本文的目的是详细介绍通过双腔体积描记法评估清醒小鼠呼吸功能的推荐操作步骤。
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摘要
摘要
清醒受试者在体描记箱内自主呼吸所引起的气量变化是体积描记法的基础。该技术可用于无创评估人类及实验动物的某些呼吸功能特征。本文重点介绍双腔体积描记法（DCP）在小型动物中的应用，提供该方法的理论背景，以及成功无创评估清醒、自主呼吸动物呼吸功能的详细分步操作流程。DCP可同时监测多只动物的呼吸功能，并可在选定时间段内重复检测气溶胶物质所诱导的呼吸变化。本文以对照组和过敏性小鼠实验为例，说明该技术的应用价值，解释相关的结果参数，并讨论其优势与局限性。总体而言，DCP提供的检测结果具有可靠的理论依据和有效性，可用于可信地评估清醒小型动物在基线状态及经气溶胶物质激发后的呼吸功能。
引言
随着利用小型动物模拟人类呼吸系统疾病的日益增多，人们迫切需要开发出能够对这些动物呼吸系统功能进行定量评估的技术。目前，强制振荡技术（FOT）被公认为评估小型动物呼吸力学最精确的方法1,2。然而，正如表型不确定性原理所指出的，FOT在测量精度上的优势是以牺牲非侵入性为代价的3。事实上，FOT测量需在高度受控的实验条件下进行，必须使用麻醉、气管切开或经口插管，以及机械通气；这种情形与真实生理状态相去甚远。
在实验要求禁止使用麻醉剂或需尽可能接近动物自然生理状态的情况下，可采用双腔体积描记法（DCP）。顾名思义，DCP装置由两个相连的刚性腔室组成，旨在尽可能严密地将动物的头部（或鼻部）与胸腔分隔开来：头部位于前腔室，胸腔位于后腔室。在该装置中，动物保持清醒状态，并在受到适当约束的同时自主呼吸。由于腔室壁不可伸缩，动物呼吸时气流的进出会引起周围空气的压缩与膨胀，从而在后 腔室内产生相应但相位相反的压力波动。因此，前腔室中由鼻腔气流引起的波形与后腔室中与胸腔运动相关的波形可被分离并同时记录。根据DCP装置的设计不同，这些波形可通过一组压力传感器或 pneumotachographs（气流传感器）进行采集 ，分别用于记录腔室内压力或气流随时间的变化。目前，后一种方法更为常用。
尽管动物的呼吸频率可以通过任何类型的体积描记技术准确定量，但在潮气量及其相关通气参数的测定方面，情况则有所不同。例如，每分钟通气量，呼气量 等等。）。与全身体积描记法（WBP）技术不同，后者通过箱体信号来估算动物的潮气量4,5DCP 技术能够准确评估潮气量。这与后腔室直接获取的动物胸廓运动有关，这些运动与呼吸过程中肺容积的变化成正比。
除了这些精确的通气参数（例如，潮气量、呼吸频率和每分钟通气量）外，呼吸周期形态的某些变化也可用于研究调控呼吸驱动或呼吸反射的神经机制。该应用的一个具体实例是评估吸入物质对上呼吸道感觉神经元的刺激潜力6。在此过程中，通过一个称为吸气末停顿（EIP）的参数来测定呼气起始时停顿的持续时间，该参数也被称为制动持续时间6。刺激性物质可延长这一停顿，与动物声门关闭相关，从而在呼气初期产生可测量的制动期6,7。
DCP 的另一个重要优势在于，它提供了两个经过验证且无争议的、对气流阻塞敏感的参数。其中一个参数称作潮气呼气中期流量，简称为 EF50。8,9,10它是每次潮气呼气过程中呼出潮气量中点时的气流速度。EF50 从胸腔流量曲线中提取，因此可在无需前腔室的情况下进行测量。即，采用头部外露配置）。另一种称为气道特异性阻力，缩写为 sRaw11,12,13. 测定比气道阻力（sRaw）需要同步记录动物的鼻腔和胸腔气流，因为该值是通过吸气末零气流点处这两个独立呼吸信号之间的时间延迟来计算的。此前已详细阐述了该时间延迟与sRaw之间关系的理论依据。11简而言之，肺容积的变化先于气流发生，因为需要先形成压力梯度以驱动气体流动。在安静呼吸的健康动物中，这种延迟通常非常短暂。然而，要维持特定气流所需的压力梯度（例如气流（足以提供充分通气的流量）受气道阻力程度的影响。例如，在支气管收缩期间，为维持特定气流所需的压力梯度更大，这意味着动物呼吸时需付出更大的做功。动物胸腔内压力梯度增大也意味着后腔进出气流中，因胸腔内空气膨胀/压缩所导致的部分占比更高，这部分胸腔总体扩张/回缩与鼻腔气流不同步。因此，支气管收缩引起的阻力增加会加大前后腔之间的延迟，从而升高比气道阻力（sRaw）。驱动肺部气流进出的压力梯度还受初始胸腔气体容积（TGV）的影响。例如，当TGV较大时，产生特定压力梯度所需的胸腔扩张/回缩幅度更大（仅仅是因为产生特定压力梯度所需容积位移更大），这也意味着动物呼吸需付出更大的做功。同样，这些额外的胸腔位移是为了实现胸腔内空气的膨胀/压缩，因此与鼻腔气流不同步。因此，TGV增加也会加大腔室间的延迟，从而升高sRaw。由此可见，支气管收缩和TGV增加均会导致动物将空气吸入和呼出肺部所需的努力程度增加。这正是sRaw的生理学意义所在：它代表了呼吸所需的做功。5,14.
