测试新型杀虫化学物质对蚊虫毒性的实验方案

摘要

本文描述了用于评估化学物质对幼蚊和成蚊毒性的实验方案，旨在开发新型的杀幼蚊剂、杀成蚊剂和内吸杀虫剂。这些方案支持对多种化学物质在单一剂量条件下进行高通量测试，并可通过剂量反应实验进一步评估其通过接触或摄食途径产生的毒性效应。

摘要

需要具有新颖作用机制的新类型杀虫剂，以控制传播寨卡病毒、登革热和疟疾等疾病的抗药性蚊虫种群。本文介绍了针对蚊虫幼虫和成虫的未配制新型化学物质进行快速、高通量分析的检测方法。我们描述了单点剂量和剂量反应检测的实验方案，用于评估小分子化学物质对蚊虫的毒性 Aedes aegypti 寨卡病毒、登革热和黄热病的传播媒介 疟疾传播媒介， Anopheles gambiae 以及北方家蚊， 致倦库蚊 通过接触和摄食途径。例如，我们通过幼虫试验、成虫局部施用试验和成虫吸血试验，评估了阿米替林（amitriptyline）——一种G蛋白偶联受体的小分子拮抗剂——的毒性。这些实验方案为探究杀虫潜力提供了起点。文中结合进一步实验，讨论了结果在产品应用及递送机制研究中的意义。

引言

蚊子传播影响全球人类健康的传染病病原体¹。影响人类健康的三种最重要蚊属为Aedes、Anopheles和Culex。Aedes蚊种传播引起寨卡病毒病、登革热、黄热病和基孔肯雅热的虫媒病毒。Anopheles蚊种传播疟原虫，Culex蚊种传播西尼罗病毒和丝虫线虫²。世界卫生组织（WHO）已提出到2020年根除十种被忽视的热带病（NTD）的目标³，并确定蚊虫控制为最可行的策略。杀虫剂是控制蚊虫并减少疾病传播的有力工具^4,5。然而，杀虫剂抗性蚊群的出现威胁着多种疾病的持续防控^6,7,8。创新媒介控制联盟（IVCC）已启动首个专门致力于开发用于蚊虫控制的替代杀虫剂的项目⁹。为实现世卫组织的目标并有效控制疾病，亟需具有新颖作用方式（MoA）的新杀虫剂。发现和开发具有新颖作用方式的新杀虫剂类别，需要采用整体生物测定方法，以实现对化合物进行快速、高通量的分析，并与行业标准进行比较¹⁰。

有多种检测方法可用于评估杀虫剂对蚊虫幼虫和成虫的驱避性及毒性，其中一些方法适用于新型已配制或未配制化学物质的评价。世界卫生组织（WHO）标准操作程序¹¹ 是一种用于检测产品对四龄幼虫作用的接触试验。已发表的研究还描述了多种幼虫试验方法，用于检测小分子化合物对幼虫的毒性。 埃及伊蚊，冈比亚按蚊 和 致倦库蚊^{10,12,13,14,15,16}疾病控制与预防中心（CDC）瓶饲法通过评估致死浓度（LC）和致死时间（LT），并与商用杀虫剂的标准诊断剂量进行比较，用于检测野外捕获的成蚊种群对杀虫剂的抗性水平¹⁷世界卫生组织（WHO）敏感性测试提供了另一种评估成蚊杀虫剂抗性的方法，该方法将蚊子置于含有杀虫剂浸渍滤纸的玻璃小瓶中暴露1小时，随后在24小时时评估死亡率。¹⁸其他检测方法将喷雾制剂喷洒于密闭笼内，并在预定时间点记录蚊虫的击倒和死亡情况¹⁹通过在蚊子胸部进行局部施用，已用于评估不同杀虫剂的效力²⁰利物浦昆虫测试机构（LITE）²¹ 采用标准操作程序 用于评估化学物质对成蚊的生物活性。LITE成蚊局部施用试验通过将少量待测产品施加于成蚊胸部，并在48小时后记录死亡率，从而实现对每只蚊虫实际接收剂量的定量分析²¹LITE 趾垫试验用于评估受试产品对停留在化学处理表面的成蚊的毒性，可用于鉴定适于开发为室内滞留喷洒剂（IRS）或用于杀虫剂处理蚊帐（ITN）以控制蚊媒的候选化合物 按蚊属 蚊子。

