清醒小鼠中使用玻璃光导电极进行光遗传学鉴定神经元类型

摘要

本研究介绍了一种使用定制玻璃光导电极在清醒小鼠中可靠地进行光遗传学单细胞记录的方法。

摘要

神经科学领域的一个主要关注点是不同类型的神经元如何在神经回路中发挥作用。近年来光遗传学技术的进步使得研究人员能够鉴定神经元类型 体内 在广泛的脑区进行电生理实验时，光遗传学实验的关键在于将光有效传递到记录位点。然而，从脑表面将刺激光传递至深部脑区往往具有挑战性。尤其当脑表面光学透明度较低时——这在清醒动物记录中十分常见——刺激光更难到达深部脑区。本文介绍一种利用自制玻璃光刺激电极记录清醒小鼠神经元光诱导放电反应的方法。该方法通过记录用玻璃电极传导光，从而实现对深部脑区被记录神经元的可靠光刺激。此自制光刺激电极系统采用易获取且成本较低的材料，组装简便。

引言

中枢神经系统由多种类型的神经元组成，这些神经元具有不同的功能。这些不同类型的神经元如何在神经环路中发挥作用，是神经科学领域的主要关注问题之一。然而，在许多脑区，由于电活动本身的放电信号并无明显差异（少数例外情况除外），在体内电生理记录中难以区分神经元类型。近年来光遗传学技术的进步实现了重大突破^1,2。通过使用转基因动物，使光敏感视蛋白（例如，通道视紫红质-2）在特定类型的神经元中表达，现在可以在体内记录中高效地区分神经元类型^3,4,5,6。在这些动物中，电生理记录期间施加光刺激可特异性激活表达光敏感视蛋白的神经元，而其他神经元则不会被激活。因此，通过其对光刺激的响应，可轻松将表达视蛋白的神经元与其他类型的神经元区分开来。

在光遗传学实验中，将光有效传递至记录位点至关重要。作为一种非侵入性方法，光通常从脑表面导入。然而，由于光在穿过脑组织时强度会逐渐衰减，因此从脑表面刺激深部脑区十分困难。尤其当脑表面光学透明度较低时，刺激光更难以到达深部脑区，这种情况在清醒动物的记录中尤为常见。电生理实验通常在麻醉动物上进行，因为动物身体的运动会在记录中引入噪声。然而，已有充分文献表明，麻醉会改变神经反应^7,8,9,10。因此，为了研究不受麻醉人为效应干扰的神经反应，有必要使用清醒动物。与麻醉动物实验不同，清醒动物的电生理记录是在手术恢复后进行的。在手术与记录之间的间隔期内，组织渗出物常在脑表面聚集，导致脑表面光学透明度降低。

本文介绍了一种使用自制玻璃光刺激电极在清醒小鼠中进行单细胞记录的方法。该方法通过记录用的玻璃电极传递光信号，从而能够可靠地对深部脑区中被记录的神经元进行光刺激。这种自制的光刺激电极系统由易于获取且成本较低的材料组成，组装简便。

方案

所有操作均遵循日本生理学会的指导原则，并经金泽医科大学动物护理委员会批准。

1. 玻璃光导电极架的构建

注意：构建玻璃光导电极架时，需使用商用的电极架（图1A）。

1. 轻轻将压力控制用的不锈钢管从持针器筒体中抽出。
2. 通过钻孔，扩大持针器筒体上针座侧的孔，使其直径为 3 mm，深度为 12 mm。
3. 将一根不锈钢管（直径 3 mm，壁厚 0.5 mm，长度 8 mm；图 1A2）插入该孔中。
4. 将一个用于 ⌀2.5 mm 插芯的陶瓷分体对接套筒（图 1A1）插入孔中。
5. 使用环氧胶将电极持针器的筒体固定在 L 形凹槽接头中。
6. 在凹槽接头上加工出孔（直径 3 mm），并用螺钉将其固定在操纵器上。