因此，需要认识到有两个不同的因素会影响 sRaw：气道阻力和胸腔内气体容积（TGV）。事实上，sRaw 可表示为气道阻力与 TGV 的乘积11。清醒动物能够自主调节其 TGV，以使通气适应特定环境。在这种动物自然生理状态未受干扰的条件下，无法判断 sRaw 的变化究竟是源于气道阻力的改变、TGV 的变化，还是二者共同作用的结果。因此，建议将 DCP 评估与更为侵入性的呼吸力学和/或肺容积测量方法相结合，例如由 FOT 提供的测量方法1,15。
迄今为止，DCP 已被用于多种研究应用。该技术可在有或无头腔的情况下，对清醒小型动物的呼吸功能进行定量且准确的评估，以研究各种物质（如药物制剂、过敏原、刺激物或其他介质）对其呼吸功能的影响。16,17,18前室也可用作暴露室，用于接触气溶胶化物质或不同浓度的气体（如低氧、高碳酸血症）。 等等。)19方便的是，它可同时测量这些暴露的急性效应。事实上，DCP 的常见用途之一是在不同呼吸系统疾病模型中评估对雾化乙酰甲胆碱的反应程度。20,21,22,23,24,25.
尽管容积描记法（DCP）技术看似简单直接，但一些实际操作中的挑战可能会使缺乏经验的操作者望而却步，或影响结果的准确性与可重复性。本文详细描述了在清醒、固定且自主呼吸的小鼠中成功应用DCP记录呼吸功能的推荐操作流程。所述方法针对文中所列设备（详见材料表）进行了具体说明。此外，本文还通过两种小鼠品系在基线状态及吸入甲酰胆碱刺激后，常见肺部过敏性炎症模型的应用，展示了DCP技术的实用性和应用价值。
方案
以下实验程序均经魁北克心肺研究所动物护理委员会批准，符合加拿大动物护理委员会（CCAC）的指导方针。
1. 准备
- 研究
- (关键的) 在开展任何实验之前，须获得适当的批准（例如， IACUC）和培训（例如， 动物操作
- 熟悉设备及操作软件。阅读用户手册，如有需要，创建配置文件以定义位点数量、输入信号、分析仪和参数。
注意： 确保选择高采样率（2 KHz）。 - 根据感兴趣的参数配置分析仪的设置。
- 选择 调节 从工具栏中，然后 分析仪.
- 调整流速阈值至能够正确区分呼吸的数值（小鼠：0.5 mL/s），并选择 Ti + Te 以计算呼吸频率。
- 设定大气压值（760 mm Hg），并规定一次呼吸的有效性所允许的吸气/呼气容积最大偏差（小鼠：20%）。
- 点击 设置 在 计算参数 调整接受范围的阈值。
注意： 以下参数设置用于所述的小鼠实验：吸气时间，50 至 170 ms；呼气时间，40 至 180 ms；呼吸频率，30 至 450 bpm；气道特异性阻力，0 至 15 cmH2O·s；呼气中期流量，精确至至少3位小数。 - 完成后，选择 应用并关闭 退出对话框。
- 从工具栏菜单中，前往 调节 再次，然后 储存 设置所需的数据存储速率。单击 应用并关闭 退出窗口。
注意： 通常每10秒取一次平均值。 - 在操作软件中创建一个方案，以定义一系列指令及其各自所需的时序。 一个示例如下所示 图1.
- 如果实验涉及通过气溶胶给予物质，应根据待测试的浓度配制相应的溶液和稀释液。
- 动物
- 在远离动物饲养室的安静区域进行操作。让动物适应环境的变化。
- 称量动物并选择合适尺寸的固定装置。
- (关键的在实验开始前，使动物适应固定装置及操作流程。根据实验设计，可进行多次适应性训练，持续时间逐渐增加（例如， 可能需要 5-30 分钟。
注意： 未适应环境的动物应从研究中剔除。- 每次适应性训练时，将动物从固定装置的后端开口插入；保持装置垂直可能有助于操作。
- 动物就位后，插入背部推杆，并轻轻将其固定到位，避免施加过大的力量。
- (关键的目视检查动物呼吸是否正常。如有需要，通过移动锁定装置调整其位置。确保 动物的鼻孔伸出鼻锥，吻部紧贴固定器内壁。
- 拆下胸腔室的后侧面板，将装有动物的固定装置通过胸腔室的橡胶开口插入，然后关闭胸腔室。
- 安装头部固定装置并提供偏置气流。小鼠的气流速率为 0.5 L/min。
- 让动物休息5分钟。
- 动物安静后，开始记录鼻腔和胸腔的呼吸气流信号。在电脑屏幕上确认波形平滑，并显示规律的呼吸模式；示例见 图2.
