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方法文章

一种简化且高效的人类原代角质形成细胞从成人皮肤组织中的分离方法

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DOI：

10.3791/57784

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2018年8月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration and Laboratory for Tissue Engineering and Regeneration, School of Stomatology, Shandong University, 2Suzhou Institute of Shandong University, 3Department of Urology, Qilu Hospital of Shandong University

本文内容

摘要

本文介绍一种从成人皮肤组织中高效分离原代人角质形成细胞的方案。该方法通过在接种培养基中使用ROCK抑制剂Y-27632，使表皮细胞与真皮细胞自发分离，从而简化了传统操作步骤。

摘要

从新鲜皮肤组织中分离并扩增的原代人角质形成细胞 体外 已广泛用于实验室研究和临床应用。传统的人角质形成细胞分离方法采用两步连续酶消化法，但由于细胞回收率低和细胞活力下降，该方法在从成人组织中获取原代细胞时被证明效率较低。我们近期报道了一种改进的方法，可在培养基中添加Rho激酶抑制剂Y-27632，用于从皮肤组织中分离人原代表皮前体细胞。与传统方案相比，该新方法更简单、更便捷、耗时更短，且能提高上皮干细胞的得率，并增强其干细胞特性。此外，该新方法无需将表皮与真皮分离，因此适用于从多种类型的成人组织中分离细胞。这种新的分离方法克服了传统方法的主要缺陷，更适用于大量制备高活性的表皮细胞，以满足实验室和临床应用的需求。本文将详细描述该新方法。

引言

目标是开发一种简单高效的方案，用于从成人组织中分离原代人角质形成细胞（HKCs），尤其适用于临床应用。皮肤表皮干细胞定位于皮肤基底层，具有强大的增殖和分化潜能，可提供角质形成细胞以维持皮肤功能。1,2,3,4从皮肤组织中分离的人角质形成细胞（HKCs）被广泛应用于皮肤组织工程与再生医学领域，尤其在受损皮肤修复及临床应用中的基因治疗方面。5,6基于HKC的应用中的关键问题在于如何高效地分离并扩增大量具有高潜能的HKC 体外7,8尽管已有多个研究团队开发出培养类干细胞表皮角质形成细胞（HKCs）的方法，但这些方法有时耗时较长、操作复杂，并存在其他局限性，例如细胞得率低，且受限于所用皮肤标本的类型9例如，从皮肤组织中分离角质形成细胞的传统方法包括两步酶消化法，并将表皮与真皮分离6该方法通常对新生儿组织效果良好，但在用于从成人组织中分离细胞时会变得非常困难。

Y-27632 是一种 Rho 相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂，据报道可显著提高表皮干细胞分离效率及克隆形成能力10,11,12。在先前的研究中，我们发现 Y-27632 可通过差异调控黏附分子的表达，促进表皮细胞的克隆生长，但会降低真皮细胞的得率13。我们还建立了一种新的条件接种培养基，称为 G 培养基，能够支持原代表皮细胞的生长与得率。通过将 G 培养基与 Y-27632 结合使用，该新方法可在酶消化后自发分离表皮细胞与真皮细胞，从而省去表皮-真皮分离步骤13,14。基于以往研究，本文现详细描述从成人皮肤组织中分离角质形成细胞（HKCs）的新方法操作流程。

