本文描述了一种在单细胞水平上对外周血单个细胞（ex vivo）同时定量96个基因和18种表面蛋白表达水平的方法，可用于鉴定病毒感染细胞与未感染细胞之间差异表达的基因和蛋白。我们应用该方法研究从中国台湾恒河猴中分离的SIV感染的CD4+ T细胞。
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摘要
摘要
单细胞分析是解析细胞异质性群体的重要工具。稀有细胞的鉴定与分离往往具有挑战性。为应对这一难题，研究人员开发了一种结合索引式流式细胞术与高通量多重定量聚合酶链式反应（qPCR）的方法。该方法旨在鉴定并表征存在于恒河猴体内的猴免疫缺陷病毒（SIV）感染细胞。通过荧光激活细胞分选（FACS）定量表面蛋白，并通过qPCR定量mRNA，利用病毒基因表达识别病毒感染细胞，再结合宿主基因与蛋白的检测，构建多维度的细胞图谱。我们将该方法命名为靶向单细胞蛋白-转录联合评估技术（targeted Single-Cell Proteo-transcriptional Evaluation，tSCEPTRE）。实施该方法时，首先使用针对表面标志物的荧光标记抗体对活细胞进行染色，这些标志物用于FACS分离特定细胞亚群和/或后续的表型分析。随后对单个细胞进行分选，并立即裂解，进行多重逆转录（RT）、PCR预扩增，以及最多96个转录本的高通量qPCR检测。FACS检测数据在分选时记录，并通过孔位信息与基因表达数据关联，从而生成整合的蛋白与转录图谱。为直接在体外研究SIV感染细胞，通过qPCR检测多种病毒RNA分子以识别感染细胞。多种病毒转录本的组合及其表达量为将感染细胞划分为病毒生命周期不同阶段（如 productive 与 non-productive 阶段）提供了依据。此外，将SIV+细胞的tSCEPTRE分析结果与来自同一样本的未感染细胞进行比较，以评估宿主基因与蛋白的差异表达。该分析揭示了既往未被充分认识的感染细胞间病毒RNA表达的异质性，以及在单细胞分辨率下体内SIV介导的转录后基因调控机制。tSCEPTRE方法适用于任何可通过表面蛋白标志物、宿主或病原体基因表达，或其组合进行鉴定的细胞群体分析。 离体通过qPCR检测多种病毒RNA种类来鉴定细胞。病毒转录本的种类及其表达量共同为将细胞分类至病毒生命周期的不同阶段提供了依据（例如， productive versus non-productive）。此外，对SIV+ 细胞与来自同一样本的未感染细胞进行比较，以评估宿主基因和蛋白的差异表达。分析揭示了感染细胞间先前未被充分认识的病毒RNA表达异质性，以及单细胞分辨率下的体内SIV介导的转录后基因调控。 体内 单细胞分辨率下的SIV介导的转录后基因调控。tSCEPTRE方法适用于任何可通过表面蛋白标志物、宿主或病原体基因，或其组合的表达来鉴定的细胞群体的分析。
引言
许多胞内病原体依赖宿主细胞的机制进行复制，通常会改变宿主细胞的生物学特性，或靶向特定的宿主细胞亚群，以最大化其传播机会。因此，细胞生物学过程常常受到干扰，对宿主整体健康造成有害影响。深入了解病毒与其复制所依赖的宿主细胞之间的相互作用，有助于阐明疾病机制，从而推动更优疗法和感染预防策略的开发。实现这一目标的关键在于拥有能够直接分析宿主-病原体相互作用的分析工具。单细胞分析是唯一能够明确将特定细胞表型归因于特定基因型或感染状态的方法1。例如，病原体感染通常会引发宿主细胞的直接和间接变化。因此，必须将被感染细胞与其未感染的对应细胞区分开来，才能判断宿主细胞的变化是由直接感染引起，还是由继发效应（如广泛性炎症）所致。此外，对于许多病原体（如SIV和人类免疫缺陷病毒HIV），宿主细胞感染会经历多个阶段，例如早期、晚期或潜伏期，每个阶段可能具有不同的基因和蛋白表达谱2,3,4,5。对细胞混合物进行整体分析将无法捕捉这种异质性6。相比之下，高通量的单细胞多因子分析能够同时量化病毒和宿主基因的表达，为解析感染特异性的细胞扰动（包括不同感染阶段之间的差异）提供了有效手段。此外，在生理相关条件下分析宿主-病原体相互作用，对于识别感染个体中实际发生的生物学事件至关重要。因此，可直接用于ex vivo样本的方法最有可能真实反映in vivo的生物学过程。
