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方法文章

原代人细胞中细胞衰老的诱导与验证

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DOI：

10.3791/57782

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2018年6月20日

 ,  , 
1European Research Institute for the Biology of Aging, University of Groningen, University Medical Center Groningen

本文内容

摘要

本文讨论了一系列在培养细胞中诱导和验证细胞衰老的实验方案。我们重点关注不同的衰老诱导刺激，并描述了常见的衰老相关标志物的定量方法。我们以成纤维细胞为模型提供了技术细节，但这些方案可适用于多种细胞模型。

摘要

细胞衰老是一种在应对不同损伤刺激时被激活的永久性细胞周期阻滞状态。细胞衰老的激活是多种病理生理过程的标志性特征，包括肿瘤抑制、组织重塑和衰老。细胞衰老的诱导因素 体内 特征仍不明确。然而，可利用多种刺激来诱导细胞衰老 离体其中最常见的诱导衰老的因素包括复制性耗竭、电离与非电离辐射、基因毒性药物、氧化应激以及去甲基化和乙酰化试剂。本文将详细介绍如何利用这些刺激因素诱导成纤维细胞进入衰老状态。该方案可轻松适用于多种类型的原代细胞和细胞系，包括癌细胞。我们还描述了用于验证细胞衰老的不同方法，重点关注溶酶体酶衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性的检测、通过5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）掺入法测定DNA合成速率、细胞周期抑制因子p16和p21的表达水平，以及衰老相关分泌表型（SASP）相关分子的表达与分泌情况。最后，我们提供了示例结果，并讨论了这些方案的进一步应用。

引言

1961年，Hayflick和Moorhead报道，培养中的原代成纤维细胞在连续传代后会失去增殖潜能1。该过程是由于每次细胞分裂后端粒逐步缩短所致。当端粒缩短至临界长度时，DNA损伤应答（DDR）系统会识别这一状态，并触发不可逆的增殖停滞——即复制性衰老。目前，复制性衰老是已知可诱导细胞进入永久性细胞周期停滞状态的多种刺激因素之一，使细胞对有丝分裂原和凋亡信号均不敏感2,3。衰老细胞程序通常还表现出其他特征，包括溶酶体活性升高、线粒体功能障碍、核形态改变、染色质重排、内质网应激、DNA损伤以及衰老相关分泌表型（SASP）3,4。衰老细胞在体内具有多种功能，如参与发育过程、伤口愈合及肿瘤抑制2。同时，它们也被证实与衰老过程以及肿瘤进展（具有一定的矛盾性）密切相关5。衰老所引起的负面效应及部分矛盾性作用，通常归因于SASP6。

最近研究表明，从小鼠体内清除衰老细胞可延长其寿命，并消除多种衰老特征7,8,9,10,11,12。基于相同原理，目前已开发出多种药物，旨在清除衰老细胞（即衰老细胞裂解剂，senolytics）或靶向作用于SASP13,14。抗衰老治疗潜力最近引起了该领域越来越多的关注。

细胞衰老相关机制的研究以及针对衰老细胞的药物干预筛选在很大程度上依赖于ex vivo模型，尤其是人原代成纤维细胞。尽管多种衰老诱导因素会激活一些共同的特征，但衰老表型仍表现出高度异质性，其差异取决于细胞类型、刺激因素和时间点等多种因素3,15,16,17。因此，在研究和靶向衰老细胞时，必须充分考虑这种异质性。本实验方案旨在提供一系列通过不同处理方式诱导原代成纤维细胞发生衰老的方法。如后文所述，这些方法可轻松适用于其他细胞类型。

除了复制性衰老外，我们还描述了另外五种诱导衰老的处理方法：电离辐射、紫外线（UV）辐射、阿霉素（doxorubicin）、氧化应激以及表观遗传学改变（即促进组蛋白乙酰化或DNA去甲基化）。电离辐射和紫外线辐射均可直接造成DNA损伤，并在适当剂量下触发细胞衰老18,19。阿霉素主要通过插入DNA双链之间造成DNA损伤，干扰拓扑异构酶II的功能，从而阻断DNA修复机制，诱导细胞衰老20。通常情况下，组蛋白乙酰化和DNA甲基化调控着对衰老至关重要的基因表达。因此，组蛋白去乙酰化酶抑制剂（例如，丁酸钠和SAHA）以及DNA去甲基化试剂（例如，5-aza）可在原本正常的细胞中诱导衰老21,22。

