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方法文章

用于小鼠心脏研究的光片荧光显微镜技术

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DOI：

10.3791/57769

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2018年9月15日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of California Los Angeles, 2Department of Bioengineering, University of Texas at Arlington, 3School of Optical and Electronic Information, Huazhong University of Science and Technology, 4Department of Biomedical Engineering, OSHU

本文内容

摘要

本研究采用双侧照射光片荧光显微镜（LSFM）技术结合光学透明化方法，对小鼠心脏进行研究。

摘要

光片荧光显微镜已广泛用于在微米至毫米尺度上快速获取具有高轴向分辨率的图像。传统的光片技术采用单束照明光垂直照射样品组织。使用单束照明光对大尺寸样品成像时，由于组织对光的散射和吸收，图像中会出现条纹或伪影，并导致分辨率降低。本研究采用双侧照明光束结合简化的CLARITY光学透明技术，对小鼠心脏进行处理。这些技术通过清除心脏中的脂质，实现更深层的成像，并获得超过10 × 10 × 10 mm3的大视野成像范围。因此，该策略使我们能够定量分析心室尺寸，追踪心肌细胞谱系，并在从出生后到成年小鼠心脏中，以足够的对比度和分辨率定位心脏特异性蛋白和离子通道的空间分布。

引言

光片荧光显微镜是一种最早于1903年开发的技术，如今被用于研究基因表达，以及构建组织样本的三维（3-D）或四维（4-D）模型1,2,3。该成像方法利用一束薄层光线照射样本的单一层平面，使探测器仅捕获该平面的图像。随后可通过沿轴向移动样本，逐层采集每一断面的图像，并在对所获取图像进行后期处理后重建出三维模型4。然而，由于光子的吸收和散射效应，光片荧光显微镜的应用目前仅限于厚度为数微米或光学透明的样本1。

光片荧光显微镜（LSFM）的局限性促使研究人员广泛选择组织光学透明的生物体进行研究，例如斑马鱼。由于人类与斑马鱼之间存在保守的基因，涉及心脏发育和分化的研究通常以斑马鱼为模型5,6。尽管这些研究推动了与心肌病相关的心脏研究进展6,7，但仍需在哺乳动物等更高等的生物体上开展类似研究。

由于哺乳动物心脏组织较厚且不透明，红细胞中的血红蛋白会造成光吸收，同时在传统的光片显微镜（LSFM）方法下单侧照明会导致条纹伪影，因此成像具有挑战性1,8。为克服这些局限性，我们提出采用双侧照明，并结合简化版的CLARITY技术9与折射率匹配溶液（RIMS）。因此，该系统能够对体积超过10 × 10 × 10 mm3的样本进行成像，同时在轴向和侧向平面上保持良好的分辨率8。

首先使用排列在玻璃管内不同构型的荧光微球对该系统进行校准。随后，利用该系统对新生期和成年小鼠心脏进行成像。首先，在出生后7天（P7）对新生小鼠心脏进行成像，以显示心室腔、心室壁厚度、瓣膜结构以及小梁的存在情况。其次，通过使用出生后1天（P1）携带Cre标记的心肌细胞和黄色荧光蛋白（YFP）的新生小鼠心脏，开展研究以鉴定将分化为心肌细胞的细胞。最后，对7.5个月大的成年小鼠进行成像，以观察基因治疗后肾外髓钾（ROMK）通道的存在情况8。

