原代人细胞中细胞衰老的诱导与验证

摘要

本文讨论了一系列在培养细胞中诱导和验证细胞衰老的实验方案。我们重点关注不同的衰老诱导刺激，并描述了常见的衰老相关标志物的定量方法。我们以成纤维细胞为模型提供了技术细节，但这些方案可适用于多种细胞模型。

摘要

细胞衰老是一种在应对不同损伤刺激时被激活的永久性细胞周期阻滞状态。细胞衰老的激活是多种病理生理过程的标志性特征，包括肿瘤抑制、组织重塑和衰老。细胞衰老的诱导因素 体内 特征仍不明确。然而，可利用多种刺激来诱导细胞衰老 离体其中最常见的诱导衰老的因素包括复制性耗竭、电离与非电离辐射、基因毒性药物、氧化应激以及去甲基化和乙酰化试剂。本文将详细介绍如何利用这些刺激因素诱导成纤维细胞进入衰老状态。该方案可轻松适用于多种类型的原代细胞和细胞系，包括癌细胞。我们还描述了用于验证细胞衰老的不同方法，重点关注溶酶体酶衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性的检测、通过5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）掺入法测定DNA合成速率、细胞周期抑制因子p16和p21的表达水平，以及衰老相关分泌表型（SASP）相关分子的表达与分泌情况。最后，我们提供了示例结果，并讨论了这些方案的进一步应用。

引言

1961年，Hayflick和Moorhead报道，培养中的原代成纤维细胞在连续传代后会失去增殖潜能¹。该过程是由于每次细胞分裂后端粒逐步缩短所致。当端粒缩短至临界长度时，DNA损伤应答（DDR）系统会识别这一状态，并触发不可逆的增殖停滞——即复制性衰老。目前，复制性衰老是已知可诱导细胞进入永久性细胞周期停滞状态的多种刺激因素之一，使细胞对有丝分裂原和凋亡信号均不敏感^2,3。衰老细胞程序通常还表现出其他特征，包括溶酶体活性升高、线粒体功能障碍、核形态改变、染色质重排、内质网应激、DNA损伤以及衰老相关分泌表型（SASP）^3,4。衰老细胞在体内具有多种功能，如参与发育过程、伤口愈合及肿瘤抑制²。同时，它们也被证实与衰老过程以及肿瘤进展（具有一定的矛盾性）密切相关⁵。衰老所引起的负面效应及部分矛盾性作用，通常归因于SASP⁶。

最近研究表明，从小鼠体内清除衰老细胞可延长其寿命，并消除多种衰老特征^7,

方案

1. 一般准备

1. 配制 D10 培养基。在 DMEM 培养基-Glutamax 中添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素（终浓度：100 U/mL）。
2. 配制无菌 PBS。按照生产商说明将试剂片溶解于水中，并通过高压灭菌进行灭菌。
3. 配制 1x 胰蛋白酶溶液。将 5 mL Trypsin-Versene EDTA/10x 用 45 mL 无菌 PBS 按 1:10 比例稀释。
   注意：在整个实验方案中，我们采用更接近原代成纤维细胞生理条件的细胞培养条件。这意味着我们通常在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养细胞，但使用5% O₂ 而非“标准”的 20% O₂。
4. 所有样品操作均须在无菌条件下进行，使用超净工作台、实验服和手套。样品处理过程中，细胞仅可在 20% O₂（室温条件）下短暂暴露。

2. 诱导衰老

1. 复制性衰老
   1. 在处理细胞或任何将与细胞接触的材料（移液管、培养瓶、培养基等）时 等等。) 在无菌条件下操作，使用超净工作台、实验服和手套。将细胞维持在20% O₂环境中₂ （室温条件下）仅在操作时暴露。
   ....

结果

衰老成纤维细胞中SA-β-gal染色的富集

Β-半乳糖苷酶（β-半乳糖苷酶) 是一种溶酶体酶，在所有细胞中均有表达，其最适pH值为4.0^25,26然而，在细胞衰老过程中，溶酶体体积增大，因此衰老细胞会积聚 β-半乳糖苷酶。该酶含量的增加使其在非最适pH 6.0条件下仍可检测到其活性。^25,27. 图1A 显示SA-的代表性图像β增殖性与衰老性原代成纤维细胞中的-gal染色。细胞也呈现体积增大及不规则的细胞形态。如前所述，单独观察时难以区分单个细胞，因此使用DAPI共染色有助于细胞的可视化观察与计数