最后，将介绍与衰老细胞相关的四种最常见标志物：衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）的活性、通过EdU掺入法检测的DNA合成速率、细胞周期调控因子及周期蛋白依赖性激酶抑制剂p16和p21的过表达，以及SASP成分的过表达与分泌。

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方案

1. 一般准备

  1. 配制 D10 培养基。在 DMEM 培养基-Glutamax 中添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素（终浓度：100 U/mL）。
  2. 配制无菌 PBS。按照生产商说明将试剂片溶解于水中，并通过高压灭菌进行灭菌。
  3. 配制 1x 胰蛋白酶溶液。将 5 mL Trypsin-Versene EDTA/10x 用 45 mL 无菌 PBS 按 1:10 比例稀释。
    注意：在整个实验方案中，我们采用更接近原代成纤维细胞生理条件的细胞培养条件。这意味着我们通常在 37 °C 和 5% CO2 条件下培养细胞，但使用5% O2 而非“标准”的 20% O2。
  4. 所有样品操作均须在无菌条件下进行，使用超净工作台、实验服和手套。样品处理过程中，细胞仅可在 20% O2（室温条件）下短暂暴露。

2. 诱导衰老

  1. 复制性衰老
    1. 在处理细胞或任何将与细胞接触的材料（移液管、培养瓶、培养基等）时 等等。) 在无菌条件下操作，使用超净工作台、实验服和手套。将细胞维持在20% O₂环境中2 （室温条件下）仅在操作时暴露。
    2. 接种 7 × 105 低传代次数（PD）下可存活的原代成纤维细胞，置于T75培养瓶中（约9.3 x 10⁵）3 细胞/厘米²2) 加入10 mL D10。
    3. 在37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中培养细胞2 和5% O₂2 直到细胞达到70–80%汇合度（低传代次数的增殖培养物通常需要3–4天）。
    4. 使用 3 mL 1x 胰蛋白酶，在 37 °C、5% CO₂ 的细胞培养孵育箱中孵育约 5–7 分钟，使细胞脱落2 和5% O₂2定期使用细胞培养显微镜观察细胞，以监测消化脱落过程。
    5. 当细胞呈圆形时，加入9 mL D10终止胰蛋白酶反应。孵育时间不得超过10分钟。
    6. 以 300 x g 离心细胞 g 5分钟。细胞将在离心管底部形成沉淀，而碎片和较小颗粒将保留在上清液中。
    7. 移去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL D10 培养基中，按照制造商说明书使用自动细胞计数器或使用人工计数的纽鲍尔计数板进行细胞计数。计数时，应同时进行细胞活力检测（例如台盼蓝排斥法23).
    8. 使用以下公式计算累积群体倍增数（PD）：
      帕金森病新 = 3.32×(LOG(细胞总数) - LOG(接种细胞数) + PDold
      细胞总数 = 所有计数的细胞：死亡和存活的细胞
      接种细胞数 = 接种的活细胞数（8×105 细胞）
      PD老的 接种时的群体倍增数
      PD新 计数时（孵育后）的群体倍增数。
      注意：如果 7 x 105 原代成纤维细胞（PD 35.2）接种于T-75培养瓶中，培养4天后达到80%融合度，再次进行传代，此时细胞数量为1.3 × 106 总细胞数（死细胞+活细胞）。
      PD新 = 3.32×(LOG(1,300,000 个细胞)−LOG(700,000))+35.2
      PD新 = 36.1
    9. 重铺 8 x 105 在新的T75培养瓶中接种细胞，重复步骤2.1.2–2.1.8。
