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方法文章

油酸注射诱导猪急性呼吸窘迫综合征模型

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DOI：

10.3791/57783

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2018年10月26日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg-University

本文内容

摘要

本文介绍了一种通过中心静脉注射油酸在猪体内诱导急性肺损伤的实验方案。这是一种用于研究急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的成熟动物模型。

摘要

急性呼吸窘迫综合征是一种重要的重症监护疾病，其发病率占重症监护病房患者总数的2.2%至19%。尽管过去几十年中治疗手段不断进步，急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者的死亡率仍高达35%至40%。目前仍需进一步研究以改善ARDS患者的预后。其中一个难题在于，尚无单一动物模型能够完全模拟急性呼吸窘迫综合征复杂的病理机制，但已有多种模型可用于研究该综合征的不同方面。油酸注射（OAI）诱导的肺损伤是一种成熟的动物模型，常用于研究通气策略、肺力学以及通气/血流分布。OAI可导致气体交换严重受损、肺力学功能恶化以及肺泡-毛细血管屏障的破坏。该模型的缺点在于其机制相关性存在争议，且需要建立中心静脉通路，这在较小的动物模型中尤其具有挑战性。总之，OAI诱导的肺损伤在大小动物中均可产生可重复的结果，因此是研究ARDS的适宜模型。然而，仍需进一步研究以开发出能够全面模拟ARDS各个阶段、同时避免现有各种模型缺陷的理想模型。

引言

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种重症监护综合征，自约50年前首次被描述以来已得到广泛研究1。这些研究加深了人们对ARDS病理生理机制和致病因素的理解，从而改善了患者的诊疗与预后2,3。然而，ARDS患者的死亡率仍然很高，约为35-40%4,5,6。约10%的重症监护室（ICU）入院病例以及23%需要机械通气的ICU患者均由ARDS所致，这一事实凸显了该领域进一步研究的重要性。

动物模型在研究中被广泛用于探讨各种疾病的病理生理变化及潜在的治疗方法。由于急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的复杂性，目前尚无单一动物模型能够完全模拟该疾病，而是存在多种模型以分别反映其不同方面7。其中一种已建立良好的模型是油酸注射（OAI）诱导的肺损伤。该模型已在多种动物中使用，包括小鼠8、大鼠9、猪10、狗11和绵羊12。油酸是一种不饱和脂肪酸，也是健康人体内最常见的一种脂肪酸13，存在于人血浆、细胞膜和脂肪组织中13。生理状态下，油酸在血液中运输时与白蛋白结合13。血液中脂肪酸水平升高与多种病理状态相关，某些疾病的严重程度也与血清脂肪酸水平相关13。油酸诱导的ARDS模型最初旨在模拟创伤患者中由脂质栓塞引起的ARDS14。油酸可直接作用于肺部的天然免疫受体13，引发中性粒细胞积聚15、炎症介质产生16以及细胞死亡13。生理上，油酸可导致迅速进展的低氧血症、肺动脉压升高以及肺血管外水分积聚。此外，它还可引起动脉低血压和心肌抑制7。该模型的缺点包括需要中心静脉通路、机制相关性存疑，以及因快速出现的低氧血症和心脏抑制可能导致动物迅速死亡。与其它模型相比，该模型的优势在于适用于大小动物、能够有效重复ARDS中的病理生理机制、在注射油酸后ARDS急性发作，以及可在无全身性炎症（如许多其他脓毒症模型中常见的）的情况下研究孤立性ARDS7。在下文中，我们将详细描述猪体内油酸诱导肺损伤的操作方法，并提供代表性数据以表征肺功能损害的稳定性。目前已有多种OAI诱导肺损伤的实验方案，本文所提供的方案能够可靠地诱导急性肺损伤。

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方案

本文所述所有动物实验均已获得机构和州级动物护理委员会（德国莱茵兰-普法尔茨州科布伦茨地区检测局，批准号 G14-1-077）的批准，并依照欧洲和德国实验动物科学学会的指南进行。实验在2-3月龄、体重27-29 kg的雄性猪（sus scrofa domestica）麻醉状态下进行。