注意： 如果实验方案涉及气溶胶给药，则可在适应性程序中加入生理盐水激发。 - 每次实验结束后，将动物从胸腔仓和固定装置中取出，放回其饲养笼具并送回饲养室。
- 仪器设备
- 实验当天，启动实验程序并加载相应的配置文件。
注意： 确认其包含实验所需的方案。 - 前往 运行 在工具栏菜单中，输入实验和动物的相关信息。完成后，点击 运行 窗口底部的按钮。
- 继续进行系统的校准。分别校准每个位点和输入信号。
- 打开偏置气流发生器，通过一段管路将其连接至头部腔室，并调节流速。
- 用盖子封闭头部室的顶部开口。
- 拆下胸腔室的后板，将校准工具牢固地插入头腔与体腔之间的橡胶开口内，以形成密闭密封。然后关闭并重新安装胸腔室的后板。
- 确认胸腔的侧端口已加盖。
- 从软件工具栏菜单中，前往 调节 然后 校准.
- 前往 输入1（胸部） 并选择 校准 启动胸腔血流信号的校准对话框。
- (关键的) 验证校准对话框窗口中列出的参数是否显示适当的设置， 即， 施加的物理应力较低: 0; 施加的物理应力较高：-20 mL/s； 样本：整合。完成后，点击 低 在 样本 窗口。
- 验证信号在显示窗口内是否恒定，然后单击 关闭.
- 通过塑料连接器和一段管路，将一个20 mL注射器连接到胸腔室的侧端口。
- (关键的选择 高 在 样本 打开窗口，并在2秒内以尽可能恒定的流速向腔室内注入20 mL空气。
- 确认生成的信号完全显示在窗口内。使用箭头图标检查信号是否以零线为中心且对称。然后，单击 关闭. 通过点击消除零位偏移 去除交流偏移 在 样本 窗
注意： 如有需要，可重新进行高值校准。 - 验证最终结果 量程输入范围 是 在推荐范围内（小鼠：±280 至 ±420 mL/s）。(关键的如果数值超出可接受范围，则需重复校准步骤。
- 以与胸腔校准类似的方式校准头部腔室（步骤 1.3.3.6）。此次，选择 输入2（鼻腔）.
注意： (重要) 该数值为 施加的物理应力较高 必须设置为+20 mL/s，这将改变前腔相对于后腔的气流方向。因此，当动物呼吸时，两个气流信号将几乎同相，仅存在用于计算sRaw的延迟差异。
- 实验当天，启动实验程序并加载相应的配置文件。
2. 肺功能测量
- 称量动物并记录其体重。
- 将动物放入固定器中，并将其置入胸式体积描记室（参见步骤 1.2.3.1 至 1.2.3.5）。
- 让动物静息至少 5 分钟。
- 通过选择第一步并点击 执行，启动命令协议。
- 在计算机屏幕上检查动物的呼吸信号是否规律且平稳（图 2）。软件会自动逐次呼吸显示计算出的各项参数。 确认动物的各项参数已趋于稳定。
- 在基础状态下记录最多 10 分钟的呼吸模式。
- 对于通过气溶胶给予测试物质的实验方案，请按以下步骤操作：
- 根据需要调整雾化器的工作时间与占空比。
注意： 本文示例中，雾化器以 5% 占空比运行 10 秒。 - 进行溶剂对照刺激（例如，生理盐水），并记录反应。
- 如需，通过逐步增加雾化器中测试物质的浓度（例如，浓度倍增），使动物暴露于递增浓度的测试物质中。每次给药后均记录反应。
- 实验结束后，若系统未自动停止，应手动停止记录，并将动物送回饲养笼和饲养室。
- 根据需要调整雾化器的工作时间与占空比。
- 如需进行另一次实验，可在工具栏菜单中选择 运行。
- 两次实验之间，清洁体积描记室，并用水冲洗雾化器。
注意： 使用酒精可能会对体积描记仪造成不可逆的损害。
- 两次实验之间，清洁体积描记室，并用水冲洗雾化器。
- 若研究涉及多个时间点的重复评估，应在每个选定时间点重复整个测量流程。
注意： 建议结合进行一些精确的呼吸力学和/或肺容积测量1,15，以完善研究内容。
3. 数据分析
注意：当实验会话结束时，软件会自动保存实验文件并导出记录的参数。
- 为每只动物和实验组的感兴趣参数计算基线平均值。
注意：表1列出了一些典型参数，根据其提供的信息类型进行了分类。 - 在相关情况下，使用特定时间点（例如，最大值或最小值）、平均值或完整的时间过程来评估所研究的气溶胶物质在各个浓度下对感兴趣参数的影响；也可考虑对基线进行归一化处理。
- 以表格或图形形式报告组均值及误差结果，并进行统计学分析。