      注意：经过连续多次传代后，细胞需要更长时间才能达到汇合状态，直至完全停止分裂。一旦细胞停止分裂，应检测衰老标志物和/或用于后续实验应用。
    10. 需注意衰老细胞体积较大，可能导致培养物看似长满但实际上细胞数量较少。因此，当传代次数（PD）稳定且培养物中出现其他衰老标志物时（参见方案3.1–3.5），可推断细胞已进入衰老状态。
      注意：使用增殖的原代成纤维细胞作为对照。
  2. 电离辐射诱导的衰老
    1. 在处理细胞或任何将与细胞接触的材料（移液管、培养瓶、培养基等）时 等等。），在超净工作台内穿戴实验服和手套，于无菌条件下操作。将细胞置于20% O₂环境中培养2 （室温条件下）仅在操作时暴露。
    2. 接种 7 × 105 低传代数的 T75 培养瓶中存活的原代成纤维细胞（约 9.3 x 103 细胞/厘米²2) 加入10 mL D10。
    3. 在37 °C、5% CO₂的细胞培养孵育箱中过夜孵育细胞2 和 5% O₂2.
    4. 将细胞暴露于 10 灰度 根据所使用设备的说明书进行γ射线照射。
    5. 吸出细胞培养基，更换为 10 mL D10 培养基。
    6. 在37 °C、5% CO₂的细胞培养孵箱中，将细胞置于10 mL D10培养基中孵育2 和5% O₂2 再培养10天，每隔约3天定期更换培养基。
    7. 10天后，检测衰老标志物和/或用于后续实验应用。
      注意：使用相同群体倍增次数（PD）的增殖性原代成纤维细胞（照射前）作为对照。
  3. 紫外线（UV）辐射诱导的衰老
    1. 在处理细胞或任何将与细胞接触的材料（移液管、培养瓶、培养基等）时 等等。），在超净工作台中无菌操作，穿戴实验服并佩戴手套。将细胞置于20% O₂条件下培养2 （室温条件下）仅在操作时暴露。
    2. 种子 1.5–2 × 105 低传代数的6孔板中每孔可存活的原代成纤维细胞（1.5–2.0 × 10⁵）4 细胞/厘米²2），加入 2 mL D10 培养基。
    3. 将细胞置于37 °C、5% CO₂的细胞培养孵育箱中2 和5% O₂2 并使其在塑料表面贴壁至少5小时。
    4. 从细胞中移除培养基。将6孔板置于紫外辐射室中央，取下塑料盖。用UVB照射，剂量为20–30 mJ/cm²。2.
    5. 每孔加入 2 mL 培养基。
    6. 在37 °C、5% CO₂的细胞培养孵箱中，用2 mL D10培养基孵育细胞2 和5% O₂2 再培养7天，每隔约3天定期更换培养基。
      注意：7天后，可检测细胞的衰老标志物，并用于后续实验应用。以相同群体倍增次数（PD）的增殖期原代成纤维细胞（照射前）作为对照。
  4. 阿霉素诱导的衰老
    1. 制备1,000倍浓度阿霉素储备液：用1×PBS配制250 µM的阿霉素储备液，经滤膜除菌后，每管500 µL分装至无菌离心管中。将阿霉素储备液于-80 °C保存。
    2. 在处理细胞或任何将与细胞接触的材料（移液管、培养瓶、培养基等）时 等。），在无菌条件下操作，使用超净工作台、实验服和手套。将细胞维持在20% O₂环境中2 （室温条件下）仅在操作时暴露。
    3. 种子 7 × 105 低传代数的 T75 培养瓶中的可存活原代成纤维细胞（约 9.3 x 103 细胞/厘米²2) 加入10 mL D10。
    4. 在37 °C、5% CO₂的细胞培养孵箱中孵育细胞过夜2 和5% O₂2.
    5. 将11 µL的1,000倍阿霉素储备液加入11 mL D10培养基中稀释，终浓度为 250 nM.
    6. 吸弃细胞培养基，更换为 10 mL 含阿霉素的 D10 培养基。
    7. 在37 °C、5% CO₂的细胞培养孵箱中孵育细胞，精确孵育24 h。2 和5% O₂2.
    8. 吸弃细胞培养基，并用 10 mL D10 轻轻洗涤细胞一次。