SIV 和 HIV 靶向 CD4+ T细胞中，它们可拮抗宿主的抗病毒反应 "限制" 因子并下调抗原呈递分子，以建立有效感染并逃避免疫监视7,8,9,10,11若不进行治疗，该感染将导致大量CD4细胞丢失+ T细胞，最终导致获得性免疫缺陷综合征（AIDS）12在抗逆转录病毒治疗的情况下，潜伏感染的细胞储存库可持续数十年，构成治愈策略的重大障碍。了解这些细胞的特性对于 在体内 HIV/SIV感染的细胞有可能揭示在致病和持续感染中起关键作用的宿主细胞特征。然而，这一研究面临巨大挑战，主要由于感染细胞频率极低，且缺乏能够有效识别这些细胞的试剂。转录病毒RNA的细胞估计仅占CD4+ 血液和淋巴组织中的T细胞13,14,15在抑制性治疗下，潜伏感染的细胞频率甚至更低，仅为10-3–10-7 16,17,18病毒蛋白染色检测方法在研究中表现良好 体外 感染（例如细胞内Gag）的检测效果欠佳，原因是背景染色率为0.01–0.1%，与感染细胞的频率相当或更高13,14. 使用经过充分验证的SIV/HIV Env特异性单克隆抗体对Env蛋白进行表面染色也已被证明存在困难，原因可能类似。近期，一些新型工具致力于通过引入针对gag RNA的特异性检测方法或采用替代性成像技术，以提高表达Gag的细胞的检出能力14,15,19然而，此类方法在对每个细胞进行的定量测量数量上仍然存在局限性。
本文所述方法具有以下两点：（1）通过高灵敏度和特异性的病毒基因定量qPCR，直接在体外（ex vivo）识别单个病毒感染细胞；（2）对每个感染（及未感染）细胞定量多达18种表面蛋白和96个基因的表达。该方法结合了流式细胞术（FACS）对单个细胞表面蛋白的检测，随后立即裂解细胞，并利用Biomark系统进行多重靶向qPCR以分析基因表达。集成流体回路（IFC）技术可同时对96个样本中的96个基因进行多重定量，通过包含9,216个独立qPCR反应腔室的矩阵实现。活细胞的FACS分选过程记录了高通量的蛋白丰度数据，同时完整保留转录组，供后续立即开展分析。为识别病毒感染细胞，qPCR分析中包含了针对剪接和未剪接病毒RNA（vRNA）的特异性检测，并结合一组用户自定义的检测，总计最多可达96个基因，达到当前IFC所能容纳的最大检测数量。每个细胞所获得的基因表达与蛋白信息通过孔位实现关联。我们此前已在其他文献中报道过该分析的结果20。本文则提供了更为详细的方法学指南，以及对SIV感染的CD4+ T细胞进一步的表型描述。
该方法被称为tSCEPTRE，可应用于任何对荧光标记抗体具有反应性且转录组与现有qPCR检测兼容的活细胞群体悬液。例如，该方法可用于表征稀有细胞或难以通过表面蛋白标志物区分的细胞中基因和蛋白表达的差异。样品制备依赖于使用商业化抗体的标准染色方案。具备单细胞分选能力的流式细胞仪也可商业化获取，但处理具有感染性的活细胞时需要额外的生物安全防护措施。通过孔位记录每个细胞的单细胞蛋白表达谱，即本文所述的索引式分选（indexed sorting），是现有商业化FACS分选软件的常见功能。本文未描述对目标细胞群体间差异表达宿主基因的计算分析方法，但提供了参考文献以查阅先前已发表的相关方法。
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方案
注意：方案工作流程示意图见图1。该流程包括三个主要步骤：FACS、逆转录（RT）与cDNA预扩增，以及同时对多达96个基因进行qPCR检测。步骤5和步骤6分别更详细地描述了两种版本的方案：以极限稀释法分选细胞和单细胞分选。这些策略针对不同的研究问题，但遵循相似的操作流程。
1. 前提条件或先前分析
- 按照先前所述方法6验证所有将使用的基因表达检测方法。