世界卫生组织（WHO）和美国疾病控制与预防中心（CDC）的检测方法在测试新型、未配制的化学物质时存在局限性，而CDC瓶式生物测定法的目的是在较短的检测周期（两小时）内评估敏感性，而非毒性^22,23此外，还可通过检测血液餐中递送化学物质的毒性，以及评估开发具有全身作用效果产品的潜力，来开展相关检测。即， 内吸杀虫剂）尚缺乏。本文介绍了检测新型化学物质对蚊虫幼虫和成虫杀灭活性的实验方法，这些化学物质可溶于水或多种有机溶剂之一。 伊蚊，按蚊 和 库蚊首先，我们展示一种先前由本研究组描述的幼虫实验方法^10,12,13,16，此处用于：（1）通过单点剂量快速评估多种化合物的活性；（2）进行剂量反应实验，以确定致死浓度（例如， 液相色谱_50, 液相色谱₇₅ 或 LC_90,一种单一化学物质的测定。接下来，我们描述两种用于测定致死剂量（LD）的成蚊检测方法。第一种方法是对LITE方案的改进，用于将新型外用化学物质与阳性对照相比，测试其对成蚊的效果。第二种方法是通过血液餐递送化学物质的摄食检测法。

方案

注意：以下方案中所述工作所需的所有菌株和试剂及其供应商均列于材料表中。

1. 蚊子幼虫和成虫的培养

注意：易感杀虫剂的蚊子品系可从疟疾研究与试剂参考库获取。推荐品系如下：Aedes aegypti 利物浦（LVP）品系、Anopheles gambiae 基苏木（KISUMU1）品系和 Culex quinquefasciatus 约翰内斯堡（JHB）品系。

1. 按照 Nuss²⁹ 所述方法，在 28 °C 和 75–85% 相对湿度（RH）条件下，将蚊子幼虫卵置于 25 cm × 40 cm 的塑料托盘中（每盘约 400 条幼虫），在 12 小时光照/12 小时黑暗的光周期下培养。幼虫饲喂磨碎的沙鼠饲料（用于埃及伊蚊 A. aegypti 和冈比亚按蚊 An. gambiae）或片状鱼粮（用于致倦库蚊 C. quinquefasciatus）。进行幼虫实验时，采集处于三龄幼虫（L3）阶段的幼虫。
2. 将蛹转移至塑料杯中，在上述条件下于昆虫饲养室内的 20 L 塑料笼中培育成成蚊。按照其他文献²⁹ 所述方法，以 20% 蔗糖溶液维持成蚊生长。在羽化后 3–5 天收集成蚊。

2. 幼虫接触实验（单点剂量或剂量反应实验）

注意：该检测可使用溶于水或二甲基亚砜（DMSO）的化合物进行，前提是检测孔中DMSO的终浓度不超过1%。其他溶剂也可考虑，但必须首先确认其终浓度在暴露72小时后不会导致超过10%的死亡率。该检测可作为单点剂量检测或剂量-反应检测进行。若进行后者，建议测试一系列浓度（至少五个），覆盖预期的LC₅₀范围。