    9. 将细胞在10 mL D10培养基中继续培养6天，每隔约3天定期更换培养基。
    10. 第7天，检测衰老标志物和/或用于后续实验应用。
      注意：作为对照，使用处于相同传代次数（PD）的增殖期原代成纤维细胞，以1:1,000比例加入溶剂（PBS）处理24小时。
  5. 氧化应激诱导的衰老
    1. 在处理细胞或任何将与细胞接触的材料（移液管、培养瓶、培养基等）时 等等。) 在无菌条件下操作，使用超净工作台、实验服和手套。将细胞维持在20% O₂环境中2 （室温条件下）仅在操作时暴露。
    2. 接种 7 × 105 低传代数的 T75 培养瓶中的可存活原代成纤维细胞（约 9.3 x 103 细胞/厘米²2) 加入10 mL D10。
    3. 在37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中孵育细胞过夜2 和5% O₂2.
    4. 在11 mL D10培养基中加入22.6 μL 30%过氧化氢，配制浓度约为200 μM的过氧化氢溶液。
      注意：通过绘制剂量-反应曲线评估毒性，以优化目标细胞类型的处理条件。
    5. 吸弃细胞培养基，加入 10 mL 新鲜配制的含过氧化氢的 D10 培养基。于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 2 小时。2 和5% O₂2.
    6. 吸弃细胞培养基，用新鲜的D10洗涤一次 无 过氧化氢
    7. 加入10 mL D10 无 过氧化氢
    8. 在37 °C、5% CO₂的细胞培养孵箱中孵育48 h2 和5% O₂2.
    9. 重复步骤 2.5.4–2.5.8 两次，共进行三次处理。
    10. 检测衰老标志物或收获样本用于后续应用。
      注意：作为对照，使用相同传代代数（PD）的增殖细胞，加入22.6 µL无菌水于D10培养基中处理2小时。
  6. 表观遗传诱导的衰老
    1. 根据所用小分子的需要配制储备液和工作液 表1过滤除菌溶液，分装至无菌管中，于 -20 °C 保存。
    2. 在处理细胞或任何将与细胞接触的材料（移液管、培养瓶、培养基等）时 等等。) 在无菌条件下操作，例如使用层流罩、实验服和手套。将细胞保持在20% O₂环境中2 （室温条件下）仅在操作时暴露。
    3. 种子 7 x 105 低传代数的T75培养瓶中的可存活原代成纤维细胞（约9.3 × 103 细胞/厘米²2) 加入10 mL D10。
    4. 在37 °C、5% CO₂的细胞培养孵育箱中过夜孵育细胞2 和5% O₂2.
    5. 准备11 mL含工作液的D10培养基用于所需处理。各处理组的具体稀释比例见下文 表1.
      1. 在11 mL D10培养基中配制11 µL的1 mM SAHA工作液。
      2. 在11 mL D10培养基中配制44 µL 1 M丁酸钠工作液。
      3. 在11 mL D10培养基中配制11 µL的10 mM 5-aza工作液。
        注意：通过例如绘制剂量-反应曲线来评估毒性，从而针对目标细胞类型优化处理条件。
    6. 向培养物中加入含所需处理工作液的D10培养基。
    7. 在37 °C、5% CO₂的细胞培养孵箱中孵育24 h2 和5% O₂2.
    8. 重复步骤 2.6.4–2.6.6 两次，共进行三次处理。
    9. 更换为不含药物的简单D10培养基。
    10. 3天后，细胞进入衰老状态，可用于衰老标志物检测及后续应用。
      注意：作为对照，使用相同传代次数（PD）的增殖期原代成纤维细胞，用D10培养基加相应溶剂处理三天，每24小时更换一次D10培养基加溶剂。溶剂种类取决于所用处理试剂：SAHA和5-aza使用1:1,000的DMSO，丁酸钠使用1:250的无菌水。

