一种简便有效的成人皮肤组织中人角质形成细胞的分离方法

Summary

在这里, 我们提出了一个协议, 以有效地隔离主要的人角质细胞从成人皮肤组织。该方法利用接种培养基中的岩石抑制剂 Y-27632, 将表皮细胞与真皮细胞自发分离, 从而简化了常规程序。

Abstract

从新鲜皮肤组织中分离出来的人角质形成细胞及其体外扩张已被广泛应用于实验室研究和临床应用。传统的人角质形成细胞的分离方法涉及两步序贯酶消化法, 由于细胞回收率低, 细胞减少, 在成年组织中产生原发体细胞效率低下。可行性。我们最近报告了一种先进的方法, 从皮肤组织中分离人类主要表皮祖细胞, 利用 Y-27632 激酶抑制剂在培养基中。与传统的协议相比, 该方法简单、简便、耗时少, 增加了上皮干细胞的产量, 增强了干细胞的特性。此外, 新的方法不需要分离表皮与真皮, 因此, 适合隔离细胞从不同类型的成人组织。这种新的隔离方法克服了传统方法的主要缺点, 更适合在实验室和临床应用中生产大量具有高效能的表皮细胞。在这里, 我们详细描述了新的方法。

Introduction

目的是制定一个简单有效的协议, 以隔离主要的人角质细胞 (好客精神) 从成人组织, 特别是在临床应用。皮肤表皮干细胞, 局部在皮肤的基底层, 具有很高的潜能增殖和分化, 并提供角质细胞维持皮肤的功能^{1,2,3, 4}. 从皮肤组织中分离出来的好客精神广泛用于皮肤组织工程和再生目的, 特别是在修复受损皮肤和用于临床应用的基因治疗^5,6。HKC 应用的关键问题是有效地分离和扩展大量的好客精神, 其体外^7、8具有很高的潜力。虽然不同的研究小组已经开发出了培养茎样好客精神的方法, 但这些方法有时耗时且复杂, 并有其他限制, 如低细胞产量和受皮肤标本类型的限制。使用⁹。例如, 传统的方法分离好客精神从皮肤组织涉及两步酶消化分离的表皮从真皮⁶。这种方法通常适用于新生儿组织, 但它变得非常困难, 当用于隔离细胞从成人组织。

Y-27632, 一种蛋白激酶 (岩石) 抑制剂, 据报道, 大大提高了表皮干细胞分离和菌落生长的效率^10,11,12。在以前的研究中, 我们发现 Y-27632 促进表皮细胞的克隆生长, 但通过差异控制黏附分子的表达来降低真皮细胞的产量¹³。我们还建立了一个新的条件接种培养基, 称为 G 培养基, 它支持的生长和产量的主要表皮细胞。采用 G-培养基与 Y-27632 相结合的方法, 可以在酶消化后自发分离表皮和真皮细胞, 从而去除表皮-真皮分离^13、14的步骤。根据以前的报告, 我们现在描述了这个新方法的详细程序, 以隔离好客精神从成人皮肤组织。