1. 将透明的24孔细胞培养板的各孔按如下所示进行标记 图1.
2. 在1.5 mL离心管中配制待测化学品的储备溶液。
   1. 使用分析天平称量每种化学试剂，并根据其溶解特性，用无菌 ddH₂O 重悬。₂O，DMSO 或其他合适的有机溶剂（参见 图2).
      注意：计算时应考虑化学物质的纯度。例如，对于纯度为99%的化学物质，将10.1 mg溶解于1,000 µL丙酮中，可得到1%的溶液。用封口膜密封后，于-20 °C保存。 
3. 确定待评估的测试化学品的最终浓度，并使用适当的溶剂从储备液相应地制备系列稀释液。
   注意：化学物质的浓度和溶剂体积可通过公式 C₁*V₁= C₂*V₂ 其中 C₁=样品1的浓度，C₂=样品2的浓度，V₁= 样品1的体积和V₂= 样本2的体积。参见所示的示例计算 图2 和 表1.
   1. 配制10 mM的储备液，并根据需要进行系列稀释，以获得所需的测试浓度（表1B).
4. 使用宽口塑料移液管，将五条L3期幼虫转移至组织培养检测板的孔中；L3期幼虫可根据其体长（约2.5–3.5 mm）和头壳宽度（约0.025 mm）进行识别²⁴用1 mL移液器轻轻吸去水分，并替换为所需体积的ddH₂O₂O（见下文）。每种处理重复操作，以获得 n = 4 的技术重复（即， 每处理组共20只幼虫。
5. 向24孔测试板中的四个重复孔分别加入适量的待测化学品，轻轻摇动平板以确保化学品均匀混合。将平板置于恒定条件的测试或培养环境中。例如， 建议温度为 25 °C，相对湿度约为 75–85%，并尽可能维持 12 小时光照/12 小时黑暗的光周期。
   注意：为了确保实验间的可重复性，后续检测应在相同的环境条件下进行。
6. 在暴露后30分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、24小时、48小时和72小时（或其它指定时间点），记录每孔中死亡/无反应幼虫的数量，并填写在评分表上表2）。轻敲培养板侧面，若无活动迹象，再用无菌牙签轻轻触碰幼虫。将对敲击或触碰无反应的幼虫记为 "死亡".
   注意：可能观察到其他形态学和行为学表型，可进行记录。
7. 如有需要，可使用修正的Abbott公式校正对照组死亡率，方法如下：
   死亡率（%）= (X - Y) × 100 / (100 - Y)
   其中，X = 处理样本中的死亡率百分比，Y = 对照组中的死亡率百分比。
8. 使用GraphPad Prism 6或类似软件，将结果绘制成直方图或对数曲线。 并计算相对于对照组的致死浓度（LC）值。
9. 使用另一批蚊子重复实验，以获得 n = 3 或更多的生物学重复。

3. 成虫外用实验（单点剂量或剂量反应实验）

注意：成虫外用实验采用丙酮作为溶剂。也可选用其他溶剂，但必须首先确认最终浓度在暴露后48小时内的致死率不超过10%。该实验可作为单剂量点或剂量反应实验进行，用于确定致死剂量（LD）。若进行后者，建议测试一系列浓度（至少五个），覆盖预期的LD₅₀范围。