1. 麻醉、插管与机械通气

  1. 在麻醉前禁食 6 小时，以降低误吸风险，但允许自由饮水以减少动物应激。
  2. 进行镇静时，在动物处于动物箱内时，使用肌肉注射针头（20 G）向猪的颈部或臀肌注射氯胺酮（Ketamine，4 mg kg-1）与阿扎哌隆（Azaperone，8 mg kg-1）的混合制剂。
    注意：操作动物时应佩戴手套。
  3. 在耳缘静脉局部酒精消毒后，插入外周静脉导管（20 G）。
  4. 静脉注射芬太尼（fentanyl，4 µg kg-1）、丙泊酚（propofol，3 mg kg-1）和阿曲库铵（atracurium，0.5 mg kg-1）以诱导麻醉。
  5. 当猪停止自主呼吸后，将其置于担架上呈仰卧位，并用绷带固定以限制活动。
  6. 将传感器夹在动物的一只耳朵或尾部，开始监测外周血氧饱和度（SpO2）。
  7. 使用适用于犬类的 2 号通气面罩对猪进行通气，设定吸气峰压低于 20 cm H2O，呼气末正压（PEEP）为 5 cm H2O，呼吸频率为 14–16 次/分钟，吸入氧浓度（FiO2）为 1.0。
  8. 开始持续输注平衡电解质溶液（5 mL kg-1 h-1）、丙泊酚（8–12 mg kg-1 h-1）和芬太尼（0.1–0.2 mg kg-1 h-1），以维持麻醉状态。
  9. 进行气管插管前，准备一根适用于该动物的常规气管导管（例如，体重 25–30 kg 的猪，气管导管内径（ID）为 6–7 mm），并配备气管导管引导器，以及带有 Macintosh 4 号喉镜片的常规喉镜。
    注意：气管插管操作需两人配合完成。
  10. 操作者 1：用一只手拉出舌头，另一只手将吻部向上方按压。
  11. 操作者 2：插入喉镜，并像常规操作一样向前推进，直至视野中可见会厌。
  12. 将喉镜向腹侧牵拉，以暴露声门。
    注意：有时会厌会"黏附"于软腭。此时可用导管尖端将其松解。
  13. 将导管经声门插入，随后拔出导管引导器。
  14. 使用注射器向导管气囊注入 10 mL 空气以封闭气囊。
  15. 将导管连接至呼吸机。
  16. 通过二氧化碳波形图（capnography）检测规律的二氧化碳（CO2）呼出，以及听诊双肺通气是否对称，确认导管位置正确。
  17. 启动机械通气（潮气量 6–8 mL/kg，呼气末正压 5 cm H2O，调节吸入氧浓度（FiO2）使外周血氧饱和度（SpO2）维持在 94–98%17，调节呼吸频率使呼气末二氧化碳分压（etCO2）维持在 35–45 mmHg）。

2. 仪器设备

  1. 用绷带向后牵拉后肢，以拉伸股部区域的皮肤，便于导管插入所需血管。
  2. 准备一支5 mL注射器、一支10 mL注射器、一支Seldinger穿刺针、3个带导丝的导引鞘（5 Fr、6 Fr、8 Fr）、一根带3个端口的中心静脉导管（7 Fr，30 cm）及其配套导丝，以及一根肺动脉导管（7.5 Fr，110 cm）。
  3. 使用皮肤消毒剂，采用擦拭法充分消毒股部区域。
  4. 用生理盐水完全充满各导管。
  5. 将超声探头置于右侧腹股沟韧带上，扫描股血管。
  6. 将探头旋转90°，以长轴方向完整显示股动脉。
  7. 在超声同轴引导下，使用Seldinger穿刺针穿刺右侧股动脉。
    注：获取血管通路的方法有多种，可选择是否使用超声引导。本模型中，超声引导下的血管穿刺并非必需。
  8. 当有搏动性鲜红色血液流出时，插入导丝并撤出穿刺针。
  9. 观察股静脉并使用穿刺针在超声同轴引导下穿刺静脉，同时持续抽吸。
  10. 当可抽出静脉血时，断开注射器并插入导丝。
  11. 撤出穿刺针。
  12. 使用超声检查导丝的位置。
  13. 采用Seldinger技术插入动脉导引鞘（5 Fr）和中心静脉导管（有关Seldinger技术的详细信息，请参见已发表的方法18）。
  14. 在对侧重复动脉和静脉穿刺操作，并按上述方法使用Seldinger技术插入导引鞘（动脉6 Fr，静脉8 Fr）。
  15. 将动脉导引鞘和中心静脉导管连接至适配监护设备的压力传感器系统。
  16. 将三通旋塞打开至大气，对侵入式监测系统进行大气压校准（归零），并在监护仪上按下Zero all（全部归零）按钮。
  17. 将三通旋塞重新转回，以测量血流动力学参数。
  18. 开始监测血流动力学指标。
  19. 将所有压力传感器置于右心房水平高度。
  20. 将丙泊酚（8–12 mg kg-1 h-1）和芬太尼（0.1–0.2 mg kg-1 h-1）的输注切换至中心静脉通路的一个端口，以维持麻醉状态。