注意：此步骤需在实验日期之前尽早完成。必须对所有检测方法（包括商业和定制的）进行验证，以确保相关RNA在单细胞水平下能够高效且线性扩增。许多市售或定制的检测方法无法满足这些要求。同时对多达96个基因的表达检测方法进行鉴定的处理及自动曲线拟合流程详见补充代码文件1–5，但也可通过R2值和线性拟合的斜率对单个检测方法进行鉴定。典型的成功与失败的检测方法鉴定图见图2。 - 开发用于染色目标细胞表面标志物的流式细胞术抗体组合。
- 通过使用相关样本（例如，恒河猴外周血单个核细胞，PBMCs）对每种抗体进行滴定。每个检测在100 µL染色反应体系中起始加入20 µL抗体，并进行八次两倍梯度稀释。确定能够展现最大染色强度且保持阴性与阳性细胞群清晰分离的最佳浓度。
- 使用步骤1.2.1中确定的最佳浓度，将所有抗体混合后在额外的细胞样本上评估联合染色效果。确保联合染色结果与各抗体单独染色时观察到的结果相似。如果某种抗体在联合染色中的表现低于其单独使用时的效果，应考虑更换该抗体的荧光素偶联物。
2. 基因表达检测的制备
- 将96种基因表达检测物加入一个无RNase/DNase的1–15 mL离心管中（管的大小可根据分选板的数量进行调整）。本研究中使用的检测物组合详见表1和表2。所得混合物称为“检测混合液”。每种检测物的正向和反向引物终浓度均为180 nM。加入DNA悬浮缓冲液，将检测混合液稀释至适当浓度。
注意：出于操作便利性考虑，可将自行设计（用户生成）的检测物储备液配制成18 µM，以与 commercially available “20x” 基因表达qPCR检测物的浓度保持一致（材料表）。每种基因的自定义正向和反向引物储备液均用DNA悬浮缓冲液配制，终浓度为18 µM。商业检测物（材料表）还包括探针，但逆转录（RT）和cDNA预扩增步骤中无需探针，因此自定义检测物可省略探针。建议包含一个或多个看家基因，用于质量控制，以评估分选效率、细胞回收率及cDNA合成效果。目前尚未确定使用随机引物生成cDNA的效果，但预计其效率低于基因特异性引物。 - 准备用于步骤7.1（多重qPCR）的2x检测板。针对每个预期使用的96 × 96芯片阵列，向96孔PCR板的每个指定孔中加入6 µL的每种检测物 。例如，若使用5个芯片，则每种检测物需取30 µL，分别加入96孔板的单个孔中。若使用96种检测物，则96孔板的每个孔均含有一个检测物。用压敏封板膜密封该PCR板。
注意：理想情况下，步骤2.1和2.2应同时进行，以避免基因表达检测物经历多次冻融循环。检测板中的所有基因必须均已包含在检测混合液中（步骤2.1）。检测混合液和检测板可分别长期或短期储存于-20 °C或4 °C。
3. 表面染色活细胞
注意：细胞内染色、透化和固定与此方法不兼容，因为这些步骤会破坏RNA。
- 通过添加下表所列的每种抗体来制备补偿样本 材料表 至 40 µ2.5 倍于细胞染色浓度的补偿微珠，25 °C 孵育 20 分钟 °C 避光保护。向珠子中加入 3 mL PBS，于 500 x g 25℃下持续3分钟 °C. 吸去 PBS，并将磁珠重悬于约 300 µL 的 PBS
- 为样品处理准备流式细胞分选仪：获取补偿管，创建补偿矩阵，并将矩阵应用于实验样本的采集文件。
- 通过混合每种抗体的适当体积来制备荧光抗体混合液，具体体积按指定方案进行 材料表，将所有待染色样本加入1.5 mL棕色管中。涡旋混匀后，在21,000 x g 25℃下持续2分钟 °C，以沉淀抗体聚集体。
注：此处使用的抗体列于下文 材料表. - 将冻存的细胞在37℃下解冻 °C水浴2分钟。将0.5–2 mL细胞悬液加入含12 mL PBS的15 mL离心管中，于500 x g 25℃下持续3分钟 °C，吸去PBS。加入3 mL PBS重悬，转移至5 mL聚苯乙烯管中。同上离心后吸去PBS，留置约20 µL残留PBS。
注意：可根据特定应用需求，通过相应调整抗体滴定染色条件，将染色温度改为更高或更低的温度（参见步骤1.2）。 - 重悬最多 2 x 107 80 中洗涤细胞 µL 抗体混合物，25℃孵育 20 分钟 °C 避光保存。对于样品量超过 2 x 107 细胞，相应增加染色反应体积以维持 <2 × 107 细胞/100 µL.