3. 衰老的标志物

  1. 准备
    1. 制备20 mg/mL X-gal：将20 mg X-gal溶解于1 mL二甲基甲酰胺或DMSO中，避光保存于-20 °C。
    2. 配制0.1 M柠檬酸溶液：将2.1 g一水柠檬酸溶于100 mL水中。室温保存。
    3. 配制0.2 M磷酸钠溶液：将2.84 g磷酸氢二钠或3.56 g磷酸氢二钠二水合物溶于100 mL水中。室温保存。
    4. 配制0.2 M 柠檬酸/磷酸钠 pH 6.0：溶解36.85 mL 0.1 M 柠檬酸溶液和63.15 mL 0.2 M 磷酸钠溶液。 精确调节至 pH 6.0室温保存。
    5. 配制100 mM 亚铁氰化钾溶液：将2.1 g 亚铁氰化钾溶于50 mL 水中。避光，4 °C 保存。
    6. 配制100 mM 铁氰化钾溶液：将1.7 g 铁氰化钾溶解于50 mL 水中。4 °C 避光保存。
    7. 配制5 M氯化钠：将14.6 g氯化钠溶解于50 mL水中。室温保存。
    8. 配制1 M氯化镁：将4.8 g氯化镁溶解于50 mL水中。室温保存。
    9. 在 PBS 中配制含 2% 甲醛和 0.2% 戊二醛的固定液：将 800 µL 的 25% 戊二醛和 12.5 µL 的 16% 甲醛加入 100 μL PBS 中并混匀。避光、室温保存。
    10. 配制染色液 新鲜 根据 表2.
  2. 衰老相关β-半乳糖苷酶染色
    1. 每个样本接种 1 x 104 24孔板中至少一个孔的细胞（5.2 × 103 细胞/厘米²2) 加入500 µL D10培养基，使细胞分布稀疏。可直接在此孔板中进行处理（如适用），或 alternatively 将已处理的细胞重新接种至24孔板中。
    2. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下将细胞孵育过夜2 和5% O₂2.
    3. 用500 μL PBS洗涤细胞两次。
    4. 在室温下使用每孔500 μL含2%甲醛和0.2%戊二醛的PBS溶液固定3–5分钟。
    5. 用500 μL PBS洗涤细胞两次。
    6. 准备 新鲜 染色液，根据待染色样本的数量而定。
    7. 加入染色液（500 µL/孔），并用封口膜密封培养板以防止蒸发。
      注意：蒸发可能导致晶体析出，从而妨碍显微镜下的观察。
    8. 在避光条件下孵育细胞（例如 用铝箔包裹后，置于37 °C干燥培养箱（不含CO₂）中孵育2）12–16 小时。
      注意：CO2 可能影响pH值，从而改变实验结果。某些细胞类型可能需要更短的孵育时间。
    9. 用500 μL PBS洗涤两次。
    10. 评估结果。阳性细胞在普通光学显微镜下呈现蓝色（主要为）核周染色。图1A).
    11. 为进行定量分析，每个样本至少观察100个细胞，并统计阳性细胞的数量。由于衰老细胞形态发生改变，常难以界定细胞边界并进行准确计数。使用DAPI复染，以利于单个细胞的观察与定量。图1B）。使用荧光显微镜对样本进行定量分析（阳性细胞百分比相对于细胞总数）图1C拍摄同一样本的多张图像，以便最终能够计数至少100个单细胞，并评估其中SA-β-gal阳性细胞的百分比。
    12. 比较所用处理条件下衰老细胞与其相应对照组的结果。
      注意：可在同一样本上进行EdU共染色。此时应将细胞接种于盖玻片上。
  3. EdU 掺入实验
    1. 根据待检测样本的数量，将盖玻片/孔板放入24孔板中。
    2. 接种 1 × 104 24孔板中至少一个孔的细胞（5.2 × 10）3 细胞/厘米²2每个条件下加入500 µL D10培养基，使细胞分布稀疏。可直接在此板中进行处理（如适用），或 alternatively 将已处理的细胞重新接种至24孔板中。
    3. 在37 °C、5% CO₂条件下将细胞孵育过夜2 和5% O₂2.
    4. 根据待处理样本数量（每份样本250 μL），用D10配制20 µM的EdU溶液（1:250）。
    5. 从每个孔中移除一半培养基（250 μL），加入新配制的 D10 + EdU 溶液进行处理。EdU 最终浓度为 10 µM。