注意： 在本研究中，采用重复测量的双因素方差分析（two-way ANOVA）评估乙酰甲胆碱、过敏原——屋尘螨（HDM）及其交互作用对两种小鼠品系不同DCP读数（sRaw和EF50）以及不同FOT读数（RN、G和H）的影响。随后使用Sidak多重比较检验确定过敏小鼠与对照小鼠在哪些乙酰甲胆碱浓度下存在差异。同样使用这些检验方法评估天数、HDM及其在基线期（即，乙酰甲胆碱前）对气道阻塞指标（sRaw和EF50）和通气模式参数（BF、TV、MV和EIP）的交互影响。采用Pearson相关性分析评估DCP测得的sRaw与FOT测得的RN之间的相关性。所有统计分析和图表均使用标准统计软件（例如，GraphPad Prism）完成。当p ≤ 0.05时，认为有足够证据拒绝零假设。
结果
在对照组和过敏性 BALB/c 小鼠中，于基础状态下连续3天（方案中的第12、13和14天，见图1）重复进行DCP呼吸功能评估的结果如图3所示。用于评估呼吸模式的参数包括呼吸频率（图3A）、潮气量（图3B）、每分钟通气量（图3C）和吸气末暂停时间（图3D）。用于评估气道阻塞的参数为EF50（图3E）和气道阻力（sRaw，图3F）。在两组动物中，各选定参数在这连续三天内的检测结果均保持稳定，过敏性炎症未引起明显影响。
通过连续数日（方案中所示的第12、13和14天）的DCP评估对甲氯环素的反应程度。 图1) 在对照组和过敏性 BALB/c 小鼠中的表达。结果如图所示 图 4，显示对气道阻塞敏感的两个参数的变化，即 sRaw（图 4A, B 和 C）和 EF50 (图4D, E 和 F）。正如预期，逐步增加的甲基胆碱浓度使气道阻力（sRaw）逐渐升高，同时使50%肺活量时的呼气流量（EF50）逐渐降低。过敏性炎症增强了这些反应，尤其是在测试的最高浓度下，表明存在气道高反应性。结果还显示，这种增强的反应程度仅局限于第12天（第1天），在随后两次评估中均未观察到该现象即，在第13天和第14天。
在对照组和过敏性 BALB/c 小鼠中，于实验方案的最后一天（第15天；图1）进行强迫振荡技术（FOT）评估呼吸力学的结果如图5所示。这些实验被纳入研究中，以补充直流脉冲（DCP）评估的结果。FOT 被公认为评估呼吸功能更为精确的方法2。其优势之一在于能够提供肺部不同部位（传导气道与外周气道及肺组织）受干预措施（例如，过敏原和乙酰甲胆碱）影响的拓扑信息。此前已有文献描述了使用 FOT 评估呼吸力学的推荐方法1。本研究中采用了三个 FOT 参数来描述由过敏性炎症和乙酰甲胆碱诱导的呼吸力学变化，这些参数包括：1-牛顿阻力（RN；图5A），该参数的数值变化主要反映大传导气道阻力的变化；2-组织阻尼（G；图5B），该参数的数值变化主要反映组织阻力的变化；以及 3-组织弹性（H；图5C），该参数的数值变化主要反映组织刚度的变化2。如预期所示，随着乙酰甲胆碱浓度逐步增加，这三个参数均出现上升。与前一天（第14天；图1）通过 DCP 获得的 sRaw 和 EF50 结果一致，乙酰甲胆碱诱导的 RN 变化在对照组和过敏性小鼠之间相似（图5A）。事实上，第14天的 sRaw 值与第15天的 RN 值呈相关性（图5D）。乙酰甲胆碱诱导的 H 升高在两组小鼠之间也相似（图5B）。然而，乙酰甲胆碱诱导的 G 增加在过敏性小鼠中显著更高（图5C）。该结果表明，在第15天，过敏性小鼠仍存在持续的高反应性表型，而此前两天进行的 DCP 评估未能检测到这一现象。
整个研究使用 C57BL/6 小鼠重复进行。在实验方案的第 12、13 和 14 天对 sRaw 进行连续 DCP 评估的结果（图1，以及FOT评估中的RN，第15天的结果如图所示 图6. 在该特定小鼠品系中，过敏小鼠所表现出的甲胆碱反应增强现象在连续三天内保持稳定图6A, B，以及 C）。这种高反应表型在第15天通过FOT也得以呈现，表现为R的升高N 由氯甲胆碱诱导，在过敏小鼠中更为显著（图6E）。这与 BALB/c 小鼠的结果形成鲜明对比，在 BALB/c 小鼠中，从第 12 天到第 14 天，高反应性逐渐减弱（图4)以及在甲胆碱诱导的R上升中无差异N 在第15天观察到（图 5A). 综合来看，这些结果表明过敏原对两种小鼠品系的乙酰甲胆碱诱导反应具有随时间变化的影响。重要的是，这种品系差异在直接气道阻力测量法（DCP）和强迫振荡技术（FOT）中均得到体现。一致地，第14天通过DCP测得的特异性气道阻力（sRaw）值与R值具有相关性N 在第15天通过FOT测量（图 6F)，这与在BALB/c小鼠中观察到的结果一致（图 5D).