1. 确定完成该检测所需的成年雌性蚊子数量。
   注意：单个化合物的单剂量检测至少需要90只蚊子（30只用于阳性对照，30只用于仅含丙酮的阴性对照，30只用于待测化合物）。
2. 培养3至5日龄的成年雌性蚊子，并使用吸虫器将其转移至单独的20 mL塑料杯中（图3）。
3. 用待测化合物的名称和浓度标记9盎司纸杯。为每个纸杯准备10 cm × 10 cm的纱网片和橡皮筋（见 图4）。
4. 选择一种现有杀虫剂作为阳性对照（例如，合成拟除虫菊酯类杀虫剂联苯菊酯），用丙酮配制1%的储备液（10 µg/µL）。
   注意：计算时应考虑化合物的纯度。例如，对于纯度为99%的化合物，将10.1 mg溶解于1,000 µL丙酮中，即可获得1%的溶液。用石蜡膜密封后，于-20 °C保存。
5. 采用与上述相同的方法，配制待测化合物的储备液。
   注意：许多待测化合物化学性质不稳定，建议每次进行生物测定前新鲜配制溶液。
6. 使用先前用丙酮冲洗过的20 mL玻璃小瓶，从储备液中按 图5 所示方法配制阳性对照和待测化合物的系列稀释液。
7. 用丙酮冲洗1 mL玻璃注射器，再用丙酮充满，并将其固定在微量施用器上，调整至可递送0.25 µL体积。
8. 以每批10只为单位，使用吸虫器从笼中取出3–5日龄的成年雌性蚊子，在冰箱或冰上于4 °C下麻醉最多5分钟。随后将蚊子转移至培养皿中，并置于冰上最多10分钟。
9. 迅速操作，用精细镊子夹取一只雌蚊，使用注射器微量施用器将0.25 µL待测溶液施加至其背部胸节。通过解剖显微镜观察确认化合物已成功递送，确保每只蚊子均接受准确体积的待测化合物。
10. 将处理后的蚊子转移至置于冰上的已标记纸杯中，重复操作共10次，以获得n = 10只处理蚊子。用纱网片覆盖杯口，并用橡皮筋固定密封，随后将纸杯转移至塑料箱或培养箱中，在恒定条件（28 °C，75–85%相对湿度，建议采用12小时光照/12小时黑暗循环）下培养。
11. 重复上述实验两次，以获得每个处理组或对照组n = 3个技术重复（即，总共30只蚊子）。
12. 依次对测试化合物和阳性对照重复步骤3.7–3.10。
    注意：若蚊子数量充足，可增设另一项有用的对照，即一组不接受任何测试化合物或溶剂的30只麻醉蚊子，作为"空白"对照。
13. 在暴露后30分钟、60分钟、2小时、24小时和48小时（或其他替代时间点），使用评分表（表3）记录"死亡/无反应"蚊子的数量。若蚊子无活动能力，表现为侧卧或仰卧且无法飞行，则记为"死亡/无反应"。
14. 如需校正对照组死亡率，可采用修正的阿伯特公式计算：
    死亡率（%）= (X - Y) × 100 / (100 - Y)，
    其中X = 处理组的死亡率百分比，Y = 对照组的死亡率百分比。
15. 以直方图或指数曲线形式展示结果。对于剂量反应检测，计算待测化合物相对于对照的LD₅₀、LD₇₅或LD₉₀值。
16. 至少重复该检测两次，使用不同批次的蚊子，以获得n = 3或更多的生物学重复。

4. 成虫吸血实验（单点剂量或剂量反应实验）

1. 收集约150只4至5日龄的成年雌性蚊子，并转移至单独的笼子中。若进行剂量反应实验，重复此步骤以获得6个笼子。在喂食实验前1至24小时移除糖源。
2. 按照前述方法配制化合物的储备液（需根据化合物纯度进行校正，典型储备液浓度为80 mM，溶于水或盐缓冲液中），然后根据需要在水或缓冲液中进行系列稀释。
3. 将每种稀释液各取40 µL加入960 µL脱纤维兔血中，以获得所需测试浓度。将膜片覆盖于饲喂装置上，并用橡胶圈密封。用移液器转移1 mL血液，将饲喂装置连接至加热装置。
4. 用新鲜配制的10%乳酸溶液轻轻擦拭膜表面，将饲喂装置放入成蚊笼中。用深色布料或黑色垃圾袋覆盖笼子，让蚊子自由取食一小时。
5. 对剩余的测试溶液及阴性对照（仅含血液）重复步骤4.2至4.4。
6. 喂食结束后，将笼子置于4 °C冰箱中5分钟以麻醉蚊子。移除雄蚊及未吸血的雌蚊，通过观察腹部判断并记录吸血完全和部分吸血的蚊子总数。
7. 保留部分吸血和完全吸血的雌蚊，每剂量组至少保留50只吸血雌蚊。
8. 将笼子转移至塑料桶或培养室中，在恒定条件下（28 °C，75–85%相对湿度）饲养，建议采用12小时光照/12小时黑暗循环。
9. 在喂血后0.5、1、1.5、2、24、48和72小时（或根据需要选择其他时间点），使用评分表（表4）记录各时间点死亡或无反应蚊子的总数。
10. 在吸血后第三天，向笼中放入产卵杯，连续收集72小时内的卵。在解剖显微镜下计数每种处理组产生的总卵数。
11. 根据每组处理及对照组中吸血雌蚊总数，计算死亡率和生殖力（产卵量）。如需，可使用修正的Abbott公式校正对照组死亡率。
12. 使用所选软件将毒性与生殖力数据绘制成直方图或指数曲线（若进行剂量反应实验），并计算测试化合物相对于对照的LD₅₀、LD₇₅或LD₉₀值。
13. 至少重复实验两次，使用不同批次的蚊子，以获得n = 3或更多的生物学重复。

