 × g条件下离心30分钟，使释放出的胞内细菌形成沉淀。
    2. 弃去上清液，将细菌沉淀重悬于1 mL冷溶液III中。在4 °C、2,396 × g条件下离心30分钟收集细菌。将沉淀重悬于1 mL提取缓冲液中，转移至含有氧化锆珠的2 mL螺口管中（至管内500 µL刻度线处）。将样品管在-80 °C下至少储存24小时。
      注意：在裂解试剂中储存可使RNase失活并促进细胞溶解。
    3. 使用时，将样品置于冰上解冻，并用匀浆器进行裂解：以6,000 rpm运行两轮，每轮25秒，中间在冰上孵育1分钟；随后再以6,000 rpm运行一轮20秒。
    4. 为降低样品温度，将样品在冰上孵育10分钟。然后加入200 µL异戊醇稀释的氯仿。涡旋振荡1分钟后，在4 °C、16,500 × g条件下离心15分钟。
    5. 向水相中加入0.8 mL冷异丙醇，在20 °C下孵育2–3小时。在4 °C、16,500 × g条件下离心35分钟。弃去上清液。
    6. 加入500 µL冷70%乙醇洗涤RNA沉淀（不要混匀）。
    7. 在16,500 × g条件下离心10分钟以去除乙醇。吸除液体后，在离心浓缩仪中干燥。
    8. 干燥后，将沉淀重悬于100 µL无DNase/RNase的水中。
      注意：根据制造商建议，样品需用DNase处理两次，以去除DNA污染物。
    9. 在琼脂糖凝胶上检测RNA完整性，并通过基于微流控毛细管电泳芯片的方法测定RNA完整性数值（RIN）和核糖体比值以确认。
      注意：RIN综合考虑整个电泳图谱。RIN软件算法根据1至10的评分系统对总RNA进行分类，1表示降解最严重，10表示最完整。为进行cDNA文库构建，RIN值必须高于8，核糖体比值[28S/18S]应尽可能高，理想值为2，具体取决于生物体及其特性。
    10. 将RNA样品储存于-80 °C，直至进行测序用cDNA文库制备。
  3. cDNA文库制备
    1. 按照制造商说明书，使用市售的cDNA合成试剂盒（材料表）进行文库制备。
    2. 使用DNA芯片检测文库的浓度和质量。
      注意：可采用基于荧光的高灵敏度定量检测方法进行更精确和准确的定量。
  4. 文库测序
    1. 将样品归一化至2 nM，并根据流动池布局进行多重化处理。
    2. 在室温下用0.1 N NaOH处理5分钟，将样品变性至1 nM浓度。
    3. 将样品稀释至10 pM，每份样品以10 pM浓度上样至流动池。
    4. 使用高通量测序系统进行测序，该系统支持大规模基因组分析。本实验采用SRM模式运行（SR：单端读取，PE：双端读取，M：多重样品），共51个循环，读取7个索引碱基。
    5. 使用外部FastQC程序13评估测序质量。
    6. 在去除接头序列后，将测序读段比对至参考基因组。首先比对至真核细胞基因组以评估样品污染情况，如有必要，进一步去除非细菌来源的读段。
  5. 统计分析
    1. 使用多个在线可用的软件程序来鉴定差异表达基因集：R软件、Bioconductor软件包（包括DESeq2）以及由巴黎巴斯德研究所“转录组与表观基因组”平台"Transcriptome et Epigénome"开发的PF2tools软件包（版本1.2.12）。

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结果

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M. abscessus 能够抵抗并逃避免疫细胞（如巨噬细胞）和环境原生动物（如阿米巴）的杀菌反应。M. abscessus 在与阿米巴接触生长时会表达毒力因子，使其在小鼠中更具致病性4。本方法的首要目标是鉴定存在于 M. abscessus 中、使其能够在阿米巴内生存和增殖的基因。

为此，通过转座子（Tn）递送获得M. abscessus subsp.massiliense的突变体文库9，随后在存在阿米巴原虫的条件下进行共培养筛选，以鉴定在此胞内环境中生长减弱的突变体（图1）。还通过与巨噬细胞共培养评估了相同突变体的行为，以分析其生长减弱表型是否在小鼠巨噬细胞中得以保留。

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M. abscessus 的行为特征与慢生长分枝杆菌（SGM）如 M. tuberculosis 更为相似，而与其他属于快生长分枝杆菌（RGM）的分枝杆菌则差异较大2。SGM 致病性的关键因素在于其能够在抗原呈递细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）内存活甚至增殖。

M. abscessus 已经获得了一些基因组优势，这通过其基因组的全序列分析得以证实14，从而使其能够在真核吞噬细胞内存活。M. abscessus 的基因组表现出快速进化和高度可塑性的特征，包含许多近期插入的序列，例如前噬菌体和新基因15。尽管与 M. tuberculosis 相比，关于 M. abscessus 毒力因子的研究数据较少，但 M. abscessus 似乎能够迅速且主动地向增强毒力的方向进化。迄今为止，对 M. abscessus<...