- 加入 3 mL PBS 重悬细胞，500 x g 离心洗涤细胞 g 3 分钟，然后吸除上清液。
- 将细胞在 300–500 μL 缓冲液中充分重悬 µL PBS，并通过移液经过35 µm 尼龙细胞滤网帽。将细胞置于冰上并避光保存，直至分选。
4. 准备细胞收集板、进行FACS分选并生成cDNA
- 将 RT-预扩增反应混合液组分（表3）用移液器加入一个无RNase/DNase的无菌离心管中混合。
注意：此步骤可在第3步染色前或染色过程中进行。此处可省略逆转录酶，以确定DNA模板对qPCR信号的贡献。 - 使用多通道移液器将10 µL RT-预扩增反应混合液加入所需数量的96孔PCR分选收集板中。用粘性封膜密封各板，并将板置于预冷的96孔铝块上。
- 通过采集约20,000个染色样本细胞的数据，在流式细胞仪上建立细胞分选门控方案。确保对采集的数据应用补偿矩阵。绘制门控并定义门控树，以识别拟分离用于基因表达分析的目标细胞群体。
注意：用于收集潜在SIV vRNA+细胞的门控树如图3所示。 - 输入适当的仪器设置，指定每个孔中分选的细胞数量及细胞亚群。分别在第5步和第6步中提供了对限稀释细胞系列或单细胞进行分选的额外详细说明。
- 通过FACS将细胞分选至已准备好的96孔PCR收集板中。分选前移除粘性封膜，分选后立即更换新的封膜。
注意：包括分选过程中在内，始终将板置于预冷的铝块上。 - 分选完成后立即对收集板进行涡旋振荡，并在4 °C下以2,000 × g离心1分钟。
- 将板放入带有预热盖的PCR仪中进行热循环，程序如下：50 °C孵育15分钟（逆转录），95 °C孵育2分钟，随后进行18个循环（95 °C变性15秒，60 °C退火延伸4分钟）（预扩增）。
- 通过将5 μL cDNA转移至新的96孔PCR板中含20 µL DNA悬浮缓冲液中，将cDNA按1:5比例稀释。稀释后的cDNA可在此时长期保存于4 °C或-20 °C。稀释后的cDNA现已可作为qPCR的模板使用（步骤5.2，7.4）。
注意：此稀释步骤可确保RT-预扩增反应中残留的引物不会干扰下游qPCR反应。
5. 变体 A：将细胞通过流式细胞分选进入有限稀释系列，以确定vRNA+细胞的频率或进行实验质量控制
注意：在进行单细胞分选之前，可通过将细胞分装至重复的系列稀释孔中进行分选，以确定目标细胞的频率。此步骤还可对分选效率、细胞裂解、RNA 回收及 cDNA 合成提供重要的质量控制，如步骤 5.3 所述。预先确定 vRNA+ 细胞频率有助于更准确地估算为获得足够样本量以进行具有充分统计效能的 vRNA+ 细胞基因表达分析所需分选的单细胞数量。
- 将细胞通过流式细胞分选（FACS）至按步骤 4.1–4.2 准备的 96 孔板中，每孔收集 1–1,000 个细胞，并设置多个重复。
注意：每个细胞稀释度所设重复孔数通常与每孔细胞浓度呈反比。当感染细胞频率远低于 1% 时，应将细胞稀释范围集中在每孔 100–1,000 个细胞。示例分选板布局见 图 1 左上角。应避免每孔超过 1,000 个细胞，否则会导致反应体积增加，干扰后续 cDNA 合成与定量。 - 按照 表 4 配制 qPCR 试剂的主混合液。对于 25 µL 的反应体系，将 22.5 µL 主混合液与 2.5 µL 来自步骤 3.9 的稀释后 cDNA 模板混合。采用标准扩增循环条件进行 qPCR（例如，94 °C 预变性 5 分钟，随后进行 40 个循环：94 °C 变性 15 秒，60 °C 退火延伸 1 分钟）。