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方案

本方案中使用的人体组织均按照本机构人类研究伦理委员会指南（编号：2015120401，日期：2015年5月12日）进行处理。

1. 准备工作

  1. 在医院采集整形手术中丢弃的新鲜成人腹部皮肤组织，放入含有10 mL冰上预冷的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）的50 mL离心管中。样本可在4 °C保存最多72小时，细胞活力不会受到显著影响。
  2. 按以下方法准备试剂和培养基：
    1. 向50 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中加入1 mL青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 mg/L），配制洗涤液。
    2. 准备两组酶消化液：（1）分别配制50 mL中性蛋白酶（2.5 mg/mL，溶于DMEM）和50 mL I型胶原酶（2.5 mg/mL，溶于DMEM），用于传统方法；（2）配制50 mL中性蛋白酶与I型胶原酶混合液（将125 mg中性蛋白酶粉末和125 mg I型胶原酶粉末溶于50 mL DMEM中），用于新方法。
      注意：所有酶溶液均需使用0.22 µm滤器过滤，并保存于4 °C。
    3. 为两种方法准备消化溶液：0.05%胰蛋白酶和0.25%胰蛋白酶为市售产品。通过将50 mg DNase I粉末溶于5 mL PBS中配制10 mg/mL DNase I溶液，使用0.22 µm滤器过滤后，于-20 °C保存。
    4. 配制500 mL用于中和酶消化的培养基：含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基。
    5. 配制500 mL接种培养基（含生长因子的培养基，称为G培养基）：DMEM/F12（3:1）培养基，含1%青霉素/链霉素、40 µg/mL制霉菌素、40 ng/mL成纤维细胞生长因子2（FGF2）、20 ng/mL表皮生长因子（EGF）和2% B27添加剂。
    6. 室温下用2 mL含I型胶原的包被基质预处理100 mm细胞培养皿，孵育30分钟。

2. 传统方法

  1. 皮肤组织预处理
    1. 取 1.5 cm2 皮肤组织，用 10 mL PBS 清洗 1 次，然后用 10 mL 70% 乙醇冲洗 30 秒，再用洗涤液（含 2% 青霉素和链霉素的 PBS）10 mL 孵育 2 次，每次 5 分钟。
      注意：所有清洗步骤均在超净台内的 100 mm 细胞培养皿中进行。
    2. 在 100 mm 细胞培养皿中用无菌剪刀修剪组织，去除皮下脂肪层，然后称量皮肤组织（本方案中组织重量为 1 g）。
      注意：充分修剪对表皮与真皮的有效分离至关重要。黄色脂肪层可通过肉眼轻易识别。
    3. 将组织转移至另一个 100 mm 无菌培养皿中，真皮面朝下，然后用手术刀片将皮肤组织切成 3 至 4 mm 宽的条状。
      注意：带有脂肪层的真皮面可通过肉眼轻易识别。
    4. 向 100 mm 培养皿中的皮肤组织加入 10 mL 浓度为 2.5 mg/mL 的dispase溶液，然后在 4 °C 下过夜孵育（不超过 20 小时）。
      注意：dispase 溶液的用量可根据每克组织使用 10 mL dispase 溶液进行计算。
  2. 从皮肤组织中分离表皮
    1. 第二天，使用精细镊子将表皮从真皮上剥离。
      注意：若难以剥离表皮，说明 dispase 消化不充分，通常是因为组织修剪不足。此时需延长孵育时间。
    2. 用 500 µL 细胞培养基将剥离的表皮用手术刀片切碎成组织浆液；然后将其转移至 50 mL 管中，加入 10 mL 0.25% 胰蛋白酶溶液，于 37 °C 水浴中振荡孵育 20 分钟。
  3. 原代细胞的收集与培养
    1. 加入等体积的中和液（本方案中为 10 mL）以中和胰蛋白酶活性。
    2. 用 10 mL 血清移液管反复吹打溶液 20 次，使表皮细胞解离，然后将细胞悬液通过 100 µm 细胞滤网，以去除残留的组织碎片。
    3. 过滤后，在 200 x g 条件下离心 5 分钟；将细胞沉淀用中和培养基重悬洗涤，然后再次在 200 x g 条件下离心，获得细胞沉淀。
    4. 将细胞沉淀用 10 mL 低钙无血清角质形成细胞培养基（SFM）重悬。取 10 µL 溶液计数总细胞数，然后将约 2 x 106 个细胞接种于已预先包被基质（含 I 型胶原）的 100 mm 细胞培养皿中，加入 10 mL SFM。
      注意：包被是传统方法中的必要步骤。
    5. 每 2 天更换一次培养基。
      注意：更换培养基前后需在显微镜下观察细胞贴壁情况。
    6. 当细胞融合度达到约 80% 时进行传代。
      注意：所有培养皿均需预先包被基质。