结果

图6 显示L3的死亡率百分比 埃及伊蚊 在暴露于多巴胺受体拮抗剂阿米替林五个剂量后，分别于24、48和72小时与仅含水的阴性对照组比较。在此示例中，各时间点收集的数据均呈现典型的对数曲线，揭示阿米替林对幼虫死亡率具有剂量依赖性效应。LC₅₀ 数值随着实验时间的推移而降低，可利用72小时的数据进行计算（即， 对数曲线的中点。

图7显示了埃及伊蚊（Ae. aegypti）3至5日龄成年雌蚊在接触400 µM剂量（10 µg/µL）的多巴胺受体拮抗剂阿米替林后的死亡率百分比，并与合成拟除虫菊酯类杀虫剂联苯菊酯阳性对照（原药；500 pg/µL）、仅丙酮阴性对照以及未处理蚊虫（空白对照）进行比较。本示例中，阿米替林和联苯菊酯均导致显著的成蚊死亡率，相较于阴性对照具有明显差异。请注意，成蚊死亡率随时间推移而下降，推测是由于测试化合物被代谢解毒所致。

图8显示了饲喂含有四种不同浓度多巴胺受体拮抗剂阿米替林（amitriptyline）血餐的3-5日龄成年雌性Ae. aegypti蚊子的死亡率百分比（左侧y轴），以及暴露后第一个生殖营养周期的繁殖力（右侧y轴；每只雌蚊平均产卵数），并与对照组蚊子（仅饲喂血液；阴性对照）进行比较。数据表明，与对照组相比，阿米替林对成蚊死亡率无显著影响，但在最高剂量（400 µM）下可显著提高繁殖力。

图1．幼虫剂量反应实验的设置。 图像显示使用埃及伊蚊（Aedes aegypti）L3期幼虫在24孔板中进行的幼虫剂量反应实验设置情况。

图2。在24孔板中进行（A）单点剂量或（B）剂量-反应幼虫检测实验的流程示意图。 将五条L3期幼虫转移至各孔后，用移液器轻轻吸除多余水分，并替换为新鲜的无菌ddH₂O。随后，配制待测化合物的母液及系列稀释液，并加入孔中，使每孔终体积为1 mL。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3．成蚊培养。 图像显示用于成蚊培养的 20 L 塑料桶，以及使用吸虫器移除蚊虫的过程。

图 4．使用 4–5 日龄雌性Aedes aegypti进行的成蚊触杀试验。处理化学药剂或溶剂后，将成蚊放入纸杯中，并转移至测试室中进行整个试验过程。

图 5．储备液与系列稀释液。 示意图展示成年蚊虫局部施用试验中（A）储备液和（B）系列测试溶液的配制流程。请点击此处查看该图的放大版本。

图6。幼虫接触剂量反应实验的代表性数据。 幼虫接触剂量反应实验的代表性数据，显示埃及伊蚊（Aedes aegypti）L3幼虫在暴露于多巴胺受体拮抗剂阿米替林后24、48和72小时的死亡率百分比。每个数据点代表以µM为单位的均值 ± 标准误（SEM）。数据来自n = 3次生物学重复实验。

图7成人局部剂量反应实验的代表性数据。 来自成年个体局部剂量反应实验的代表性数据，显示多巴胺受体拮抗剂阿米替林（10 µg/µL）对3-5日龄雌性个体的毒性作用 埃及伊蚊 相对于拟除虫菊酯类化合物联苯菊酯（500 pg/µL，阳性对照）及阴性对照（仅含丙酮溶剂）在2、24和48小时. 数据代表3次生物学重复实验。误差线表示标准误。

图 8．成虫摄食实验的代表性数据。 来自成虫摄食实验的代表性数据，显示多巴胺受体拮抗剂阿米替林在 100 µM、200 µM 和 400 µM 剂量下对 3 至 5 日龄雌性埃及伊蚊（Aedes aegypti）的毒性作用及其对生殖力的影响（以首个 gonotrophic 周期内每只雌蚊的平均总产卵数表示）。数据代表 n = 3 次生物学重复实验，误差条表示 ± 标准误（SEM）。