注意：建议使用常规实时定量 qPCR 仪器进行单重 qPCR 反应，作为对一个或少数几个检测项目的经济型初步分析，以验证细胞分选、RNA 回收及 cDNA 合成的效率。也可用于计算 vRNA+ 细胞的频率。对于大规模单细胞分析，通常更适合采用 Biomark 系统进行多重 qPCR 反应。 - 为进行质量控制，以每孔分选细胞数的 log10 值为横坐标，Et 值（Et = Ctmax − Ct）为纵坐标作图，并进行线性回归分析。
注意：重复性良好、线性回归斜率为 3.3（± 0.3）、且 R2 > 0.9 表明实验效率较高。图 4 展示了理想与非理想分选及反转录预扩增实验的示例。 - 为确定 vRNA+ 细胞的频率，以每孔分选的细胞数（log10 刻度）为横坐标，以各细胞稀释度下 vRNA 阳性孔的比例为纵坐标作图。示例见 图 1（左下角，泊松分布）。对数据应用线性回归模型，确定平均每孔含有一个阳性细胞时对应的细胞数量，即阳性孔比例为 63.2%（纵坐标 0.632）时的值21。将该细胞稀释数值（横坐标截距）转换为百分比形式的频率。例如，每 48 个细胞中有一个 vRNA+ 细胞，相当于频率为 2.1%。
6. 变体 B：用于单细胞分析的 FACS 分选细胞
- 按照步骤 4.1–4.8 操作，并使用流式细胞仪的索引分选功能指定每孔分选一个细胞，以生成每个分选细胞对应的独立 FCS 文件，并按孔位进行映射。
注意：如果分选收集板的数量超过可用的热循环仪数量，可在逆转录酶失活步骤（95℃）后暂停扩增程序 °C 下 2 分钟）后，cDNA 可在 4 ℃ 保存 °C，直至热循环仪可用。在此情况下，从95℃的第一轮循环开始进行预扩增 °C，15 秒。 - 可选：使用未稀释的剩余 cDNA，将用户自定义批次的单细胞 cDNA 组合成 cDNA“池”，以筛查感兴趣的稀有细胞。转移 2 µL未稀释的单细胞预扩增cDNA加入新的96孔板中。重复操作，用多通道移液器加入2 µ将指定细胞池中所有其他单细胞的 cDNA 加入同一孔中。对 cDNA 池进行目标基因的筛查（例如，vRNA）以利用常规qPCR确定含有阳性细胞的样本。由于混合仅需每个细胞的少量cDNA，剩余的约8 µcDNA 的 L 仍可用于单细胞分析。
注意：建议在进行单细胞基因表达分析之前采用合并样本的策略，以减少通过资源密集型多重qPCR检测的单细胞数量。该策略适用于目标细胞（例如，SIV mRNA+）可通过初步的单重qPCR检测进行鉴定。构建cDNA文库的简单高通量策略包括合并2 µ未稀释cDNA的L量，来自分选收集板的行（即， 所有12个细胞（A行）或列（即， 将第1列的所有8个细胞）合并至新板中的一个孔内。为确定最佳合并策略，需考虑步骤5.4中目标细胞的预期频率。例如，若预计10%的细胞为阳性，则由六个单细胞cDNA样本组成的合并样本常为阴性，因此可将该合并样本中所包含的细胞从后续的单细胞分析中排除。
7. Biomark 平台上的多重 qPCR
注意：本节可采用上述版本 A 或 B 中的任意一种。在本研究中，该方法专门应用于单细胞分析。
- 通过移液将4 μL的qPCR检测液加入到qPCR板中 µ将2x检测板（步骤2.2中制备）中每种检测的L加入至新的含有4的96孔PCR板中 µ每孔加入 L 的检测加样试剂。将检测板保持在 4 °C.