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方案

所有涉及动物使用的操作程序均已获得加利福尼亚大学洛杉矶分校机构审查委员会（IACUC）的批准。

1. 成像系统设置

注意：参见图1和图2。

  1. 取一个具有三个波长的连续波（CW）激光器：405 nm、473 nm 和 532 nm。将两个反射镜（M1 和 M2）相距 150 mm 放置，并将其镜面与光束成 45° 对齐。
    注意：此步骤用于将激光从双侧照明装置中偏转出去。所得光束方向将与初始光束方向相同。
  2. 使光束依次通过一个直径为 25 mm 的虹膜光阑/针孔（PH）、一个直径为 50 mm 的中性密度滤光片（NDF）（光密度范围为 0 - 4.0）、一个扩束器（BE）、一个宽度约为 0 - 6 mm 的 30 mm 狭缝（S）以及一个反射镜（M3），所有元件之间相距 150 mm。将反射镜放置为其镜面与光束成 45°。
  3. 使光束通过一个距离 M3 为 150 mm 的 50:50 分束器。在分束器前方 150 mm 处放置一个反射镜（M6），并将其镜面与向前发射的光束成 45° 对齐。利用反射光束构成双侧照明光片的一侧。
  4. 在分束器另一侧 150 mm 处放置一个反射镜（M4），并将其镜面与从分束器以 90° 角发射出的光束成 45° 对齐。在 M4 前方 150 mm 处放置第二个反射镜（M5），并将其镜面与从 M6 反射的光束成 45° 对齐。利用从 M5 发射出的光束构成双侧照明光片的另一侧。
  5. 以对称方式搭建双侧照明系统（见图 1）。在一侧，将一个柱面透镜（CL1）[直径（d）= 1 英寸；焦距（f）= 50 mm] 沿从 M5 发射的光束方向放置，距离为 150 mm；在另一侧，将另一个相同的柱面透镜（CL2）沿从 M6 发射的光束方向放置，距离也为 150 mm。在两个柱面透镜的光路中分别放置两个反射镜（M7 和 M8），距离透镜 50 mm，用于将光束以 90° 反射。
  6. 使用一对透镜组成一个消色差双合透镜。将第一个透镜 L1（d = 1 英寸；f = 100 mm）放置在距离 M7 100 mm 处，第二个透镜 L2（d = 1 英寸；f = 60 mm）放置在距离 L1 160 mm 处。在双侧照明系统的另一侧，使用相同规格的透镜（L3、L4）重复此配置，距离 M8 相同。
  7. 分别在距离透镜 L2 和 L4 60 mm 处沿光束方向放置反射镜 M9 和 M10。将照明物镜 OL1 和 OL2（d = 2 英寸；f = 150 mm）分别放置在距离 M9 和 M10 150 mm 处，并与光束对齐。从物镜发射出的光束形成用于样品成像的光片。
  8. 使用 3D 打印机以丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物（ABS）材料打印样品 holder。在样品室两侧垂直于照明光束方向嵌入一片盖玻片 [折射率（RI）= 1.4745]，以最小化折射率失配。将样品室均匀地置于两个物镜发射的光束之间。
  9. 安装一台配备 1X 放大倍率物镜和科学级互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机的体视显微镜，使其垂直于照明平面（见图 2）。

2. 成像系统校准

  1. 取直径为 0.53 μm 的荧光聚苯乙烯微球。
  2. 通过将微球溶液用折射率匹配溶液（RIMS）稀释至 1:150,000，并加入 1% 低熔点琼脂糖进行荧光微球样品的制备。将一段内径为 12 mm、外径为 18 mm 的硼硅酸盐玻璃管切割成 30 mm 长。
    注意：硼硅酸盐玻璃管用于匹配折射率（1.47）。
  3. 将稀释后的微球样品与 1% 琼脂糖混合，用移液器将微球/琼脂糖溶液注入硼硅酸盐玻璃管中。在室温（23 °C）下使琼脂糖凝固。
  4. 用 99.5% 的甘油溶液填充 ABS 腔室（来自步骤 1.7）。将含有微球的硼硅酸盐玻璃管放入腔室内。将 ABS 腔室置于成像系统中，使其位于双光源系统产生的高斯光束中心。
  5. 将三维电动平移台连接至硼硅酸盐玻璃管，以控制样品在 ABS 腔室内的移动和取向（见补充图 1）。
  6. 使用 sCMOS 相机以每秒 30 帧（fps）的速率采集图像。利用电机控制器，将样品在横向移动 1 mm，并使用 sCMOS 相机在每个 1-mm 增量处采集图像。持续进行，直至完成整个样品的成像。
  7. 使用可视化软件对采集的图像进行堆叠（见材料表）。利用这些微球图像测量系统的点扩散函数（PSF）。在后续步骤的图像处理中，使用该 PSF 进行去卷积。