2. 头部固定装置安装

1. 使用电路板间隔柱制作一个定制的头固定柱。用铣刀将柱状电路板间隔柱加工成矩形，并用锯子切割成两个头固定柱（图1B）。用铣刀将头固定柱底部磨平。
2. 准备一种转基因动物，使其特定类型的神经元表达光敏感视蛋白用于研究。本实验中使用的是抑制性神经元表达通道视紫红质-2（ChR2）的转基因小鼠（VGAT-ChR2小鼠）¹¹。
3. 通过腹腔注射给予0.3 mg/kg美托咪啶、4.0 mg/kg咪达唑仑和5.0 mg/kg布托啡诺的混合物以麻醉动物。通过夹捏尾巴测试动物反应，确认其已完全麻醉。
4. 将小鼠置于加热垫上的立体定位仪中。提前用70%酒精清洁立体定位仪和加热垫。将门齿放入咬杆孔中，轻轻夹紧鼻部固定器。使用耳杆固定头部两侧。当耳杆正确固定头部后，进一步收紧鼻部固定器。在眼睛上涂抹眼用软膏。
5. 用小剪刀剃除头部皮肤毛发，并用蘸有氯己定葡萄糖酸盐的棉签清洁头皮。手术前，将所有手术器械和头固定柱在高压灭菌器中灭菌（121 °C，15分钟）。
6. 用剪刀沿中线切开头皮并将其拨开。切口从头部后方延伸至眼睛前方（约20 mm）。用蘸有70%酒精的棉签去除骨膜，并将颅骨表面干燥。
7. 将头固定柱安装到操纵臂上。使用操纵臂将头固定柱平整地放置在颅骨上靠近前囟的位置。
8. 在预先冷藏的小碟中，将牙科水泥的单体（4滴）、催化剂（1滴）和聚合物（1小勺）混合均匀。将少于1 g的牙科水泥涂抹于颅骨的额骨和顶骨区域，以固定头固定柱。
9. 待牙科水泥硬化后，将小鼠从立体定位仪中取出。在暴露的皮肤上涂抹抗生素软膏。注射美托咪啶拮抗剂（0.3 mg/kg）和抗生素（土霉素；20 mg/kg）。将小鼠置于笼内加热垫上直至苏醒，并持续监测，之后将其送回饲养笼。
10. 将动物单独饲养在配备一定丰富化装置的笼中。每日更换垫料以保持笼内清洁并预防感染。密切观察动物是否出现任何不适症状。若怀疑存在疼痛，可在伤口处使用利多卡因。 在头固定柱安装和开颅手术后，每24小时给予美洛昔康或卡洛芬一次，持续48小时。若非甾体抗炎药效果不足，可额外给予局部利多卡因。

3. 适应性培养

1. 在麻醉恢复后至少两天，使动物适应在记录室内的头部固定状态。适应性训练应持续至少5天。
2. 在适应性训练期间，将动物置于记录室内，并通过定制夹具固定其头部连接柱。训练过程中，为限制动物活动，使用3D打印机制作的定制树脂半管覆盖其身体（图1C）。
   注意：第1天的适应性训练应持续5分钟，随后每天依次增加至第2、3、4、5天分别为10、20、40和60分钟。
3. 每次训练结束后，给予动物食物奖励。若动物在适应过程中持续挣扎，应立即终止训练。

4. 开颅术

注意：在适应期结束后，在用于记录的脑区上方进行开颅手术。开颅手术在立体定位仪框架中进行，并在麻醉条件下完成，与安装头固定装置时的操作相同。术后操作步骤与头固定装置安装时相同。 

1. 开颅手术前，使用含有氯己定葡萄糖酸盐和70%酒精的棉签清洁颅骨。
2. 使用牙科钻小心刮除记录位点上方的颅骨。当骨层变得足够薄时，用手术刀尖将其切开并移除。
3. 在暴露区域周围涂抹牙科水泥，以增强颅骨强度。
4. 待牙科水泥硬化后，用硅胶粘合剂覆盖暴露的脑区。术后操作步骤如2.8步所述。

5. 电生理记录

1. 颅骨开窗术后，让动物至少恢复1天，然后再进行电生理记录。记录开始时，将动物以适应性训练期间相同的方式放入记录舱内。
2. 使用电极拉制仪将硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 = 1.5 mm，内径 = 0.9 mm，长 90.0 mm）拉制成玻璃移液管。移液管尖端直径为 2–3 µm，当其充满 10 mM PBS 时，电阻为 4–6 MΩ。电极长度为 40–50 mm。在某些记录中，向 10 mM PBS 中添加 2% 神经生物素。
3. 将装满液体的玻璃移液管连接到定制的光导探针架上。
4. 将镀有氯化银的银丝（直径0.2 mm）插入玻璃微量移液管中，并将银丝连接至一根针脚 通过 一根带涂层的细电线。将该导线连接至记录放大器的前置放大头级。
5. 将光纤跳线（纤芯 = 960 µm，包层 = 1,000 µm，数值孔径 = 0.63）一端带有氧化锆插芯（外径 = 2.5 mm）插入光探针支架的分体式对接套筒中。推动跳线使其插芯端面与玻璃移液管后端接触。该跳线用于将LED光源（波长 = 465 nm）发出的光传输至探针，LED光源由单通道LED驱动器控制。
6. 移除颅骨开窗处的硅胶粘合剂。记录过程中定期将预热的生理盐水（38 °C）滴加到脑表面，以防止脑组织干燥。必要时，使用尖头镊子去除硬脑膜。
7. 使用操纵器将玻璃电极插入脑组织。插入过程中监测电极电阻，当电阻低于预期值时更换电极，因为电极尖端可能已受损。在目标深度处，以2至5 µm的步进微调深度，搜索并分离单个神经元的动作电位。
8. 单个细胞分离后，给予LED光照并观察其对光刺激的反应。
9. 在确定细胞类型后记录神经活动，持续记录 2–3 小时。若需连续多日记录（最多 2 天），每日记录结束后用硅胶粘合剂覆盖颅骨开窗部位。记录结束后，处死动物，取下头固定装置，用丙酮清洗后保存以供重复使用。