注意：检测板在 4 °C下最多保存一周，以及在-20 °在4°C条件下可保存一个月。因此，建议制备足量的材料用于多个芯片，并妥善储存。 - 将引物注射器中的控制液分别注入芯片的两个进样阀中。移除载物板下方的保护塑料膜。将芯片放置在IFC控制器上，使带缺口的一侧位于A1位置。从主菜单中选择 "引物" 脚本。运行该脚本。
- 通过混合50制备实时反应混合液 µL 样品上样试剂与 500 µL 的 PCR 主混合液（材料表）为每张微流控芯片。用移液器加入 4.4 µ将 L 加入新 96 孔 PCR 板的每个孔中，此后该板称为“样本板”。
- 移液 3.6 µ将步骤4.8中1:5稀释的cDNA的L加入含有实时反应混合液的样品板中。
注意：如果进行了PCR下筛以检测稀有（例如，病毒RNA+) 用于后续分析的细胞，如步骤 6.2 所述，仅包含阳性池中所代表的细胞。 - 芯片预处理完成后，通过向芯片入口加样 5 µ将5 μL从检测板加入芯片的带缺口（检测）侧的相应孔中，并加入5 µ将样品板中的液体从芯片的一侧转移至另一侧（样品侧）的对应孔中。将芯片插入IFC控制器并运行程序 "加入混合液" 脚本。
- 将芯片转移至Biomark平台以进行多重qPCR。按照实时qPCR分析软件提供的逐步操作说明，使用基因表达（GE）96.96标准V.1程序设置仪器并编程qPCR，PCR循环数为40次。将ChipRun文件保存至指定文件夹中。
注意：每天可运行多个芯片，且可连续多天进行。 - 分析 qPCR 数据。
- 打开实时荧光定量PCR分析软件。打开 "ChipRun.bml" 文件来自 "文件 | 打开" 菜单。
- 定位 "芯片探索器" 以及 "芯片运行摘要" 位于软件窗口的左上角。识别芯片运行摘要的三个组成部分：分析视图、样本设置和检测器设置。
- 点击 "检测器设置". 在 "任务"，点击 "新" 并选择容器类型 "SBS 板"，以及容器格式 "SBS96"。接下来 "绘制图谱"，点击 … 按钮，然后选择 "M96-检测-SBS96.dsp".
- 可选：通过双击1，在每个孔的“名称”部分为每个检测器（检测）分配一个编号或名称st 孔。通过按下移动到下一个孔 "F2".
- 点击 "样本设置". 在 "任务" 旁边 "绘制图谱"，点击 … 按钮，然后选择 "M96-Sample-SBS96.dsp".
- 点击 "分析视图". 在 "任务" 在 "qPCR" 标签，选择 "线性（导数）基线校正"，以及 "Ct 阈值法（适用于用户，检测器）". 在 "Ct 阈值" 标签，检查 "使用自动框初始化". 点击 "分析" 上方按钮。
- 右上象限 "分析视图"，点击第二个标签页 "结果表格"从下拉菜单中选择 "热图视图"热图及其数据将显示。
- 可选：为确保芯片内 ROX 荧光均匀，选择 "图像视图" 而不是 "热图视图" 从同一菜单中。在热图上方右侧第二个窗口中，选择 "ROX"在右侧第一个窗口中，选择1至40个循环。点击右侧第四个窗口，切换至ROX荧光的黑白显示模式。此时将显示芯片上液滴、颗粒或缺陷的图像。如果ROX均匀性受到明显遮蔽，请重新运行该芯片。
- 在热图下方，点击 "阈值" 以及 "对数图". 通过点击检测（热图的列）并根据需要拖动阈值，使其与指数扩增阶段的扩增曲线相交，从而手动调整每个检测器的Ct阈值。完成后，点击 "分析".
- 将qPCR数据导出为.csv文件。将数据导入电子表格或统计分析软件（例如，JMP）并根据芯片上的样品和检测位置绘制结果图。通过创建新列并使用条件公式，根据病毒基因的表达情况将细胞分组。 "分析"选择 "拟合 Y 与 X"，绘制基因表达与分组的关系图，并进行统计学分析。
注意：四个 SIV RNA 物种的代表性单细胞定量表达在双变量图中显示 图 5ASIV RNA中宿主基因的定量表达+ 细胞中的表达情况如图所示 图 5B. - 从单细胞FACS数据中提取定量蛋白质表达值。
- 使用 FlowJo 9 版本打开与 96 孔板对应的 FACS 分选（步骤 6.1）生成的 .fcs 文件。选中高亮显示的文件名后，选择 "平台 | 事件数量门控 | 创建索引分选门"单个细胞将按行显示。
- 选中所有 96 个细胞（而非行）并选择 "工作区 | 导出 | 选择所有补偿荧光信号". 在 "数据类型"选择 "FCS 文件"，点击 "导出"，并选择指定文件夹。
- 将单个细胞的 .fcs 文件拖入新的 FlowJo 工作区。选中所有细胞，点击 "添加统计分析" （the "Σ" 左上角的按钮 "| 平均值 | 所有荧光参数".