讨论

本文所述方案已针对人原代成纤维细胞（尤其是BJ和WI-38细胞）进行了优化。在本实验室中，复制性衰老、电离辐射和阿霉素处理的方案已成功应用于其他类型的成纤维细胞（HCA2和IMR90）以及其他细胞类型（即新生儿黑素细胞和角质形成细胞，或诱导多能干细胞分化的心肌细胞）。然而，针对其他细胞类型的方案可通过调整某些细节进行优化，例如接种细胞数量、帮助细胞贴壁/脱离塑料培养基质的方法和化学试剂，以及处理剂量以避免毒性。

即使是使用原代成纤维细胞也存在诸多挑战。衰老细胞通常比增殖细胞更难解离，且对胰酶消化或其他任何解离方法往往更为敏感，这意味着解离后的细胞活力略低于增殖细胞。针对不同诱导衰老方法选择合适的对照组十分困难。例如，对于以药物处理诱导衰老的方法（如阿霉素处理），我们建议对照组采用溶剂短时间处理：即在对照样本中使用磷酸盐缓冲液（PBS）处理24小时，随后立即进行收获或后续处理。有人可能会认为，诱导进入衰老状态的细胞在处理后经历了更长的培养时间（如阿霉素处理细胞额外培养6天），因此对照组细胞在去除PBS后也应培养相同的时间。然而，如此长时间的培养将导致细胞进一步分裂，可能达到过度融合状.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM培养基 - GlutaMAX	Gibco	31966-047
胎牛血清	Hyclone	SV30160.03
青霉素-链霉素溶液（P/S；10,000 U/ml）	Lonza	DE17-602E
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	SC-202581
无核酸酶水（非DEPC处理）	Ambion	AM9937
T75培养瓶	Sarstedt	833911002
胰蛋白酶/EDTA溶液	Lonza	CC-5012
PBS片剂	Gibco	18912-014
1.5 ml 微量离心管	Sigma-Aldrich	T9661-1000EA
Corning 15 mL 离心管	Sigma-Aldrich	CLS430791
6孔板	Sarstedt	83.3920
24孔板	Sarstedt	83.3922
13 mm 圆形盖玻片	Sarstedt	83.1840.002
Steriflip滤器	Merck Chemicals	SCGP00525
铯-137源			IBL 637 铯-137γ射线照射仪
紫外辐射室			Opsytec, Dr. Göbel BS-02
盐酸多柔比星	BioAustralis Fine Chemicals	BIA-D1202-1
过氧化氢溶液	Sigma-Aldrich	7722-84-1
5-氮杂-2’-脱氧胞苷	Sigma-Aldrich	A3656
SAHA	Sigma-Aldrich	SML0061
丁酸钠	Sigma-Aldrich	B5887
X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷）	Fisher Scientific	7240-90-6
一水柠檬酸	Sigma-Aldrich	5949-29-1
磷酸氢二钠	Acros organics	7782-85-6
亚铁氰化钾	Fisher Scientific	14459-95-1
铁氰化钾	Fisher Scientific	13746-66-2
氯化钠	Merck Millipore	7647-14-5
氯化镁	Fisher Chemicals	7791-18-6
25% 戊二醛	Fisher Scientific	111-30-8,7732-18-5
16% 甲醛（w/v）	Thermo-Fisher Scientific	28908
EdU（5-乙炔基-2’-脱氧尿苷）	Lumiprobe	10540
磺基-Cyanine3 叠氮化物（Sulfo-Cy3-Azide）	Lumiprobe	D1330
抗坏血酸钠	Sigma-Aldrich	A4034
五水硫酸铜（Cu(II)SO4·5H2O）	Sigma-Aldrich	209198
Triton X-100	Acros organics	215682500
TRIS碱	Roche	11814273001
LightCycler 480 384孔白色多孔板	Roche	4729749001
Lightcycler 480 密封膜	Roche	4729757001
Sensifast Probe Lo-ROX试剂盒	Bioline	BIO-84020
UPL探针文库	Sigma-Aldrich	Various
人IL-6 DuoSet ELISA试剂盒	R&D	D6050
Bio-Rad TC20细胞计数仪	Bio-Rad
细胞计数板	Bio-Rad	145-0017
干燥培养箱	Thermo-Fisher Scientific	Heratherm
二甲基甲酰胺	Merck Millipore	1.10983
Parafilm 'M' 实验室封口膜	Bemis	#PM992
镊子
针头