3. 样品制备

  1. 在P7阶段，从野生型P1小鼠以及携带Rosa26-YFP基因的双杂合肌脂蛋白-Cre基因敲入小鼠（SlnCre/+; R26YFP reporter/+）中解剖心脏。
    注意：安乐死采用戊巴比妥钠，并依据Robbins 等10所描述的技术进行。解剖操作按照美国国家心肺血液研究所（NHLBI）所述技术进行10,11。
  2. 按照Kevin Sung 等12所述方法对小鼠心脏进行化学透明化处理。
    注意：由于所用化学试剂具有毒性，以下步骤应在通风橱中进行。
    1. 用1×磷酸盐缓冲液（PBS）清洗心脏，每次10分钟，共清洗3次。清洗后，将心脏置于4%多聚甲醛溶液中，并于4 °C下过夜孵育。
    2. 将样品置于含0.5% w/v 2,2’-偶氮双（2-甲基丙脒）二盐酸盐的4%丙烯酰胺溶液中，于4 °C下过夜孵育。过夜孵育后取出样品，并在37 °C下继续孵育2–3小时。
    3. 用PBS清洗样品，然后将其放入含8% w/v十二烷基硫酸钠和1.25% w/v硼酸的溶液中。于37 °C孵育至组织完全透明。所需时间取决于样品厚度，可能需要数小时。透明完成后取出样品，置于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中1天。
    4. 将40 g非离子密度梯度介质（见材料表）溶于30 mL 0.02 M磷酸缓冲液（PB）、0.1% Tween-20和0.01%叠氮化钠中，配制折射率匹配溶液。用氢氧化钠调节溶液pH至7.5。
  3. 将透明化处理后的样品置于折射率为1.46–1.48并含有1%琼脂糖的RIMS溶液中。将样品插入硼硅酸盐玻璃管中，并在室温（23 °C）下使琼脂糖凝固。
  4. 将三维电动平移台连接至硼硅酸盐玻璃管，以控制样品在3D打印ABS腔室内的移动与方向（见补充图1）。

4. 成人心脏成像

  1. 将含有心脏特异性肌钙蛋白T启动子（cTnT）和绿色荧光蛋白（GFP）的腺相关病毒载体9型（AAV9）病毒8.7 × 1012个，以100 μL体积注射至2月龄野生型（C57BL/6）小鼠尾静脉中。
    注意：AAV9的构建依据Yuan et al.13所述技术进行。该操作可使GFP与肾外髓钾通道（ROMK）结合，从而产生AAV9-cTnT-ROMK-GFP（参见材料表）。
  2. 按照美国国家心肺血液研究所（NHLBI）11所述方法，在7.5月龄时解剖成年小鼠心脏。使用步骤3.1–3.3制备样品。
  3. 将电机控制器连接至电机执行器。将执行器固定于硼硅酸盐玻璃管上，以控制样品在3D打印的ABS腔室内的移动和方向。
  4. 调整样品位置，使其位于双光源系统产生的高斯光束中心。使用sCMOS相机以100 fps的速率采集图像。
  5. 通过电机控制器，沿轴向移动样品1 mm，并使用sCMOS相机在每个1 mm增量处采集图像。持续操作直至完成整个样品的成像。
    注意：系统由自主开发的仪器控制软件进行控制。
  6. 使用可视化软件对采集的图像进行堆叠（参见材料表）。利用这些图像堆栈和可视化软件生成三维图像14。将步骤2.6中获得的点扩散函数（PSF）与图像堆栈进行去卷积处理。设定像素强度阈值以观察心脏轮廓，并根据灰度强度为图像添加伪彩色。

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结果

本文所述技术采用双侧照明光束结合小鼠心脏组织样本的光学透明化处理，以实现更深层的成像深度和更大的成像体积，同时保持足够的成像分辨率（图1）。为校准系统，将荧光微珠置于玻璃管内并放入成像系统中。随后在 x-y 平面、y-z 平面和 x-z 平面成像并可视化微珠，以获取系统的点扩散函数（PSF）8。当使用甘油作为包埋介质时，系统校准结果显示横向分辨率为 dlateral ≈ 2.8 µm，轴向分辨率在 XZ 方向为 dXZ ≈ 17.4 µm，在 YZ 方向为 dYZ ≈ 17.9 µm8。