    6. 在37 °C、5% CO₂的细胞培养孵箱中孵育18–24 h2 以及5% O2。对照细胞和衰老细胞的孵育时间应保持相同。
    7. 用500 μL PBS洗涤2次。
    8. 用500 μL含4%多聚甲醛的PBS溶液固定细胞10分钟。
    9. 在500 μL 100 mM Tris（pH 7.6）中孵育5分钟。
    10. 在500 μL含0.1% Triton X-100的PBS中孵育细胞10分钟以进行透化处理。
    11. 用 PBS 洗涤 3 次。
    12. 为每张盖玻片准备 50 μL 标记混合液，按以下顺序加入组分：44.45 µL PBS、0.5 µL Cu(II)SO₄40.05 µL 磺基-Cy3-叠氮化物，5 µL 抗坏血酸钠。
    13. 将50 μL标记混合液滴加到一片Parafilm上。用镊子和针辅助抬起盖玻片，使其细胞面朝下覆盖在标记混合液上。确保无气泡产生，且盖玻片整个表面均与标记混合液接触。避光孵育30 min。
    14. 将细胞放回24孔板的孔中，并用PBS洗涤三次。
    15. 用封片剂（含DAPI以显示细胞核）将样本封固在玻片上，并在室温下避光干燥过夜。
    16. 使用荧光显微镜观察EdU掺入情况。选择适用于Cy3的滤光片（激发/发射波长：552/570 nm）。
    17. 针对每种条件（Cy3 和 DAPI），拍摄多张细胞图像，用于后续对至少 100 个细胞进行定量分析。
    18. 使用以下公式计算掺入EdU的细胞百分比：
      EdU 阳性细胞百分比 (%) = (EdU 阳性细胞数 (Cy3)/总细胞数 (DAPI)) × 100
    19. 比较所用处理条件下衰老细胞与其相应对照组的结果。
      注意：可在同一样本上进行 SA-β-gal 的共染色。请注意，细胞仍应接种在盖玻片上。
  4. p16、p21 和 SASP 的基因表达
    1. 制备目的基因的引物对（每种引物50 µM）。
      注意：p16、p21 及部分相关 SASP 因子的 qPCR 检测可反映细胞衰老状态。本方案采用通用探针库（Universal Probe Library, UPL）系统，通过实时 PCR 进行相对定量。 表3 展示了用于检测CDK抑制因子p16和p21、最主要SASP成员，以及作为实验参照基因的微管蛋白（Tubulin）和肌动蛋白（Actin）的引物概览。表格最后一列为 表3 列出每项检测所使用的特定UPL探针。
    2. 分别制备qPCR 所需检测的反应体系。务必同时包括参考基因 表 4.
    3. 所有样品均需设置重复2次或3次。
    4. 在384孔板中每孔加入7.5 µL qPCR反应混合液。
    5. 加入溶解于2.5 µL无RNase水中的约5 ng cDNA。
      注意：比较的所有样品中，cDNA 的量应尽可能相近。可通过在逆转录反应中使用等量的 RNA 来实现这一目的。
    6. 用封板膜覆盖板子，并确保其均匀地粘附在板子上，完全覆盖所有孔。
    7. 以 2,000 x 转速离心平板 g 1 分钟。
    8. 使用以下程序在Lightcycler中运行40个循环：
      95 °C 反应 7 分钟
      40个循环：95 °C 5秒，60 °C 30秒
      37 °C 下 1 分钟
    9. 对于结果分析，采用Livak及其同事提出的方法来分析qPCR数据24使用 Tubulin 或 Actin 作为参考基因计算 ΔCt 值，并使用适当的对照计算特定衰老诱导处理的 ΔΔCt 值。
  5. IL6蛋白的表达与分泌
    1. 接种 5–10 × 104 6孔板中至少一个孔的细胞（5.2–10.5 x 103 细胞/厘米²2每个条件下加入2 mL D10培养基。处理（如适用）可直接在此板上进行，或者将已处理的细胞重新接种至24孔板中。接种后静置过夜。
    2. 吸除培养基，加入 2 mL DMEM 培养基 不含FBS在正常条件下孵育24小时。
    3. 将培养基收集至15 mL离心管中。
    4. 将样品在300 × g离心5分钟。培养基可于-80 °C保存至后续处理。
    5. 按照制造商的说明进行ELISA实验。
    6. 比较衰老细胞与针对特定衰老诱导处理的相应对照组的结果