3. 新方法

  1. 皮肤组织预处理
    1. 按照上述方法（步骤 2.1）收集组织用于常规方法。
    2. 用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗皮肤组织一次，然后在无菌塑料容器中使用电子天平称重（本方案中组织重量约为 1 g）。
      注意：本方案所需的最小组织重量为 0.1 g，因为若使用过小的组织样本，难以获得足够数量的细胞。本方案对组织最大重量无限制，最终取决于操作者的处理能力。
    3. 使用镊子将皮肤组织用 10 mL 70% 乙醇冲洗 30 秒。
    4. 将组织在洗涤液（按步骤 2.1.1 配制）中孵育两次，每次 10 mL，每次 5 分钟。
      注意：上述所有洗涤步骤均在超净台内的 100 mm 细胞培养皿中进行（即组织培养操作台）。
    5. 将组织转移至另一个无菌的 100 mm 细胞培养皿中。
    6. 使用手术刀片将组织彻底切碎成组织匀浆。
    7. 每隔 5 分钟加入 200 µL PBS，以保持组织湿润。
      注意：步骤 3.1.5 至 3.1.7 大约耗时 15 分钟。上述所有步骤均在室温下进行。
  2. 皮肤组织消化
    1. 将匀浆后的组织悬液转移至 50 mL 离心管中。每 1 g 皮肤组织加入 10 mL 酶混合液。充分混匀酶液与组织匀浆。
    2. 将混合物置于 37 °C 水浴中，震荡孵育 1 小时。
    3. 向消化混合物中加入 0.25% 胰蛋白酶体积的 1/5（本方案中为 2.5 mL），继续在 37 °C 水浴中孵育 30 分钟。
    4. 按 1:100（v/v）比例向酶混合液中加入 DNase I 溶液（本方案中为 250 µL），室温孵育 5 分钟。
  3. 原代细胞的收集与培养
    1. 加入 12.5 mL 中和培养基（按 1:1 比例）终止消化过程。使用 10 mL 血清移液管反复吹打约 20 次，使细胞充分解离。
    2. 将解离后的细胞通过 100 µm 细胞滤网过滤，以去除组织碎片。将滤液在 200 x g 条件下离心 5 分钟。观察管底的细胞沉淀。
    3. 弃去上清液，用 10 mL 中和培养基重悬细胞沉淀并洗涤，再次在 200 x g 条件下离心 5 分钟以收集细胞。
    4. 将细胞沉淀重悬于 10 mL 接种培养基（步骤 1.2.5 中的 G 培养基）中，其中含 10 µM Y-27632。
    5. 取 10 µL 悬液进行细胞总数计数，随后将约 2 x 106 个细胞接种于含 10 mL G 培养基的 100 mm 细胞培养皿中。
      注意：新方法无需预先包被步骤，也无需去除真皮层。
    6. 培养 3 天后，将接种培养基更换为低钙 SFM 培养基。此后每 2 天更换一次培养基。
      注意：更换培养基前后应检查细胞贴壁情况。
    7. 当细胞融合度达到约 80% 时进行传代。
      注意：如有必要，可在胰蛋白酶消化表皮细胞前，先用 0.05% 胰蛋白酶预处理细胞 2 分钟，并用 PBS 洗涤以去除污染的真皮细胞。

4. 细胞传代

  1. 吸去培养基，用 PBS 洗涤细胞，然后每 100 mm 培养皿加入 2 mL 0.05% 胰蛋白酶。
  2. 将细胞置于培养箱中（37 °C，含 5% CO2）孵育 5 分钟。
  3. 在显微镜下观察细胞，确认所有细胞均已从培养皿上脱落。
  4. 加入 8 mL 含 10% FBS 的 DMEM 以中和酶反应，然后将细胞收集至 15 mL 离心管中。
  5. 以 200 × g 离心 5 分钟，获得细胞沉淀。
  6. 小心吸去上清液，然后用 10 mL SFM 培养基重悬细胞沉淀，并计数细胞数量。
  7. 每 100 mm 细胞培养皿中接种 1 × 106 个细胞，加入 10 mL SFM 培养基。
  8. 每 2 天更换一次培养基。

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结果

新方法（图1A）与传统方法（图1B）的示意图见图1。传统方法为两步消化法，需耗时2天。相比之下，新方法为一步消化法，操作时间约为3小时。重要的是，该一步法可在接种培养基中含有Y-27632的条件下，同时获得两种细胞群体（表皮细胞和真皮细胞）。此外，若在细胞分离后接种相同数量的细胞，表皮细胞在新方法中的初始培养时间通常比传统方法至少缩短3天即可达到约80%的融合度。

新方法可获得更多的原代表皮细胞，这些细胞以集落形态生长。从人皮肤组织中分离的角质形成细胞（HKCs）接种于含有Y-27632的G培养基中。采用传统方法接种相同数量的细胞作为对照。图2A展示了初次接种后第3天和第5天表皮细胞的代表性图像。采用新方法获得的细胞...