3. 氧分压（pO2）的超快速测量

注意：pO₂ 的测量2 使用超快pO探针2-测量并非强制性步骤，但有助于可视化pO2的实时变化。

  1. 打开软件 NeoFox viewer，然后点击 选项。
  2. 选择 校准 选项卡，然后点击 打开校准 按钮。
  3. 选择校准文件，然后点击 打开 和 下载。
  4. 在弹出窗口中点击 是 以确认。
  5. 打开 选项 对话框。
  6. 选择 校准 选项卡，然后点击 单点校准。
  7. 在 氧气 栏中输入 21%，并在 温度 栏中输入相应温度。
  8. 点击 使用当前 Tau 和 下载，然后在弹出窗口中点击 是 以确认。
  9. 将用于 pO2 超快速测量的探头经左侧动脉导入鞘插入。

4. 插入肺动脉导管

  1. 检查肺动脉导管的气囊是否有损坏。
  2. 将其连接至与监护设备匹配的换能器系统。
  3. 通过将三通旋塞打开至大气，对肺动脉压监测系统进行大气压校准（归零），并在监护仪上按下归零按钮。
  4. 将三通旋塞转回以测量肺动脉压。
  5. 开始监测肺动脉压。
  6. 将肺动脉导管经左侧静脉导入鞘（气囊已放气）插入。
  7. 当肺动脉导管通过导入鞘后，用 1 mL 空气充胀气囊。
  8. 推进肺动脉导管，并监测典型的波形（静脉、右心房、右心室、肺动脉及肺毛细血管楔压）。放空气囊，并检查是否可通过肺动脉导管的所有端口抽吸出血液。
    注：有关肺动脉导管插入的详细操作步骤，请参见先前发表的研究19。

5. 肺损伤的诱导

  1. 制备油酸溶液：0.1 mL/kg-1 将油酸装入20 mL注射器中，并连接至三通阀。
  2. 另取一支20 mL注射器，加入2 mL血液，并向两支注射器中加入生理盐水，使总体积均为20 mL。
  3. 将第二个注射器也连接到三通旋塞阀上。
    注意：使用油酸时需佩戴手套和护目装备。
  4. 配制去甲肾上腺素（0.1 mg/mL）用于持续输注，以及配制（10 µg/mL）用于推注。
  5. 将去甲肾上腺素注射泵连接至中心静脉导管的一个端口，但暂不启动。
  6. 启动超快 pO₂ 测量2-测量
  7. 在诱导肺损伤之前，记录所有相关参数的数值（基线值）。
  8. 设定 FiO2 至1.0，并进行肺复张操作（平台压40 cm H₂O）2O 持续 10 秒。
  9. 将三通阀连接至肺动脉导管的近端端口。
  10. 通过三通旋塞阀将油酸和血液/生理盐水混合物在两个注射器之间反复推注，充分混匀，并持续保持混合状态。
  11. 当形成均一乳剂后，注入2 mL乳剂并继续混合。
    注意：如果停止搅拌，乳液可能会分离为亲脂性和亲水性两部分。
  12. 注射油酸后需密切监测血流动力学变化，并备好去甲肾上腺素。必要时给予去甲肾上腺素 bolus 注射（10 – 100 µg）或持续输注，以维持平均动脉压在 60 mmHg 以上。
  13. 每3分钟重复注射2 mL该溶液，直至动脉血氧分压（PaO₂）达到目标值。2)/FiO2-比值低于 200 mmHg。
  14. 如果在达到PaO2/FiO2-比值在100至200 mmHg之间时，按照步骤5.1所述准备另外2个注射器。
  15. 等待30分钟，重新评估PaO₂2/FiO2-比值。如果仍超过200 mmHg，则重复步骤5.5–5.8，直至PaO₂/FiO₂比值达标。2/FiO2-比值介于100至200 mmHg之间。
  16. 如果PaO2/FiO2-比值在100至200 mmHg之间时，等待30分钟后再重新检查。
  17. 若持续低于200 mmHg，则开始实验/治疗；否则按照步骤5.1所述准备另外2支注射器，并重复步骤5.5–5.9。
  18. 根据ARDS网络的建议设置通气参数20.