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结果

衰老成纤维细胞中SA-β-gal染色的富集

Β-半乳糖苷酶（β-半乳糖苷酶) 是一种溶酶体酶，在所有细胞中均有表达，其最适pH值为4.025,26然而，在细胞衰老过程中，溶酶体体积增大，因此衰老细胞会积聚 β-半乳糖苷酶。该酶含量的增加使其在非最适pH 6.0条件下仍可检测到其活性。25,27. 图1A 显示SA-的代表性图像β增殖性与衰老性原代成纤维细胞中的-gal染色。细胞也呈现体积增大及不规则的细胞形态。如前所述，单独观察时难以区分单个细胞，因此使用DAPI共染色有助于细胞的可视化观察与计数

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讨论

本文所述方案已针对人原代成纤维细胞（尤其是BJ和WI-38细胞）进行了优化。在本实验室中，复制性衰老、电离辐射和阿霉素处理的方案已成功应用于其他类型的成纤维细胞（HCA2和IMR90）以及其他细胞类型（即新生儿黑素细胞和角质形成细胞，或诱导多能干细胞分化的心肌细胞）。然而，针对其他细胞类型的方案可通过调整某些细节进行优化，例如接种细胞数量、帮助细胞贴壁/脱离塑料培养基质的方法和化学试剂，以及处理剂量以避免毒性。

即使是使用原代成纤维细胞也存在诸多挑战。衰老细胞通常比增殖细胞更难解离，且对胰酶消化或其他任何解离方法往往更为敏感，这意味着解离后的细胞活力略低于增殖细胞。针对不同诱导衰老方法选择合适的对照组十分困难。例如，对于以药物处理诱导衰老的方法（如阿霉素处理），我们建议对照组采用溶剂短时间处理：即在对照样本中使用磷酸盐缓冲液（PBS）处理24小时，随后立即进行收获或后续处理。有人可能会认为，诱导进入衰老状态的细胞在处理后经历了更长的培养时间（如阿霉素处理细胞额外培养6天），因此对照组细胞在去除PBS后也应培养相同的时间。然而，如此长时间的培养将导致细胞进一步分裂，可能达到过度融合状...

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致谢

我们感谢Demaria实验室成员富有成效的讨论，以及Thijmen van Vliet分享关于紫外线诱导衰老的数据和实验方案。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM培养基 - GlutaMAXGibco31966-047
胎牛血清HycloneSV30160.03
青霉素-链霉素溶液（P/S；10,000 U/ml）LonzaDE17-602E
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichSC-202581
无核酸酶水（非DEPC处理）AmbionAM9937
T75培养瓶Sarstedt833911002
胰蛋白酶/EDTA溶液LonzaCC-5012
PBS片剂Gibco18912-014
1.5 ml 微量离心管Sigma-AldrichT9661-1000EA
Corning 15 mL 离心管Sigma-AldrichCLS430791
6孔板Sarstedt83.3920
24孔板Sarstedt83.3922
13 mm 圆形盖玻片Sarstedt83.1840.002
Steriflip滤器Merck ChemicalsSCGP00525
铯-137源IBL 637 铯-137γ射线照射仪
紫外辐射室Opsytec, Dr. Göbel BS-02
盐酸多柔比星 BioAustralis Fine ChemicalsBIA-D1202-1
过氧化氢溶液Sigma-Aldrich7722-84-1
5-氮杂-2’-脱氧胞苷Sigma-AldrichA3656
SAHASigma-AldrichSML0061
丁酸钠 Sigma-AldrichB5887
X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷）Fisher Scientific7240-90-6
一水柠檬酸Sigma-Aldrich5949-29-1
磷酸氢二钠Acros organics7782-85-6
亚铁氰化钾 Fisher Scientific14459-95-1
铁氰化钾Fisher Scientific13746-66-2
氯化钠Merck Millipore7647-14-5
氯化镁Fisher Chemicals7791-18-6
25% 戊二醛Fisher Scientific111-30-8,7732-18-5
16% 甲醛（w/v）Thermo-Fisher Scientific28908
EdU（5-乙炔基-2’-脱氧尿苷）Lumiprobe10540
磺基-Cyanine3 叠氮化物（Sulfo-Cy3-Azide）LumiprobeD1330
抗坏血酸钠Sigma-AldrichA4034
五水硫酸铜（Cu(II)SO4·5H2O）Sigma-Aldrich209198
Triton X-100Acros organics215682500
TRIS碱Roche11814273001
LightCycler 480 384孔白色多孔板 Roche4729749001
Lightcycler 480 密封膜 Roche4729757001
Sensifast Probe Lo-ROX试剂盒 BiolineBIO-84020
UPL探针文库Sigma-AldrichVarious
人IL-6 DuoSet ELISA试剂盒R&DD6050
Bio-Rad TC20细胞计数仪Bio-Rad
细胞计数板Bio-Rad145-0017
干燥培养箱Thermo-Fisher ScientificHeratherm
二甲基甲酰胺Merck Millipore1.10983
Parafilm 'M' 实验室封口膜Bemis #PM992
镊子
针头

参考文献

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衰老诱导SA-β-gal染色EdU掺入实验p16 p21表达SASP分析原代成纤维细胞多柔比星处理群体倍增荧光显微镜
原代人细胞中细胞衰老的诱导与验证
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