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讨论

培养的原代人角质形成细胞（HKCs）已在临床上用于伤口治疗超过三十年。自那时起，及时高效地获得足量细胞以满足临床应用需求始终至关重要。然而在实际操作中，传统分离方法需要将表皮与真皮分离，由于细胞得率低且成年细胞传代能力差，难以满足这些需求。本文介绍了一种基于先前报道13,14而开发的新型简易方法，可更高效地从成年组织中获取HKCs，该方法更适合实验室及临床应用。

为了使新方法获得最佳结果，必须注意以下关键步骤。首先，匀浆步骤至关重要；匀浆不充分会明显影响酶消化的效率，导致解离细胞的得率降低。其次，胰蛋白酶消化步骤不应超过30分钟；否则，解离细胞的活力将下降。第三，为了高效收集解离的细胞，过滤时所用细胞筛的孔径应为100 µm，且单个细胞筛过滤的细胞悬液体积不应超过20 mL。第四，初始接种密度是减少真皮细胞污染的重要因素，因为较高的细胞密度会显著削弱Y-27632对真皮细胞的抑制作用。因此，在接种前，必须在分离过程结束时准确计数解离细胞的总数。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到中国国家重点研发计划（2017YFA0104604）、国家自然科学基金面上项目（NSFC，81772093）、苏州市科技发展计划（ZXL2015128）、江苏省自然科学基金（BK20161241）以及山东省泰山学者计划（tshw201502065）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Countess 自动细胞计数仪Invitrogen 公司 C10227自动细胞计数 
CO2 培养箱赛默飞世尔科技51026333用于细胞孵育
Sorvall ST 16R 离心机赛默飞世尔科技75004380细胞离心机
恒温振荡器上海博迅150036用于水浴
电子天平哈尔滨中惠1171193用于组织称重
细胞培养皿Eppendorf30702115用于细胞培养
50 ml 离心管KIRGEN171003用于细胞离心
细胞筛康宁公司431792细胞过滤
磷酸盐缓冲液Solarbio Life Science P1020-500洗涤液
DMEM赛默飞世尔科技C11995500中和培养基组分
定义的K-SFMLife Technologies10785-012表皮细胞培养基
青霉素-链霉素赛默飞世尔科技15140-122抗生素
胎牛血清生物工业公司04-001-1AC5中和培养基的组分
0.05% 胰蛋白酶Life Technologies25300-062用于 HKC 解离
0.25% 胰蛋白酶 北京索莱宝科技有限公司 &科技T1350-100用于 HKC 解离
包被基质试剂盒Life TechnologiesR-011-K用于包被基质
DispaseGibco17105-041用于HKC的分离
I型胶原酶Life Technologies17100-017用于HKC的分离
脱氧核糖核酸酶 ISigma9003-98-9用于HKC的分离
F12 营养混合物，HamsLife Technologies31765035G培养基组分
B27添加剂Life Technologies17504044G-培养基中的生长因子
FGF-2 Millipore默克生物科学341595G-培养基中的生长因子
Y-27632Sigma-AldrichY0503ROCK抑制剂
FungizoneGibco15290026G培养基的配制
EGF 重组人蛋白GibcoPHG0311G-培养基中的生长因子
Cell Counting Kit-8赛默飞世尔科技NC9864731细胞增殖与细胞毒性检测
小鼠抗人细胞角蛋白5惠普开发公司MA-20142用于检测HKC分化标志物的免疫荧光染色
兔抗人兜甲蛋白科文斯PRB-145p用于检测HKCs分化标志物的免疫荧光染色
小鼠抗人波形蛋白Cell Signaling Technology3390用于真皮成纤维细胞的免疫荧光染色
整合素 α6(GOH3)Santa Cruz SC-19622HKCs的流式细胞术分析
大鼠 IgG2a FITCSanta Cruz SC-2831阴性对照抗体 α6-整合素  流式细胞术分析 

参考文献

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