Protocol

本议定书所使用的人体组织已根据该机构的人类研究道德委员会的指导方针进行处理 (2015120401, 日期: 2015年5月12日)。

1. 筹备工作

1. 收集在医院的整形手术丢弃的新鲜成人腹部皮肤组织50毫升管与10毫升冰冷 Dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM)。标本可以保持在4°c, 可达72小时, 而不会显著影响细胞的生存能力。
2. 准备试剂和培养基, 如下所述。
   1. 添加1毫升青霉素 (100 U/毫升) 和链霉素 (100 毫克/升) 到50毫升的磷酸盐缓冲溶液 (PBS), 以准备洗涤液。
   2. 制备两组酶消化液: (1) 分别制备50毫升的酶 (2.5 毫克/毫升 DMEM) 和50毫升的 I 型胶原酶 (2.5 毫克/毫升在 DMEM) 单独为常规方法;(2) 准备50毫升的酶和 i 型胶原酶 (溶解125毫克的酶粉和125毫克的 i 型胶原酶粉在50毫升的 DMEM) 的新方法。
      注意: 所有的酶溶液都应用0.22 µm 过滤器过滤, 并保持 at4 °c。
   3. 为两种方法准备消化液: 0.05% 胰蛋白酶和0.25% 胰蛋白酶被商业购买。准备一个10毫克/毫升 DNase i 溶液溶解50毫克 DNase I 粉末5毫升的 PBS, 过滤它与0.22 µm 过滤器, 并存储在-20 °c。
   4. 制备500毫升培养基以中和酶消化: DMEM 培养基辅以10% 胎牛血清 (血清) 和1% 青霉素/链霉素。
   5. 准备500毫升的接种培养基 (生长因子含培养基, 称为 G 培养基): DMEM/F12 (3:1) 培养基含有1% 青霉素/链霉素, 40 µg/毫升 fungizone, 40 ng/毫升成纤维细胞生长因子 2 (FGF2), 20 ng/毫升表皮生长因子 (EGF), 和2% B27 补充剂。
   6. 预处理100毫米细胞培养皿, 2 毫升的涂层基质, 含有 i 型胶原蛋白, 在室温下为30分钟。

2. 常规方法

1. 皮肤组织预处理
   1. 采取 1.5 cm²皮肤组织和洗涤它1x 与10毫升 PBS;然后, 用10毫升70% 乙醇冲洗它三十年代和孵化2x 与10毫升的洗涤液 (PBS 含有2% 青霉素和链霉素), 每5分钟。
      注: 所有洗涤都是在层流罩内的100毫米细胞培养皿中进行的。
   2. 用无菌剪刀修剪组织, 去除皮下脂肪层在一个100毫米细胞培养皿, 然后, 体重的皮肤组织 (重量是1克在这个协议)。
      注意: 足够的修剪对于有效地将表皮与真皮分离是非常关键的。黄色脂肪层可以很容易地区分视觉。
   3. 将组织转移到另一100毫米无菌皿中, 真皮侧向下, 然后, 用手术刀刀片将皮肤组织切成3至4毫米宽的小条。
      注意: 真皮侧与脂肪层很容易被识别视觉。
   4. 在100毫米培养皿中加入10毫升的2.5 毫克/毫升酶溶液, 然后在4摄氏度 (不超过20小时) 一夜之间孵化盘子。
      注: 酶溶液的用量可以通过使用10毫升的酶溶液来计算每克组织的消化。
2. 表皮与皮肤组织的分离
   1. 第二天, 用细镊子从真皮中剥离表皮。
      注: 如果表皮不易脱落, 酶消化不足, 通常是由于组织的修剪不够。在这种情况下, 组织需要更长的孵化时间。
   2. 用手术刀刀片将去皮的表皮与500µL 细胞培养基放入组织浆料中;然后, 并用重悬它与10毫升0.25% 胰蛋白酶在50毫升管和孵化它20分钟在水浴在37°c, 与震动。
3. 原代细胞的采集与培养
   1. 在本协议中加入等量的中和溶液 (10 毫升) 中和胰蛋白酶活性。
   2. 通过用10毫升血清学吸管将溶液吹打和下 20x, 通过细胞溶液通过100µm 细胞过滤器, 去除任何残留的组织碎片, 使表皮细胞游离。
   3. 过滤后将细胞溶液在 200 x g处离心, 5 分钟;并用重悬中中和介质中的细胞颗粒进行洗涤, 然后再将其离心在 200 x g上以获得细胞颗粒。
   4. 并用重悬细胞颗粒在10毫升低钙, 无血清角质形成培养基 (可以持续森林)。用10µL 这个解决方案来计算总的细胞数, 然后, 将 2 x 10⁶细胞与10毫升的可持续可持续性转化为100毫米细胞培养皿, 用涂层基质 (含 i 型胶原) 预处理。
      注: 涂层是常规方法的必要步骤。
   5. 每 2 d 改变培养基。
      注: 在改变培养基前后, 检查显微镜下的细胞黏附力。
   6. 通过细胞时, 他们达到约80% 汇合。
      注意: 所有的养殖菜肴都经过预处理的涂层基质。