图 1。用于诱导肺部过敏性炎症及评估对乙酰甲胆碱反应程度的实验方案。 本研究使用 7 至 9 周龄的雌性 BALB/c 和 C57BL/6 小鼠。整个研究过程中所实施干预措施的时间顺序如图中（A）所示。其中一半小鼠在连续 14 天内每天经鼻给予 50 µg 尘螨（HDM）提取物，以诱导肺部过敏性炎症；另一半小鼠则给予盐水作为对照。呼吸功能通过双腔体容积描记法（DCP）在三个独立时间点（第 12、13 和 14 天；黑色圆圈）进行评估，此前在第 11 天（灰色圆圈）进行了一次适应性测试，其中包括雾化盐水激发。每次测试期间，均采用图（B）所示的自动化程序评估基础呼吸功能及对乙酰甲胆碱的反应。在第 15 天，按照先前描述的方法1，采用强迫振荡技术（FOT）对呼吸力学进行侵入性评估。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2．健康 BALB/c 小鼠的代表性气流信号。 图中显示了在基线条件下通过双腔体积描记法在对照小鼠中获得的典型记录曲线。上图显示胸腔气流，下图显示鼻腔气流。负值代表吸气阶段，正值代表呼气阶段。请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 在清醒的 BALB/c 小鼠中重复评估呼吸功能 通过双腔体积描记法（DCP）评估对照组（空心符号）和过敏性（实心符号）小鼠在图示方案第12、13和14天的基础呼吸功能 图1用于评估呼吸功能的DCP参数包括呼吸频率（A），潮气量（TV）在（B），每分通气量（MV）在（C），吸气末暂停（EIP）在（D），呼气中期潮气量（EF50）流速（E），以及气道特异性阻力（sRaw）在（F每只小鼠的呼吸频率、潮气量（TV）、每分钟通气量（MV）、特异性气道阻力（sRaw）和弹性阻力指数（EIP）取1.5分钟内的平均记录值，EF50的值则取自该记录期间的最小值。结果以组均值±标准差表示（n=5/组）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4。 清醒BALB/c小鼠的甲胆碱支气管激发试验。 通过双腔体容积描记法（DCP）评估对照组（空心符号）和过敏组（实心符号）小鼠在方案第12、13和14天的甲胆碱反应性，该方案如图1所示。用于评估反应的DCP参数包括特异性气道阻力（sRaw），见图（A）至（C），以及潮气呼气中期流量（EF50），见图（D）至（F）。支气管激发通过在DCP头部腔室中以递增浓度气溶胶化甲胆碱10秒完成。每次给药浓度后持续监测1.5分钟内的反应。每只小鼠在每个浓度下的sRaw值为1.5分钟内记录的平均值，EF50值则为该记录期间获得的最小值。结果以每组均值±标准差表示（n=5/组）。星号*表示具有统计学显著性差异（p 
0.05）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5．BALB/c小鼠呼吸力学的侵入性评估。 在方案第15天，采用强迫振荡技术（FOT）评估基础状态及对乙酰甲胆碱的呼吸力学反应，该方案如图1所示。对照组（空心符号）和过敏组（实心符号）小鼠与第12、13和14天接受双腔体积描记法（DCP）检测的小鼠相同。用于评估呼吸力学的参数包括牛顿阻力（RN）（A）、组织弹性（H）（B）和组织阻尼（G）（C）。支气管激发试验通过将递增浓度的乙酰甲胆碱雾化并直接导入仰卧位、麻醉、气管切开、瘫痪并机械通气的小鼠气管内完成。每次给药后监测5分钟内的反应。每只小鼠在每个浓度下的各参数值为该记录期间获得的峰值。结果以均值±标准差表示（n=5/组）。图（D）显示了第14天通过DCP测量的特异性气道阻力（sRaw）与第15天通过FOT测量的RN之间的相关性。空心符号代表基础值，实心符号代表对照组（圆形）或过敏组（方形）小鼠在最高测试浓度下的最大值。插图显示了决定系数（r2）。星号*表示具有统计学显著性差异（p ≤ 0.05）。请点击此处查看本图的放大版本。
图 6。 C57BL/6 小鼠的呼吸功能与侵入性呼吸力学。 通过双腔体描记法（DCP）在基线状态及给予乙酰甲胆碱后的反应中测定对照组（空心符号）和过敏组（实心符号）小鼠的特异性气道阻力（sRaw），测定时间分别为方案第12天（A）、第13天（B）和第14天（C），该方案如图 1所示。牛顿阻力（RN）在基线状态及对乙酰甲胆碱的反应通过强迫振荡技术（FOT）于第15天测定（D）。支气管激发试验的操作方法分别如图 4和图 5中针对DCP和FOT所述。结果以每组均值±标准差表示（n=5/组）。图（E）显示了第14天通过DCP测得的sRaw与第15天通过FOT测得的RN之间的相关性。空心符号代表基线值，实心符号代表对照组（圆形）或过敏组（方形）小鼠在所测试最高浓度乙酰甲胆碱下的最大值。插图显示决定系数（r2）。星号*表示具有统计学显著性差异（p ≤ 0.05）。请点击此处查看本图的放大版本。
| 参数 | 单位 | 描述 | 信息 |
| F | bpm | 呼吸频率 | 通气模式 |
| TV | mL | 潮气量 | |
| MV | mL | 每分钟通气量 | |
| Ti | ms | 吸气时间 | |
| Te | ms | 呼气时间 | |
| PIF | mL/s | 峰值吸气流速 | |
| PEF | mL/s | 峰值呼气流速 | |
| EV | mL | 呼气容积 | |
| NTV | mL | 鼻腔潮气量 | |
| NEV | mL | 鼻腔呼气容积 | |
| EIP | ms | 吸气末暂停时间 | |
| EEP | ms | 呼气末暂停时间 | |