结果

在图2中，我们考察了玻璃移液管尖端尺寸和长度对移液管尖端光功率的影响（图2A-B）。光功率通过置于尖端1 mm处的光功率计进行测量。当尖端尺寸变化时，移液管总长度设定为50 ± 2 mm；当总长度变化时，尖端尺寸设定为2.5 µm。玻璃移液管的管柄长度设定为8 mm。尖端光功率范围为3–5 mW（均值 ± 标准差；图2A：3.77 ± 0.29 mW，n = 20；图2B：4.24 ± 0.31 mW，n = 21）。移液管的尖端尺寸（图2A）与光功率几乎无相关性（R = 0.1555）。移液管长度与光功率仅呈轻微的负相关（R = -0.2054）。这些结果表明，移液管的尖端尺寸和长度对尖端光功率的影响极小。...

讨论

光遗传学已成为神经科学领域的一项强大工具，被用于鉴定特定类型的神经元 体内 以及调控特定神经元通路的活动。阐明不同类型神经元的神经活动有助于理解神经环路的机制。在此，我们展示了一种方法，通过玻璃电极将光传递至清醒状态下的VGAT-ChR2小鼠中脑下丘（IC）记录位点。

该方法中包含若干关键步骤。首先，必须使用在目标神经元中视蛋白表达充足且特异的动物。为了通过细胞外记录识别光反应，视蛋白的激活必须能够诱发目标神经元产生动作电位。在某些转基因品系中，幼年动物神经元中的转基因表达水平可能较低¹⁴，且该实验可能存在最低年龄限制。此外，可能需要进行一些额外实验，以确认对光刺激的反应是否特异性地针对目标神经元类型例如免疫组织化学）。当目标神经元为兴奋性神经元时，有必要区分直接诱发的反应与突触传递诱发的反应，可通过设定反应潜伏期的阈值来实现。其次，必须确保脑组织尽可能洁净。保持清洁尤为关键，以防止开颅和记录过程中发生出血。此外，开颅后应使用硅胶粘合剂严密覆盖脑表面，防止脑组织干燥。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
电极夹持器	Molecular Device	1-HL-U	用于微电极放大器的移液管夹持器
陶瓷分体对接套管	Thorlabs	ADAF1	直径2.5 mm套管
电路板间隔柱	Teishin Denki	SPA-320	直径8.0 mm，长20.0 mm
小鼠立体定位仪	Narishige	SR-6M-HT	小鼠用立体定位仪器
操作器	Narishige	NA	手动操作器
Superbond	Sun Medical	M: 204610557	牙科粘接树脂水泥
Form2	Formlabs	NA	3D打印机
Kwik-Sil	WPI	KWIK-SIL	低毒性硅胶粘合剂
硼硅酸盐玻璃毛细管	Narishige	GD-1.5	外径1.5 mm，内径0.9 mm，长90.0 mm
光纤连接线	Doric Lenses	MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5	单芯光纤连接线，外径2.5 mm，纤芯960 µm，包层1000 µm，数值孔径0.63
带连接器LED	Doric Lenses	LEDC-1B_FC	中心波长=465 nm，输出功率=45 mW（纤芯960 µm，数值孔径0.63）
LED驱动器	Doric Lenses	LEDRV_1CH_1000	单通道LED驱动器，最大输出=1000 mA
电极拉制仪	Narishige	PB-7	双阶段玻璃微电极拉制仪
硼硅酸盐玻璃毛细管	Narishige	GD-1.5	硼硅酸盐玻璃毛细管，外径1.5 mm，内径0.9 mm，长90.0 mm
GENTACIN	MSD CO., Ltd	185711173	抗生素软膏
Terramycin®-LA	Zoetis	G 333	土霉素
Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J	Jackson Labs	#14548	VGAT-ChR2小鼠
Multiclamp 700B	Molecular Devices	2500-0157	微电极放大器