3. 新方法

1. 皮肤组织预处理
   1. 收集的组织如上文所述 (步骤 2.1) 的常规方法。
   2. 用10毫升的 PBS 清洗皮肤组织, 然后用电子秤将其称量在无菌塑料容器中 (该协议的重量约为1克)。
      注: 本协议所需组织的最小重量为0.1 克, 因为使用的组织标本太小, 很难获得足够数量的细胞。该协议没有最大的组织重量, 这最终取决于操作员的处理能力。
   3. 使用镊子冲洗皮肤组织与10毫升70% 乙醇在三十年代。
   4. 用10毫升洗涤液 (在步骤2.1.1 中制备) 培养组织 2x, 每次5分钟。
      注意: 上面提到的所有洗涤步骤都是在层流罩 (组织培养罩) 内的100毫米细胞培养皿中进行的。
   5. 将组织转移到另一种100毫米细胞培养无菌皿中。
   6. 使用手术刀刀片, 将组织彻底剁碎成组织浆液。
   7. 每5分钟添加200µL 的 PBS, 以保持组织湿润。
      注: 采取步骤 3.1.5-3.1.7 约15分钟。以上步骤均在室温下进行。
2. 皮肤组织的消化
   1. 将匀质组织溶液转化为50毫升管。每1克皮肤组织添加10毫升的酶合剂。将酶与匀质组织彻底混合。
   2. 在37摄氏度的水浴中以1小时的温度, 孵育混合物。
   3. 增加1/5 容量0.25% 胰蛋白酶 (2.5 毫升在这个协议) 到消化混合物为另30分钟在水浴在37°c。
   4. 添加 DNase I 溶液的酶混合物在 1:100 (v/v) 比 (250 µL 在本议定书) 和孵化它在室温下5分钟。
3. 原代细胞的采集与培养
   1. 在1:1 的比例中加入12.5 毫升中和介质, 停止消化过程。用10毫升的血清吸管将溶液中的液吸管向上和向下大约 20x, 以分离细胞。
   2. 通过100µm 细胞滤网过滤分离细胞, 去除组织碎片。离心机在 200 x g 5 分钟内清液观察试管底部的颗粒。
   3. 丢弃上清液, 用10毫升中和介质清洗细胞颗粒, 再以 200 x g为5分钟来收集细胞。
   4. 并用重悬细胞颗粒在10毫升接种培养基 (G-培养基从步 1.2.5) 与10µM Y-27632。
   5. 采取10µL 的解决方案计数的总细胞数, 然后, 板约 2 x 10⁶细胞与10毫升的 G 培养基成100毫米细胞培养皿。
      注意: 新方法不需要预涂步骤, 也不需要去除真皮层。
   6. 3 d 后, 用低钙能持续的培养基取代接种培养基。每 2 d 改变培养基。
      注意: 在改变培养基前后, 检查细胞黏附力。
   7. 通过细胞时, 他们达到约80% 汇合。
      注: 如有必要, 预处理细胞以0.05% 胰蛋白酶为2分钟, 并用 PBS 清洗细胞, 在 trypsinizing 表皮细胞之前清除污染的真皮细胞。

4. 细胞传代

1. 取出培养基, 用 PBS 冲洗细胞, 然后添加2毫升0.05% 胰蛋白酶 (每100毫米菜)。
2. 孵化细胞在孵化器 (37 °c 与 5% CO₂) 为5分钟。
3. 用显微镜检查细胞, 以确保所有细胞都与培养皿分离。
4. 添加8毫升的 DMEM 与10% 的血清, 以中和酶反应, 然后, 收集细胞在15毫升管。
5. 离心机在 200 x g 5 分钟获得细胞颗粒。
6. 慢慢去除上清液, 然后用10毫升的并用重悬细胞颗粒, 计算细胞数。
7. 板 1 x 10⁶细胞与10毫升的森林, 以每100毫米细胞盘。
8. 每2维更换一次介质。

Results

图 1给出了新方法 (图 1A) 和常规方法 (图 1B) 的示意图。传统的方法是两步消化, 这需要2天的过程。相比之下, 新的方法是一步消化, 这需要大约3小时的时间来完成。重要的是, 一步新的方法可以同时获得两个种群 (表皮和真皮细胞), 这取决于接种培养基中 Y-27632 的存在。此外, 如果在隔离后接种相同数量的细胞时, 表皮细胞的初始培养时间达到大约80% 汇合通常要比常规方法少3天。

新方法产生更多的主要表皮细胞, 生长在菌落形态学。从人皮肤组织中分离好客精神, 用含 Y-27632 的 G 介质进行接种。相同数量的细胞被电镀后, 传统的方法作为控制。最初接种后3和5天表皮细胞的代表性图像如图 2A所示...