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致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们非常感谢美国波士顿哈佛医学院的 E.J. Rubin 教授惠赠突变文库，感谢英国南安普顿大学医学院 Ben Marshall 博士对本文稿的校正。我们衷心感谢法国囊性纤维化患者协会“Vaincre la Mucoviscidose”和“L'Association Gregory Lemarchal”提供的经费支持（项目编号：RF20150501377）。同时感谢法国国家科研署（ANR）项目 DIMIVYR（ANR-13-BSV3-0007-01）以及法兰西岛大区“重大感染与新发疾病研究领域”（Domaine d'Intérêt Majeur Maladies Infectieuses et Emergentes）对 V.L-M. 博士后奖学金的资助。L. L. 为法国高等教育与研究部（Ministère de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche）资助的博士研究生。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
材料/设备名称
24孔板Thermofisher11874235
96孔板Thermofisher10687551
Beadbeater BertinPrecellys 24
BioanalyzerAgilent
Genepulser XcellBiorad
Nanodrop 分光光度计 2000Thermofisher
QuBit 荧光仪ThermofisherQ33226
氧化锆珠/二氧化硅珠Biospec products11079101Z珠子
试剂/细胞名称
Acanthamoeba castellanii ATCC30010菌株
阿米卡星 Mylan150927-A粉末
β-巯基乙醇 Sigma-AldrichM6250溶液
CaCl2Sigma-AldrichC1016>93% 颗粒状无水物
氯仿 Fluka25666溶液
ClaI 酶New England BiolabsR0197S酶
哥伦比亚琼脂 Biomerieux4304190 mm
D-葡萄糖Sigma-AldrichG8270 粉末
DMEM Thermofisher11500596培养基
无DNase和RNase的水 Invitrogen10977-035溶液
E. coli 电转感受态细胞 Thermofisher18265017细菌
EDTASigma-AldrichE4884粉末
Escherichia coli 临床分离株个人库存细菌
Fe(NH4)2(SO4)-6H20 EMS15505-404% 硫酸水溶液
胎牛血清Gibco10270血清
甘油Sigma-AldrichG5516溶液
硫氰酸胍 EuromedexEU0046-D粉末
异丙醇 Sigma-AldrichI9516溶液
J774.2 巨噬细胞Sigma-AldrichJ774.2菌株
卡那霉素 Sigma-Aldrich60615粉末
KH2PO4Sigma-AldrichP0662单碱式，无水
LB 液体培养基 Invitrogen12795-027粉末
溶菌酶Roche10837059001粉末
MgSO4LabosiM275纯品
Microbank TM（含珠冷冻管）Pro-Lab DiagnosticPL.170/M
Middlebrook 7H11 培养基Sigma-AldrichM0428粉末
Middlebrook 7H9 培养基Thermofisher11753473粉末
Müller-Hinton 琼脂Biorad3563901粉末
N-月桂酰肌氨酸MerckS37700 416粉末
Na2HPO4-7H2OSigma-AldrichS939098-102%
苯酚/氯仿 Sigma-Aldrich77617溶液
蛋白酶KThermofisherEO0491粉末
蛋白胨BD211684动物组织酶解产物
pUC19 质粒New England Biolabs54357质粒
SDS  20%Biorad1610418溶液
柠檬酸钠Calbiochem567446粉末
硫脲Sigma-Aldrich88810粉末
TrisSigma-Aldrich154563粉末
Trizol Thermofisher12044977溶液
吐温80Sigma-AldrichP1754 溶液
酵母提取物 BD212750
试剂盒
AMBION DNase 试剂盒 Thermofisher10792877试剂盒
DNA Agilent 芯片Agilent5067-1504试剂盒
GeneJET 质粒小提试剂盒 ThermofisherK0503试剂盒
PureLink PCR 纯化试剂盒InvitrogenK310001试剂盒
Quant-It" 检测试剂盒ThermofisherQ33140/Q32884试剂盒
T4 DNA 连接酶 InvitrogenY90001试剂盒
TruSeq Stranded RNA LT 建库试剂盒Illumina15032611试剂盒

参考文献

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