| dT | ms | 时间延迟 | 气流阻塞 |
| sRaw | cmH2O·s | 特异性气道阻力 | |
| sGaw | 1/cmH2O·s | 特异性气道传导率 | |
| EF50 | mL/s | 潮气呼气中期流量 | |
| Sr | % | 成功率 | 质量控制 |
| N | 有效呼吸次数 |
表1. 双腔体积描记法获得的典型参数列表。 这些参数根据其在呼吸功能评估过程中所提供的信息类型进行分组。
| 优点 | 局限性 |
| · 动物保持清醒状态 | · 需要严格控制周围环境 |
| · 通气参数准确 | · 实验前需对动物进行适应性驯化 |
| · 气流阻塞的明确指标（sRaw、EF50） | · 需将鼻部与胸腔气流完全隔离 |
| · 可适用于多种物种及不同体型的动物 | · 某些结局参数的绝对值存在变异性 |
| · 已广泛应用于多项研究 | · sRaw 并非气道阻力的真实测量值 |
| · 操作方法简便 | · 存在上呼吸道的影响 |
| · 对变化敏感 | · 需结合侵入性评估方法补充测量 |
表2. 双腔体积描记法相关优势与局限性列表。
| 双腔体积描记法 | 强迫振荡技术 | |
| 动物意识状态 | 未改变 | 麻醉（通常同时麻痹） |
| 动物体位 | 直立 | 仰卧 |
| 动物可接近性 | 限制在腔室内 | 可接触 |
| 动物与测量装置的连接方式 | 鼻部或颈部密封 | 气管切开或经口插管 |
| 动物气道树状态 | 完整 | 部分——上呼吸道段被排除（如鼻道、咽和喉） |
| 获取结果参数时的肺容积 | 可变——动物自发采用的容积 | 标准化——通过可控的肺复张操作和呼气末正压实现 |
| 结果参数的评估频率 | 可变——动物自发呼吸频率 | 可控——使用预设波形在特定频率下进行 |
| 上呼吸道段对结果参数的贡献 | 预期存在 | 被规避 |
| 气溶胶给药部位 | 头部腔室内部 | 直接进入气管 |
| 上呼吸道段对吸入剂量/气溶胶沉积模式的影响 | 预期存在 | 被阻止 |
| 检测变化的能力——基于本研究结果 | 观察到 | 观察到 |
| 技术本身的固有变异性——基于本研究结果 | 基础状态下sRaw变异系数的波动范围：7.5 - 20.6% | 基础状态下RN变异系数的波动范围：3.6 - 13.4% |
表3. 双腔体积描记法与强迫振荡技术的比较。
讨论
在呼吸系统研究中，显然有必要对清醒状态下的动物进行肺功能测定。通常情况下，双腔体描记法（DCP）是一种用于评估清醒且自主呼吸动物呼吸系统通气功能的有价值的方法26。更具体而言，DCP 及其头部伸出式变体通常在所提供信息的质量与期望的侵入程度之间取得恰当平衡3（表2）。该技术可适用于多种物种（例如，小鼠、大鼠、豚鼠）或不同体型的动物，并可用于多种研究场景。它特别适用于在平行实验设计中同时评估大量动物、以重复方式监测呼吸功能，以及动态捕捉生理反应的动力学过程。此外，该技术操作简便，可在相对较短时间内掌握。本文以小鼠中应用 DCP 测量的实验方案为例，详细描述了这种限制性体积描记技术的实际操作要点，并讨论了关键步骤及相关结果。
在处理清醒动物时，必须严格控制周围环境的条件（例如， 安静的房间内，人员和活动应尽量减少，以确保结果的可重复性。由于固定装置有多种尺寸，选择合适大小的装置至关重要，以确保动物呼吸运动不受干扰。此外，让动物适应实验装置和操作流程通常十分必要且有帮助，因为在小鼠中已有充分证据表明，固定会显著影响其呼吸频率。12根据实验设计或条件的不同，可能需要进行多轮持续时间逐渐增加的实验。最后，在实验开始时留出一定时间，让动物适应环境变化和必要的操作处理，这一简单措施已被证明能有效确保动物在基线状态下的呼吸模式保持稳定、规律且放松。在动物舒适、充分适应且状态平静的条件下开展实验，也有助于降低结果的变异性并提高数据质量。此外，这还能限制因应激引发的儿茶酚胺释放，从而避免气道管径增大，减轻诱发的支气管收缩效应。
必须认识到，有必要尽可能严密地将鼻腔和胸腔气流分离开来 。根据所研究的系统或物种不同，密封机制在形状和密封效果上可能有所差异。在本文所述的双腔探针（DCP）系统中，密封是在动物的吻部与固定装置之间形成的。在使用DCP评估呼吸功能时，还必须提供充足且持续的偏置气流，因为动物可利用的氧气水平下降将导致显著影响。考虑到动物在固定装置中的福利，可减少因动物躁动而产生的漏气倾向，从而最大限度地提高数据质量。相反，若密封失效，则可能导致数据集被舍弃或某些参数被低估。
除了可用于单独记录鼻腔气流信号外，头部暴露舱通常还用于使动物接触气溶胶化物质。如本文所示，该方法可用于进行支气管激发试验，以展示不同程度的气道反应性。在此类实验中，根据所研究动物的物种、品系或性别，可能需要调整测试浓度的范围。如先前研究所示8,9,10,27，目前的结果表明，乙酰甲胆碱引起的功能残气量比值（sRaw）变化与侵入性FOT测量的气道阻力具有良好的相关性。结果还表明，DCP技术在敏感性上不如FOT 其检测呼吸功能障碍的能力，以及识别局限于肺部较低区域（肺组织和/或外周小气道）的异常反应的能力。由于动物的气道保持完整，上气道的存在构成了总呼吸道气流阻力的主要部分28，除了会减弱下呼吸道对测量结果的贡献外，还可能影响气溶胶的分布与沉积。 表3 总结了DCP技术与FOT之间的其他差异。最后，尽管从sRaw测量值理论上可以估算动物的总气道阻力（包括上气道），但通常建议将DCP评估与FOT等侵入性测量技术结合使用。29 以获取详细的呼吸力学直接测量数据。根据研究目的，也可考虑测量上气道阻力。30,31,32.