- 开放 "表格编辑器" 通过点击左上角从左数第四个按钮。选中第一个细胞的所有荧光信号，并将其拖入表格编辑器窗口。在表格编辑器窗口中，点击顶部的相同按钮 "创建并查看表格"这将生成一个包含96个细胞的表格，以及每种荧光染料对应的数值参数。
- 将输出复制到数据库软件中（例如，MS Excel，JMP），通过复制/粘贴或单击 "保存并启动应用程序" （表格上方从左数第四个按钮）。
注意：本操作流程专用于 FlowJo 9 版本。FlowJo 10 版本采用不同的流程导入索引数据。索引流式数据也可通过细胞分选仪生成的 .csv 文件直接复制/粘贴至 JMP 软件中。
- 整合单细胞FACS数据与qPCR数据 根据板号和孔位进行整合，对单细胞基因（qPCR）与蛋白表达（FACS）数据进行图形化和统计学分析。
注：此处展示了单细胞联合 qPCR 与 FACS 数据的示例 图6 SIV感染细胞的宿主表面蛋白表达谱（剪接型病毒RNA）+ 恒河猴细胞), 图7 (CD4 剪接型病毒RNA中基因表达与表面CD4蛋白表达的关系+ 中国台湾猕猴细胞）以及先前已发表的20. 为鉴定目标细胞群体中差异表达的基因，建议采用前文所述的单细胞分析方法20,22,23,24，可反映基因阳性细胞的比例及连续的基因表达水平。
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结果
整个实验方案的工作流程如图1所示。根据分选细胞的数量，该流程分为两种形式：有限稀释法或单细胞分选，具体如文中所述。图2展示了对2倍系列稀释RNA进行引物-探针验证分析的示例。图3展示了用于识别潜在SIV+细胞的设门策略。图4展示了在有限稀释分选的细胞中，针对看家基因GAPDH 进行的质量控制qPCR结果，包括成功、次优和失败的示例。图5展示了四种SIV RNA亚型以及在感染细胞中差异表达的恒河猴基因的单细胞定量表达水平。图6通过流式细胞术检测，展示了SIV RNA+ CD4+ T细胞表面蛋白表达谱的代表性双变量图、直方图和散点图。
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讨论
本文所述方案称为tSCEPTRE，通过多参数流式细胞术对单细胞表面蛋白进行定量，并结合高度多重的逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测单细胞mRNA表达水平，将这两种技术相结合，能够在高通量条件下获得单细胞转录组与蛋白质组的高维度联合图谱。我们利用该方法鉴定此前难以捕获的SIV感染细胞。 体内，并描述差异表达的宿主基因和蛋白质。该方案可针对任何可通过表面蛋白、mRNA 或二者组合来区分的特定细胞群体进行适应性调整。所述方法依赖于精确的单细胞分选及流式细胞术数据记录，结合商业化的 qPCR 试剂和多重实时 PCR 仪器。所得结果为对单细胞水平下蛋白与基因表达数据的高灵敏度、定量评估。
其他已报道的方法可实现单细胞水平上蛋白与基因表达的关联分析1,25,26,27索引式FACS分选联合RNA测序已成功应用于造...