6. 实验结束与安乐死

  1. 在持续麻醉基础上追加注射 0.5 mg 芬太尼，等待 5 分钟。随后注射 200 mg 丙泊酚和 40 mmol 氯化钾，使动物在深度麻醉状态下实施安乐死。

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结果

肺损伤诱导后，PaO2/FiO2 比值在分次给予油酸后下降（图1）。在本研究中，诱导肺损伤所需的油酸剂量为 0.185 ± 0.01 ml kg-1。所有动物在肺损伤诱导后均出现氧合功能受损，但后续时间过程中的变化存在个体差异。动物1和动物3的氧合水平保持相对稳定，仅有轻微波动；动物2表现为先短暂升高，随后在后期下降；而动物4则呈现持续上升趋势。尽管如此，在6小时后，所有4只动物均表现出明显的氧合功能障碍。因此，在诱导肺损伤过程中，必须密切监测 PaO2/FiO2 比值的变化。我们采用一种超快速 pO2 测量探针，以实时监测 PaO2 的下降情况21。另一种可选方法是在 SpO2 开始下降时，定期采集动脉血气样本进行检测。在给予溶剂对照处理的动物（动物5和动物6）中，PaO2

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讨论

本文介绍了一种以油酸诱导肺损伤的方法，可作为研究重度急性呼吸窘迫综合征（ARDS）多种特征的模型。此外，还有其他采用不同乳剂、不同注射部位及不同乳剂温度的实验方案23,24,25,26,27,28,29。我们的方法可实现肺功能稳定且可重复的恶化。由于油酸的作用具有剂量依赖性，因此有必要根据具体研究需求，确定个体化的PaO2/FiO2比值阈值，并找到达到该比值所需的油酸剂量。

使用该方法时存在一些注意事项。首先是油酸的脂溶性问题。为了使其在血液/生理盐水混合液中保持乳化状态，必须持...

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披露

所有作者均声明不存在经济利益或其他任何利益冲突。

致谢

作者感谢 Dagmar Dirvonskis 提供的出色技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
三通蓝色旋塞阀Becton Dickinson Infusion Therapy AB Helsingborg, Sweden394602
三通红色旋塞阀Becton Dickinson Infusion Therapy AB Helsingborg, Sweden394605
阿曲库铵Hikma Pharma GmbH , Martinsried4262659
20 G 套管针Becton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga, Spain301300
Datex Ohmeda S5GE Healthcare Finland Oy, Helsinki, Finland
消毒剂Schülke & Mayr GmbH, Germany104802
气管插管Teleflex Medical Sdn. Bhd, Malaysia112482
气管插管导引器Rüsch5033062
Engström CarestationGE Heathcare, Madison USA
芬太尼Janssen-Cilag GmbH, Neuss
手套Paul Hartmann, Germany9422131
Incetomat 管线 150 cmFresenius, Kabi Germany GmbH9004112
氯胺酮Hameln Pharmaceuticals GmbH
喉镜Teleflex Medical Sdn. Bhd, Malaysia671067-000020
Logical 压力监测系统Smith- Medical Germany GmbHMX9606
Logicath 7 Fr 三腔 30 cmSmith- Medical Germany GmbHMXA233x30x70-E
Masimo Radical 7Masimo Corporation Irvine, Ca 92618 USA
用于犬通气的面罩Henry Schein, Germany730-246
Neofox 套件Ocean optics Largo, FL USANEOFOX-KIT-PROBE
去甲肾上腺素Sanofi- Aventis, Seutschland GmbH73016
油酸Applichem GmbH Darmstadt, Germany1,426,591,611
原装 Perfusor 注射器 50 mL 鲁尔锁B.Braun Melsungen AG, Germany8728810F
PA 导管 Swan Ganz 7.5 Fr 110 cmEdwards Lifesciences LLC, Irvine CA, USA744F75
经皮套管导入套装 8.5 和 9 Fr，10 cm，带一体式止血阀/侧端口Arrow international inc. Reading, PA, USAAK-07903
Perfusor FM BraunB.Braun Melsungen AG, Germany8713820
氯化钾Fresenius, Kabi Germany GmbH6178549
丙泊酚 2%Fresenius, Kabi Germany GmbH
生理盐水B.Braun Melsungen AG, Germany
Sonosite Micromaxx 超声系统Sonosite Bothell, WA, USA
不锈钢 Macintosh 4 号Teleflex Medical Sdn. Bhd, Malaysia670000
SterofundinB.Braun Melsungen AG, Germany
Stresnil 40 mg/mLLilly Germany GmbH, Abteilung Elanco Animal Health
10 mL 注射器Becton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga, Spain309110
2 mL 注射器Becton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga, Spain300928
20 mL 注射器Becton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga, Spain300296
5 mL 注射器Becton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga, Spain309050
静脉导管 22GB.Braun Melsungen AG, Germany4269110S-01

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