结论
由于其侵入性程度较低，DCP 是一种能够在呼吸系统研究中满足重要需求的技术。该技术可在清醒动物中同步提供准确的通气模式读数以及一些无可争议的气流阻塞指标。所获得的信息也确实对更具侵入性的方法所得结果形成了有效补充。
披露
DB 和 AR 任职于 SCIREQ Scientific Respiratory Equipment Inc.，这是一家与本文内容相关的商业实体。DB 还持有该公司股票。SCIREQ Inc. 是 emka TECHNOLOGIES 公司旗下企业。
致谢
SML 获得加拿大卫生研究院研究生奖学金的支持，MG 获得魁北克卫生研究基金会（FRQS，Fonds de recherche du Québec – Santé）呼吸健康网络助学金的支持，YB 为 FRQS 的研究学者。
作者贡献
所有作者均参与了论文和/或视频的构思。SML 和 LD 收集了数据。SML、LD、YB、DM、DB 和 AR 参与了数据分析、图表制作及论文撰写。YB、AR、KL 和 MG 参与了视频脚本的准备。该短剧由 YB、KL 和 MG 演出。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酰-β-甲基胆碱氯化物 | Sigma-Aldrich | A-2251 | 甲基胆碱 |
| 磷酸盐缓冲液 | Multicell | 311-506-CL | PBS 10X |
| 屋尘螨提取物 | GREER | 290902 | HDM |
| DCP 完整系统 | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
| iox 软件 | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
| Aerogen Aeroneb 雾化器 | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
| flexiVent FX 完整系统 | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES |
参考文献
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. J Vis Exp. (75), e50172(2013).
- Bates, J. H. T. CORP: Measurement of lung function in small animals. J Appl Physiol (1985). 123 (5), 1039-1046 (2017).
- Bates, J. H., Irvin, C. G. Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle. J Appl Physiol. 94 (4), 1297-1306 (2003).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. J Vis Exp. (90), e51755(2014).
- Enhorning, G., van Schaik, S., Lundgren, C., Vargas, I. Whole-body plethysmography, does it measure tidal volume of small animals? Can J Physiol Pharmacol. 76 (10-11), 945-951 (1998).
- Vijayaraghavan, R., Schaper, M., Thompson, R., Stock, M. F., Alarie, Y. Characteristic modifications of the breathing pattern of mice to evaluate the effects of airborne chemicals on the respiratory tract. Arch Toxicol. 67 (7), 478-490 (1993).
- Willis, D. N., Liu, B., Ha, M. A., Jordt, S. E., Morris, J. B. Menthol attenuates respiratory irritation responses to multiple cigarette smoke irritants. FASEB J. 25 (12), 4434-4444 (2011).
- Neuhaus-Steinmetz, U., et al. Sequential development of airway hyperresponsiveness and acute airway obstruction in a mouse model of allergic inflammation. Int Arch Allergy Immunol. 121 (1), 57-67 (2000).
- Glaab, T., et al. Tidal midexpiratory flow as a measure of airway hyperresponsiveness in allergic mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 280 (3), L565-L573 (2001).