A. 三种化学物质的单点剂量实验
化学物质	浓度（400 µM）
Amitriptyline	80 mM 储备液：2 mg 阿米替林 × 98%（粉末纯度）× 0.001 g/1 mg × 1 mol /313.86 g × 1 L/0.08 mol × 106 µL/L = 78.06 µL 水。
	系列稀释：用 ddH2O 将储备液按 1:2 稀释，再按 1:4 稀释，得到 10 mM 溶液。取 40 µL 的 10 mM 储备液加入含有 960 µL ddH2O 的孔中，使终浓度为 400 µM/孔。将 10 mM 储备液按 1:2 进行系列稀释，制备 5 mM、2.5 mM、1.25 mM 和 0.625 mM 的储备液。
Cis-(z)-flupenthixol	80 mM 储备液：2 mg cis(z)-氟奋乃静 × 98%（粉末纯度）× 0.001 g/1 mg × 1 mol/507.44 g cis(z)-氟奋乃静 × 1 L/0.08 mol × 106 µL/L = 48.28 µL 水。
	系列稀释：同上。
Amitraz	80 mM 储备液：2 mg 螨螨净 × 0.001 g/1 mg × 1 mol/293.4 g 螨螨净 × 1 L/0.08 mol × 106 µL/1 L = 85.21 µL DMSO（注意：螨螨净仅溶于 DMSO）。
	系列稀释：同上。
B. 剂量反应实验
化学物质	剂量 1	剂量 2	剂量 3	剂量 4	剂量 5
	400 µM	200 µM	100 µM	50 µM	25 µM
例如：Amitriptyline、cis-(Z)-flupenthixol 或 amitraz	40 µL	40 µL	40 µL	40 µL	40 µL
	10 mM 储备液	5 mM 储备液	2.5 mM 储备液	1.25 mM 储备液	0.625 mM 储备液

表1. 埃及伊蚊（Aedes aegypti）L3幼虫（A）单点剂量检测和（B）剂量反应检测的示例计算。

表 2. 用于记录蚊子幼虫剂量反应实验数据的示例评分表。 对照组为仅含水、或含1% DMSO或其他溶剂的水溶液。测试小分子拮抗剂化合物（如阿米替林）时常用的剂量为 25 µM、50 µM、100 µM、200 µM 和 400 µM。

蚊虫成虫（3-5日龄）表面施用实验
实验开始日期：
研究人员：
物种/品系：
实验类型：单点剂量/剂量反应
A. 死亡数（死亡蚊虫数量）
时间（小时）	剂量1	剂量2	剂量3	剂量4	剂量5	对照组
0.5
1
1.5
2
2.5
B. 死亡率（百分比）
时间（小时）	剂量1	剂量2	剂量3	剂量4	剂量5	对照组
0.5
1
1.5
2
2.5

表3. 用于记录成年个体外用剂量反应实验数据的评分表示例。

蚊虫成虫（3-5日龄）摄食实验
实验开始日期：
实验人员：
物种/品系：
实验类型：单点剂量/剂量反应
A. 摄食蚊虫数量
	剂量1	剂量2	剂量3	剂量4	剂量5	对照组
已摄食
未摄食
总计
摄食百分比
未摄食百分比
B. 死亡率（死亡蚊虫数量）
时间（小时）	剂量1	剂量2	剂量3	剂量4	剂量5	对照组
2
24
48
72
C. 死亡率百分比
时间（小时）	剂量1	剂量2	剂量3	剂量4	剂量5	对照组
2
24
48
72