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披露
本研究工作由亨利·M·杰克逊军事医学进步基金会与美国国防部（DOD）之间的合作协议（W81XWH-07-2-0067）资助。文中观点仅为作者意见，不应被解释为代表美国陆军或国防部的立场。研究在经AAALACi认证的机构内依照批准的动物使用方案开展，遵循《动物福利法》及其他与动物实验相关的联邦法规和条例，并遵守《实验动物护理与使用指南》（美国国家研究委员会出版物，2011年版）中所述原则。
致谢
作者谨此感谢美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）疫苗研究中心（VRC）流式细胞术核心实验室以及军事人类疫苗计划（MHRP）流式细胞术核心实验室在FACS仪器和分选设备的维护与运行方面提供的支持；感谢Maria Montero、Vishakha Sharma和Kaimei Song提供的专业技术协助；感谢Michael Piatak, Jr.（已故）在SIV qPCR检测设计方面的帮助；以及感谢Brandon Keele和Matthew Scarlotta提供SIV分离株序列。本文所表达的观点仅为作者立场，不应被解释为代表美国陆军或美国国防部的立场。本研究在经国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证的设施中，依照批准的动物使用方案开展，符合《动物福利法》及其他与动物相关并涉及动物实验的联邦法规，并遵循美国国家研究委员会（NRC）2011年版《实验动物护理与使用指南》中所述的原则。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RNA提取及PCR试剂与耗材 | |||
| Genemate 96孔半裙边PCR板 | BioExpress/VWR | T-3060-1 | |
| 粘性PCR板封膜 | ThermoFisher | AB0558 | |
| Armadillo 384孔PCR板 | ThermoFisher | AB2384 | |
| MicroAmp 光学粘性膜 | Applied Biosystems/ThermoFisher | 4311971 | |
| DEPC 水 | 优质生物 | 351-068-101 | |
| 玻璃蒸馏水 | Teknova | W3345 | |
| Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen/ThermoFisher | 11732088 | |
| SUPERase-In Rnase抑制剂 | Invitrogen/ThermoFisher | AM2696 | |
| Platinum Taq | Invitrogen/ThermoFisher | 10966034 | |
| dNTP混合液 | Invitrogen/ThermoFisher | 18427088 | |
| ROX 参比染料（若与试剂盒分开提供） | Invitrogen/ThermoFisher | 12223012 | |
| DNA悬浮缓冲液 | Teknova | T0223 | |
| RNAqueous 试剂盒 | Invitrogen/ThermoFisher | AM1931 | |
| 未列入表2的TaqMan基因表达检测 | |||
| CD6 | 应用生物系统公司/赛默飞世尔科技 | Hs00198752_m1 | |
| TLR3 | 应用生物系统公司/赛默飞世尔科技 | Hs1551078_m1 | |
| Biomark 试剂 | |||
| 对照管线流体试剂盒 | Fluidigm | 89000021 | |
| TaqMan Universal PCR Mix | Applied Biosystems/ThermoFisher | 4304437 | |
| 检测加载试剂 | Fluidigm | 85000736 | |
| 样品上样试剂 | Fluidigm | 85000735 | |
| 动态阵列 96.96（芯片） | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| FACS 试剂 | |||
| SPHERO COMPtrol 羊抗小鼠（lambda） | Spherotech公司 | CMIgP-30-5H | |
| CompBeads Anti-Mouse Ig,k | BD Biosciences | 51-90-9001229 | |
| 带滤网盖的5 ml聚苯乙烯管 | FALCON | 352235 | |
| Aqua Live/Dead 染色 | Invitrogen/ThermoFisher | L34976 | 稀释1:800 |
| 小鼠抗人CD3 BV650 克隆SP34-2 | BD Biosciences | 563916 | 稀释1:40 |
| 小鼠抗人 CD4 BV786 克隆 L200 | BD Biosciences | 563914 | 稀释1:20 |
| 小鼠抗人 CD8 BUV496 单克隆抗体 RPA-T8 | BD Biosciences | 564804 | 稀释1:10 |
| 小鼠抗人 CD28 BV711 克隆 CD28.2 | Biolegend | 302948 | 稀释1:20 |
| 小鼠抗人 CD95 BUV737 克隆 DX2 | BD Biosciences | 564710 | 稀释1:10 |
| 小鼠抗人 CD14 BV510 单克隆抗体 M5E2 | Biolegend | 301842 | 稀释1:83 |
| 小鼠抗人 CD16 BV510 克隆 3G8 | Biolegend | 302048 | 稀释1:167 |
| 小鼠抗人 CD20 BV510 单克隆抗体 2H7 | Biolegend | 302340 | 稀释1:37 |
| 抗CD38-R PE 克隆 OKT10 | 非人灵长类试剂资源 | N/A | 稀释1:100 |
| 小鼠抗人 CD69 BUV395 克隆 FN50 | BD Biosciences | 564364 | 稀释1:10 |
| 小鼠抗人 HLA-DR APC-H7 克隆 G46-6 | BD Biosciences | 561358 | 稀释1:20 |
| 小鼠抗人 ICOS Alexa Fluor 700 单克隆抗体 C398.4A | Biolegend | 313528 | 稀释1:80 |
| 仪器 | |||
| BioPrptect 密封 containment enclosure | Baker | ||
| BD FACS Aria | BD Biosciences | ||
| ProtoFlex Dual 96孔PCR系统 | 应用生物系统公司/赛默飞世尔科技 | 4484076 | |
| Quant Studio 6 qPCR 仪器 | Applied Biosystems/ThermoFisher | 4485694 | |
| IFC 控制器 HX | Fluidigm | IFC-HX | |
| Biomark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD |
参考文献
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