使用荧光微珠完成校准后，成像系统用于采集出生后1天和7天小鼠心脏的图像（图2）

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讨论

本文所述的光片荧光显微镜（LSFM）系统与技术采用双侧照明光束结合光学透明化方法，对小鼠出生后及成年阶段的心脏进行成像。传统的单侧照明光束在穿透较厚或较大的组织样本时，易受到光子散射和吸收的影响1,3。双侧照明光束可实现对样本更均匀的照明，从而最大限度地减少因单侧照明所导致的条纹状伪影及其他成像伪迹。该技术还可通过调节双高斯光束的位置，增加可成像样本的尺寸8。当双光束达到最大间距时，能够对尺寸达数毫米的组织样本进行成像，例如成年小鼠心脏；而单侧照明则仅限于对较小的心脏（如斑马鱼和Drosophila的心脏）进行成像。

在光学不透明的组织中进行荧光成像更具挑战性，因为光散射在组织样本中的分布可能并不均匀。这限制了样本可成像的深度以及荧光成像的效果。因此，通常会使用斑马鱼等天然具有光学透明组织的生物模型5。然而，对于皮肤本身不具备光学透明性的生物，已有多种光...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨向加州大学洛杉矶分校（UCLA）的 Thao Nguyen 和 Atsushi Nakano 致谢，感谢他们提供用于成像的小鼠样本。本研究获得了以下资助：NIH HL118650（授予 Tzung K. Hsiai）、HL083015（授予 Tzung K. Hsiai）、HD069305（授予 N. C. Chi 和 Tzung K. Hsiai）、HL111437（授予 Tzung K. Hsiai 和 N. C. Chi）、HL129727（授予 Tzung K. Hsiai）以及德克萨斯大学系统 STARS 项目资助（授予 Juhyun Lee）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
连续波激光器Laserglow TechnologiesLMM-GBV1-PF3-00300-05用于激发荧光染料
中性密度滤光片ThorlabsNDC-50C-4M控制进入系统的光量
消色差光束扩束器ThorlabsGBE05-A扩展光束
机械狭缝ThorlabsVA100C控制光束宽度
分束器ThorlabsBS013形成双照明光束
配备1X物镜的体视显微镜OlympusMVX10用于样品观察
ORCA-Flash4.0 LT sCMOS相机Hamamatsu PhotonicsC11440-42U用于图像采集
丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物（ABS）StratasysuPrint用于3D打印样品支架的材料
荧光聚苯乙烯微球Spherotech IncPP-05-10用于成像系统校准
硼硅酸盐玻璃管CorningPyrex 7740用于样品包埋的管材
甘油Fisher ScientificBP229-4样品腔填充介质
磷酸盐缓冲液Fisher ScientificBP39920小鼠心脏冲洗溶液
多聚甲醛Electron microscopy sciencesRT-15700第一次孵育溶液
丙烯酰胺Wako ChemicalsAAL-107与2,2'-偶氮二(2-甲基丙脒)二盐酸盐混合，作为小鼠心脏的第二次孵育溶液
2,2'-偶氮二(2-甲基丙脒)二盐酸盐Wako ChemicalsVA-044与丙烯酰胺混合，作为小鼠心脏的第二次孵育溶液
十二烷基硫酸钠 Sigma Aldrich71725与硼酸混合，作为小鼠心脏的第三次孵育溶液
硼酸Fischer ScientificA74-1与十二烷基硫酸钠混合，作为小鼠心脏的第三次孵育溶液
Sigma D2158Sigma AldrichD2158与PB、Tween-20和叠氮化钠混合，作为折射率匹配溶液
Tween-20Sigma Aldrich11332465001与Sigma D2158、PB和叠氮化钠混合，作为折射率匹配溶液
叠氮化钠Sigma AldrichS2002与Sigma D2158、PB和Tween-20混合，作为折射率匹配溶液
携带心肌特异性肌钙蛋白T启动子并标记GFP的腺相关病毒载体9Vector BiolabsVB2045与ROMK结合时表达GFP
直流伺服电机执行器ThorlabsZ825B用于样品在光片中轴向移动
K-Cube直流伺服电机控制器ThorlabsKDC101连接电机执行器并控制其运动
AmiraFEI SoftwareN/A用于生成二维和三维图像的可视化软件

参考文献

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  2. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
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