Discussion

培养的初级好客精神已被广泛用于治疗创伤的诊所超过三年, 并从那时起, 一直重要的是有效地获得足够数量的细胞, 为临床应用及时的方式。因此, 在实践中, 传统的隔离方法, 需要分离的表皮与真皮, 使难以满足这些要求, 由于细胞的低产量和低的能力, 通过成人细胞。在这里, 我们描述了一个新的简单方法, 我们开发了以有效地获得好客精神从成人组织的基础上报告^13,14, 这是更适合于实验室和临床应用。

必须注意以下关键步骤, 以达到新方法的最佳效果。第一, 均匀化程序是关键步骤;均匀性不足会明显影响酶消化的效率, 导致分离细胞的低产量。第二, 胰蛋白酶消化步骤不应超过30分钟;否则, 离解细胞的生存能力将会减少。第三, 为了有效地收集分离出的细胞, 用于过滤的细胞过滤器的孔径大小应为100µm, 而单一滤网应用于过滤不超过20毫升的细胞溶液。第四, 初始电镀的密度是减少皮肤细胞污染的一个重要因素, 因为高细胞密度会显著降低 Y-27632 对真皮细胞的抑制作用。因此, 在电...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Countess 全自动细胞计数仪	Invitrogen Inc.	C10227	细胞自动计数
CO2 培养箱	Thermo Scientific	51026333	用于细胞培养
Sorvall ST 16R 离心机	Thermo Scientific	75004380	细胞离心机
恒温摇床	上海博讯	150036	用于水浴
电子秤	哈尔滨中辉	1171193	用于组织称重
细胞培养皿	Eppendorf	30702115	用于细胞培养
50ml 离心管	KIRGEN	171003	用于细胞离心机
细胞过滤器	康宁431792 细胞		过滤
磷酸盐缓冲溶液	Solarbio Life Science	P1020-500	洗涤液
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	中和培养基成分
定义的 K-SFM	Life Technologies	10785-012	表皮细胞培养基
青霉素 链霉素	Thermo Scientific	15140-122	抗生素
胎牛血清	生物工业	04-001-1AC5	中和培养基组分
0.05% 胰蛋白酶	Life Technologies	25300-062	用于 HKC 解离
0.25% 胰蛋白酶	北京阳光生物科技 &技术	T1350-100	用于 HKC 解离
包被基质试剂盒	Life Technologies	R-011-K	用于包被基质
分散酶	Gibco	17105-041	用于 HKC 分离
I 型胶原酶	Life Technologies	17100-017	用于 HKC 分离
脱氧核糖核酸酶 I	Sigma	9003-98-9	用于 HKC 分离
F12营养混合物，Hams	Life Technologies	31765035	G 培养基
B27 补充剂	Life Technologies	17504044	G 培养基中的生长因子
FGF-2 Millipore	Merck Biosciences	341595	G 培养基中的生长因子
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	ROCK 抑制剂
Fungizone	Gibco	15290026	G 培养基
EGF 重组蛋白	Gibco	PHG0311	生长因子在 G 培养基
细胞计数试剂盒-8	Thermo Scientific	NC9864731	细胞增殖和细胞毒性测定小鼠
抗人细胞角蛋白 5	惠普开发公司	MA-20142	用于免疫荧光染色以检查 HKC
的分化标志物兔抗人 Loricrin	Covance	PRB-145p	用于免疫荧光染色以检查 HKCs 的分化标志物
小鼠抗人 Vimentin	Cell Signaling Technology	3390	用于真皮成纤维细胞
整合素和 α 的免疫荧光染色;6（GOH3）	圣克鲁斯	SC-19622	HKCs
大鼠IgG2a FITC	Santa Cruz	&α 的 SC-2831	阴性对照抗体;6-整合素 流式细胞术分析