表4. 用于记录成年蚊虫吸血实验数据的示例评分表。 测试小分子拮抗剂化合物（如阿米替林）的典型剂量为 50 µM、100 µM、200 µM 和 400 µM。

讨论

杀虫剂是防控疟疾等蚊媒疾病的重要工具²⁵登革热和寨卡病毒²⁶大量使用杀虫剂已导致蚊虫种群对化学防治产生抗性，从而引发杀虫剂抗性的形成，这被认为是持续控制疾病面临的最大威胁。过去十年中，蚊虫种群数量急剧增加 按蚊属 对非洲蚊帐中使用的合成拟除虫菊酯（SPs）具有抗性的 spp.⁷. 种群 白纹伊蚊， 在佛罗里达州和新泽西州已发现对有机磷类杀虫剂具有抗性的登革热和寨卡病毒传播媒介⁶同样，已在种群中记录到对 DDT 和拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性 按蚊属 和 伊蚊 哥伦比亚的 spp.^27,28迫切需要开发新的幼虫杀灭剂和成虫杀灭剂，这些杀灭剂可结合已知分子靶点上的多种正构位点或变构位点，或干扰新的靶点即， 新颖的作用机制化学物质^29,30 且对环境影响极小。此外，人们对利用内吸杀虫剂进行蚊虫控制的潜力也日益重视。^31,32,33.

为了促进此类产品的快速开发，我们描述了一系列实验方案，旨在通过接触和摄食两种给药途径，评估小分子化合物对蚊虫幼虫和成虫的毒性。世界卫生组织（WHO）敏感性试验和美国疾病控制与预防中心（CDC）瓶饲法等方案目前常用于评价现有杀虫制剂的毒性和驱避性^1,2。然而，这些方法在分析未经配方处理的新化学实体（NCEs）时存在局限性，且难以适用于中高通量条件下大量化合物的筛选测试。

在此，我们描述了一种标准的幼虫实验方法，可用于快速评估新化学实体（NCEs）在单点剂量下的活性，并可扩展用于高通量分析。我们还描述了一种对LITE开发的实验方法的改进版本²¹ 用于评估小分子化学物质对成年蚊虫的接触毒性。最后，我们描述了一种摄食实验，用于评估通过血液餐供给成年雌蚊的新型化学实体（NCEs）的毒性，并探讨其作为内服杀虫剂的潜力。这些幼虫和成虫实验可在一系列剂量下进行，以分别确定LC值和LD值；幼虫和成虫接触实验均可与一种或多种现有化学制剂进行比较。成虫局部给药实验还可实现对单只蚊虫LD值的计算。这些实验方案可用于多种蚊种 伊蚊，按蚊 和 库蚊^16,29 可根据需要修改，以适应特定物种的生物学特性。根据我们的经验，灭蚊化学物质通常在这三个属中均表现出广泛的活性。^16,29，但评估物种选择性具有重要意义。

这些检测方法可作为快速筛选多种化学物质杀虫活性的起点。在一种或多种检测中表现出毒性的化学物质可被选中，进一步通过二级和三级检测进行分析。例如LITE跗节检测和糖饲检测^34,35。额外检测方法的选择通常取决于预期市场和应用场景，检测结果可为潜在的产品递送方式提供参考。在本文展示的代表性结果中，我们探讨了阿米替林（amitriptyline）的毒性作用；阿米替林是一种哺乳动物和无脊椎动物多巴胺受体拮抗剂，已被评估作为新型作用机制（MoA）杀虫剂的潜力^10,12,13,16。阿米替林在微克（μg）浓度范围内对埃及伊蚊（Ae. aegypti）的幼虫和成虫均表现出毒性，提示其具有杀幼虫和杀成虫的活性，并为进一步探索基于阿米替林的化合物系列、以寻找高活性类似物提供了依据。在血液餐中暴露于阿米替林的埃及伊蚊（Ae. aegypti）中，未观察到其对死亡率或生殖力有显著影响。尽管该化学物质在去纤维化血液中的稳定性以及每只蚊子实际摄入的有效剂量尚不明确，但考虑到检测方法的显著局限性，这些数据表明阿米替林及其他作用于G蛋白偶联受体（GPCR）的化合物在未配方状态下可能作为内吸杀虫剂（endectocides）的潜力有限。