- Glaab, T., et al. Noninvasive measurement of midexpiratory flow indicates bronchoconstriction in allergic rats. J Appl Physiol (1985). 93 (4), 1208-1214 (2002).
- Pennock, B. E., Cox, C. P., Rogers, R. M., Cain, W. A., Wells, J. H. A noninvasive technique for measurement of changes in specific airway resistance. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 46 (2), 399-406 (1979).
- DeLorme, M. P., Moss, O. R. Pulmonary function assessment by whole-body plethysmography in restrained versus unrestrained mice. J Pharmacol Toxicol Methods. 47 (1), 1-10 (2002).
- Flandre, T. D., Leroy, P. L., Desmecht, D. J. Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice. J Appl Physiol (1985). 94 (3), 1129-1136 (2003).
- Criee, C. P., et al. Body plethysmography--its principles and clinical use. Respir Med. 105 (7), 959-971 (2011).
- Robichaud, A., et al. Automated full-range pressure-volume curves in mice and rats. J Appl Physiol (1985). 123 (4), 746-756 (2017).
- Mizutani, N., Goshima, H., Nabe, T., Yoshino, S. Complement C3a-induced IL-17 plays a critical role in an IgE-mediated late-phase asthmatic response and airway hyperresponsiveness via neutrophilic inflammation in mice. J Immunol. 188 (11), 5694-5705 (2012).
- Nabe, T., et al. Roles of basophils and mast cells infiltrating the lung by multiple antigen challenges in asthmatic responses of mice. Br J Pharmacol. 169 (2), 462-476 (2013).
- Morris, J. B., et al. Immediate sensory nerve-mediated respiratory responses to irritants in healthy and allergic airway-diseased mice. J Appl Physiol (1985). 94 (4), 1563-1571 (2003).
- Merazzi, D., Mortola, J. P. Effects of changes in ambient temperature on the Hering-Breuer reflex of the conscious newborn rat. Pediatr Res. 45 (3), 370-376 (1999).
- Rao, R., Nagarkatti, P. S., Nagarkatti, M. Delta(9) Tetrahydrocannabinol attenuates Staphylococcal enterotoxin B-induced inflammatory lung injury and prevents mortality in mice by modulation of miR-17-92 cluster and induction of T-regulatory cells. Br J Pharmacol. 172 (7), 1792-1806 (2015).
- Agrawal, A., et al. Inhibition of mucin secretion with MARCKS-related peptide improves airway obstruction in a mouse model of asthma. J Appl Physiol (1985). 102 (1), 399-405 (2007).
- Mabalirajan, U., Aich, J., Agrawal, A., Ghosh, B. Mepacrine inhibits subepithelial fibrosis by reducing the expression of arginase and TGF-beta1 in an extended subacute mouse model of allergic asthma. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297 (3), L411-L419 (2009).
- Desmet, C., et al. Treatment of experimental asthma by decoy-mediated local inhibition of activator protein-1. Am J Respir Crit Care Med. 172 (6), 671-678 (2005).
- Zang, N., et al. Pulmonary C Fibers Modulate MMP-12 Production via PAR2 and Are Involved in the Long-Term Airway Inflammation and Airway Hyperresponsiveness Induced by Respiratory Syncytial Virus Infection. J Virol. 90 (5), 2536-2543 (2015).
- Shukla, M., et al. Carryover of cigarette smoke effects on hematopoietic cytokines to F1 mouse litters. Mol Immunol. 48 (15-16), 1809-1817 (2011).
- Murphy, D. J. Respiratory function assessment in safety pharmacology. Curr Protoc Pharmacol. , Chapter 10 Unit10 19 (2003).
- Lofgren, J. L., et al. Restrained whole body plethysmography for measure of strain-specific and allergen-induced airway responsiveness in conscious mice. J Appl Physiol (1985). 101 (5), 1495-1505 (2006).
- DiMaria, G. U., Wang, C. G., Bates, J. H., Guttmann, R., Martin, J. G. Partitioning of airway responses to inhaled methacholine in the rat. J Appl Physiol (1985). 62 (3), 1317-1323 (1987).
- Hoymann, H. G. Lung function measurements in rodents in safety pharmacology studies. Front Pharmacol. 3, 156(2012).
- Agrawal, A., Singh, S. K., Singh, V. P., Murphy, E., Parikh, I. Partitioning of nasal and pulmonary resistance changes during noninvasive plethysmography in mice. J Appl Physiol (1985). 105 (6), 1975-1979 (2008).
- McLeod, R. L., Young, S. S., Erickson, C. H., Parra, L. E., Hey, J. A. Characterization of nasal obstruction in the allergic guinea pig using the forced oscillation method. J Pharmacol Toxicol Methods. 48 (3), 153-159 (2002).
- Miyahara, S., Miyahara, N., Takeda, K., Joetham, A., Gelfand, E. W. Physiologic assessment of allergic rhinitis in mice: role of the high-affinity IgE receptor (FcepsilonRI). J Allergy Clin Immunol. 116 (5), 1020-1027 (2005).
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