本文介绍了一种可准确量化线粒体DNA（mtDNA）甲基化水平的实验方案。该方案描述了使用BamHI酶对DNA进行消化，并结合生物信息学分析流程，以避免因mtDNA二级结构导致的mtDNA甲基化水平高估问题。
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本文内容
摘要
摘要
DNA甲基化的定量可通过亚硫酸氢盐测序实现，该方法利用亚硫酸氢钠在单链DNA环境中将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的特性。亚硫酸氢盐测序可采用靶向方式（通过PCR）或全基因组方式进行，能够以单碱基分辨率对胞嘧啶甲基化进行绝对定量。鉴于核DNA与线粒体DNA在二级结构等方面的显著差异，对亚硫酸氢盐测序方法进行适当调整，以用于线粒体DNA（mtDNA）中胞嘧啶甲基化的研究是必要的。mtDNA的二级和三级结构可能导致亚硫酸氢盐测序产生假阳性结果，这是由于DNA变性不完全或亚硫酸氢盐难以接近单链DNA所致。本文介绍了一种结合BamHI酶切与生物信息学分析流程的实验方案，可实现对mtDNA中胞嘧啶甲基化水平的准确量化。此外，我们还提供了针对mtDNA特异性设计亚硫酸氢盐测序引物的指导原则，以避免扩增核基因组中插入的核源性线粒体片段（NUMTs）等非目标区域。
引言
线粒体基因组是一种环状双链结构，长约16.5千碱基（kb），由重链和轻链组成。每个细胞中含有多个拷贝的线粒体基因组，具有母系遗传特性，并编码呼吸链复合物的关键组分1。与核基因组不同而类似于细菌基因组，线粒体基因组以多种二级和三级结构组织，例如卷曲和超螺旋结构2，这些结构可能在测序实验中阻碍对基因组的访问3。
在细胞核中，DNA甲基化是一种被广泛研究的表观遗传标记，在多种生物学过程中发挥重要作用，尤其是在基因表达调控中。在哺乳动物基因组中，DNA甲基化主要发生在脱氧胞苷的嘧啶环5位碳上，多数位于CG二核苷酸（即CpG）位点。体细胞基因组中约70%的CpG位点存在胞嘧啶甲基化，占总DNA碱基的约1%4。此外，非CpG背景下的DNA甲基化也已被报道，例如CpA、CpT和CpC位点，在核DNA中以不同比例存在，在胚胎干细胞中可高达所有甲基化胞嘧啶的25%5,6,7。
尽管核基因组的胞嘧啶甲基化已被广泛接受，线粒体DNA（mtDNA）甲基化的存在仍存在争议。....
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方案
1. 限制性内切酶处理
- 通过使用限制性内切酶BamHI处理总人源DNA，将线粒体DNA（mtDNA）线性化，该酶在人线粒体DNA的第14258位点进行切割。
注意：对于小鼠DNA，在与下述相同条件下使用限制性内切酶BglII。 - 针对每个需要评估线粒体DNA甲基化的样本，准备一个0.2 mL的反应管，并加入以下混合物：3 μg基因组DNA（通过荧光测定法定量）、15 μL Buffer 3、3 μL BamHI，加水至总体积150 μL。
- 将反应管放入热循环仪中，在37 °C下孵育4小时。
2. 亚硫酸氢盐转化
- 按照文献所述方法29，使用亚硫酸氢钠对经BamHI处理的DNA进行转化。
- 每个转化反应使用200-500 ng经BamHI处理的DNA，总体积为20 μL。DNA回收率为50-70%。
- 用10 μL洗脱缓冲液洗脱亚硫酸氢盐转化后的DNA。
- 通过荧光测定法对单链DNA进行定量。
- 可选：在继续本方案后续步骤前，可将亚硫酸氢盐转化后的DNA储存在-20 °C。如需长期保存，应将亚硫酸氢盐转化后的DNA储存在-80 °C
3. 亚硫酸氢盐测序引物的设计
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结果
在研究线粒体DNA甲基化时，本方案中有两个步骤至关重要：1）打开二级结构；2）设计线粒体DNA特异性引物。
通过使用限制性内切酶BamHI消化人类基因组DNA（图1），线粒体DNA结构将在第14,258个核苷酸位置被切割，其二级结构将被打开。
完整的线粒体DNA二级结构可能会影响亚硫酸氢盐转化效率，极有可能导致线粒体DNA未转化率被高估。通过亚硫酸氢盐测序法，在人骨骼肌细胞的未消化和已消化的总DNA中，检测了线粒体基因组5个不同区域的线粒体DNA未转化率：置换环（D-Loop）、苯丙氨酸tRNA和12S核糖体RNA（tRNA-F+12S）、16S核糖体RNA（16S）、NADH脱氢酶5（ND5）以及细胞色素b（CYTB）mRNA编码基因（
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讨论
本文提供了一种专门用于检测线粒体DNA（mtDNA）甲基化的亚硫酸氢盐测序方案。该方法与用于基因组DNA的亚硫酸氢盐测序方案的不同之处在于，增加了前期的限制性内切酶消化步骤，以及通过生物信息学分析排除由NUMT序列引起的假阳性结果。
我们提供了一种在研究线粒体DNA（mtDNA）甲基化时避免亚硫酸氢盐测序假象的实验方案。先前已有报道指出，亚硫酸氢盐测序可能产生导致假阳性的技术假象37。蛋白酶K对DNA辅助蛋白的去除不充分是已知原因之一37。DNA变性不完全或部分复性可能导致某些区域转化不完全，可能是由于亚硫酸氢盐对单链DNA中胞嘧啶的接触受限所致37。后一种假象可能在线粒体DNA中更为显著，因为其二级结构可能阻碍亚硫酸氢盐对胞嘧啶的接触。据我们所知，在评估mtDNA甲基化水平时，于亚硫酸氢盐转化前增加限制性内切酶消化步骤的方法，最早于2016年被报道3,
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披露
作者声明无竞争性财务利益。
致谢
诺和诺德基金会基础代谢研究中心是哥本哈根大学的一个独立研究中心，部分资金来自诺和诺德基金会的无限制捐赠。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BamHI | 新英格兰生物实验室 | # R0136 | |
| EZ DNA甲基化-快速试剂盒 | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit单链DNA检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | # Q10212 | |
| Qubit检测管 | 赛默飞世尔科技 | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA聚合酶试剂盒 | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick凝胶回收试剂盒 | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA文库构建试剂盒（适用于Illumina） | 新英格兰生物实验室 | # E7370S | |
| NEBNext多重引物试剂盒（适用于Illumina） | 新英格兰生物实验室 | # E7335S | |
| AMPure XP磁珠 | 贝克曼库尔特 | # A63881 | |
| 高灵敏度DNA芯片 | 安捷伦 | # 5067-4626 | |
| Qubit高灵敏度双链DNA检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | # Q33230 | |
| MiSeq v2 300循环测序试剂盒 | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX对照v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| 氢氧化钠 | 西格玛 | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Bio-Rad | # 1851148 | |
| CFX96实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | #1855195 | |
| Qubit荧光仪 | 赛默飞世尔科技 | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | 安捷伦 | # G2939BA | |
| MiSeq测序仪 | Illumina | # SY-410-1003 |
参考文献
- Falkenberg, M., Larsson, N. -G., Gustafsson, C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria. Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).
- Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -H., Kaufman, B. A.
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