为限制不同实验之间的生物学变异，采取预防措施至关重要。所有实验均应在标准的温度和湿度条件下进行，最好在昆虫培养室中操作，以确保实验结果的可重复性。对表型终点的评分方法必须进行标准化，因为这些评估可能具有高度主观性，不同实验人员记录的数据可能存在显著差异。幼虫实验最适合用于评估可溶于水的化合物，尽管也可使用有机溶剂（如DMSO）进行实验，前提是每孔中溶剂的终浓度低于1%。我们认识到成虫点滴法存在若干局限性。首先，在配制系列稀释液和给药时必须快速操作，因为载体（丙酮）具有高挥发性，蒸发可能导致实际给药量出现差异。其次，应尽量缩短麻醉时间，以避免其对死亡率造成影响。还应注意，丙酮等溶剂在点滴实验开始后的最初几小时内可能引起快速的"击倒"效应，不应将其与测试化合物本身的作用相混淆。我们注意到，蚊虫个体间血餐体积存在差异，这使得在成虫摄食实验中难以准确评估每只成虫所摄入的剂量。最后，若阴性对照组的死亡率超过10%，则该实验数据不应被采纳。

具有协同作用的产品因其能够扩展现有产品的用途并控制杀虫剂抗性害虫种群而日益受到重视^15,16,36。幼虫生物测定已被用于研究甲脒类杀虫剂胺甲萘（amitraz）与多种作用于无脊椎动物章胺受体的化学物质之间的协同效应^14,15。本文所述的幼虫测定法以及成虫触杀测定法适用于评估不同测试化学物质组合之间的协同或相加效应。需要注意的是，诸如增效醚（piperonyl butoxide, PBO）等增效剂可被纳入本文描述的三种测定方法中的每一种。

上述所述的检测方法为评估未经配方处理的小分子药物对水生和陆生蚊虫生活阶段的作用提供了一套标准化的实验流程。这些检测方法专门用于评估药物毒性，相较于目前常用的检测方法具有多项优势。重要的是，这些方法适用于自动化操作，可在工业规模下进行，从而实现对数千种测试化合物的高效评估。最后，随着领域内逐步推进作用机制新颖的产品开发——包括作用于新分子靶点和生化通路的干预手段——除了死亡率和麻痹等传统指标外，对多种表型终点进行评分将变得至关重要。上述检测体系支持此类研究，因而为迈向未来高度创新的杀虫技术提供了重要一步。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
对杀虫剂敏感的蚊虫品系	疟疾研究与试剂参考库	https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx；推荐品系：埃及伊蚊利物浦（LVP）品系、冈比亚按蚊科苏木（KISUMU1）品系和致倦库蚊约翰内斯堡（JHB）品系
丙酮	Mallinckrodt Chemical	CAS 67-64-1	用于稀释和对照
阿米特拉嗪	Sigma-Aldrich	CAS 33089-61-1	需用DMSO稀释
阿米替林	Sigma-Aldrich	CAS：549-18-8	可用丙酮稀释
联苯菊酯	Sigma-Aldrich	CAS：51529-01-2	用作阳性对照的合成拟除虫菊酯
顺式-(Z)-氟哌噻吨	Sigma-Aldrich	CAS：51529-01-2	作为多巴胺样受体干扰剂进行药理学测试
去纤维蛋白兔血	止血钳	DRB0100	适应人工饲喂的蚊虫血液来源
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	MKBF2985	用于溶解阿米特拉兹的有机溶剂
Hemotek 膜饲系统	Hemotek有限公司	序列号 1303	用于喂食蚊子
微施用器	Burkard Manufacturing Co.	-	进行局部应用实验所需的工具
24孔细胞培养板（带盖）	康宁公司	3526	-
Advantage 橡胶带	Alliance Rubber Co.	-	用于密封纸杯
玻璃注射器（1 ml）	贝克顿·迪金森公司	512004	微应用所需。玻璃优于塑料
一次性闪烁瓶（20 ml）	Fisher Scientific	74505-20	玻璃瓶可防止蒸发
白色纱布织物	沃尔玛	-	-
纸杯	Dixie Consumer Products LLC	PF15675/13D	用于在成蚊局部实验中饲养成蚊
培养皿（150 mm）	康宁生命科学	-	用于维持蚊虫的生存 "睡眠" 在低温环境中，避免与冰直接接触
移液管	Fisher Scientific	13-711-7M	用于分选幼虫
体视显微镜	Olympus	SZ6045	用于幼虫实验评分和微操作应用
镊子（精细）	Fontax	-	用于处理成年蚊子