一种简化且高效的人类原代角质形成细胞从成人皮肤组织中的分离方法

摘要

本文介绍一种从成人皮肤组织中高效分离原代人角质形成细胞的方案。该方法通过在接种培养基中使用ROCK抑制剂Y-27632，使表皮细胞与真皮细胞自发分离，从而简化了传统操作步骤。

摘要

从新鲜皮肤组织中分离并扩增的原代人角质形成细胞 体外 已广泛用于实验室研究和临床应用。传统的人角质形成细胞分离方法采用两步连续酶消化法，但由于细胞回收率低和细胞活力下降，该方法在从成人组织中获取原代细胞时被证明效率较低。我们近期报道了一种改进的方法，可在培养基中添加Rho激酶抑制剂Y-27632，用于从皮肤组织中分离人原代表皮前体细胞。与传统方案相比，该新方法更简单、更便捷、耗时更短，且能提高上皮干细胞的得率，并增强其干细胞特性。此外，该新方法无需将表皮与真皮分离，因此适用于从多种类型的成人组织中分离细胞。这种新的分离方法克服了传统方法的主要缺陷，更适用于大量制备高活性的表皮细胞，以满足实验室和临床应用的需求。本文将详细描述该新方法。

引言

目标是开发一种简单高效的方案，用于从成人组织中分离原代人角质形成细胞（HKCs），尤其适用于临床应用。皮肤表皮干细胞定位于皮肤基底层，具有强大的增殖和分化潜能，可提供角质形成细胞以维持皮肤功能。^1,2,3,4从皮肤组织中分离的人角质形成细胞（HKCs）被广泛应用于皮肤组织工程与再生医学领域，尤其在受损皮肤修复及临床应用中的基因治疗方面。^5,6基于HKC的应用中的关键问题在于如何高效地分离并扩增大量具有高潜能的HKC 体外^7,8尽管已有多个研究团队开发出培养类干细胞表皮角质形成细胞（HKCs）的方法，但这些方法有时耗时较长、操作复杂，并存在其他局限性，例如细胞得率低，且受限于所用皮肤标本的类型⁹例如，从皮肤组织中分离角质形成细胞的传统方法包括两步酶消化法，并将表皮与真皮分离⁶该方法通常对新生儿组织效果良好，但在用于从成人组织中分离细胞时....

方案

本方案中使用的人体组织均按照本机构人类研究伦理委员会指南（编号：2015120401，日期：2015年5月12日）进行处理。

1. 准备工作

1. 在医院采集整形手术中丢弃的新鲜成人腹部皮肤组织，放入含有10 mL冰上预冷的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）的50 mL离心管中。样本可在4 °C保存最多72小时，细胞活力不会受到显著影响。
2. 按以下方法准备试剂和培养基：
   1. 向50 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中加入1 mL青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 mg/L），配制洗涤液。
   2. 准备两组酶消化液：（1）分别配制50 mL中性蛋白酶（2.5 mg/mL，溶于DMEM）和50 mL I型胶原酶（2.5 mg/mL，溶于DMEM），用于传统方法；（2）配制50 mL中性蛋白酶与I型胶原酶混合液（将125 mg中性蛋白酶粉末和125 mg I型胶原酶粉末溶于50 mL DMEM中），用于新方法。
      注意：所有酶溶液均需使用0.22 µm滤器过滤，并保存于4 °C。
   3. 为两种方法准备消化溶液：0.05%胰蛋白酶和0.25%胰蛋白酶为市售产品。通过将50 mg DNase I粉末溶于5 mL PBS中配制10 mg/mL DNase I溶液，使用0.22 µm滤器过滤后，于-20 °C保存。
   4. 配制500 mL用于中和酶消化的培养基：含10%胎牛血....

结果

新方法（图1A）与传统方法（图1B）的示意图见图1。传统方法为两步消化法，需耗时2天。相比之下，新方法为一步消化法，操作时间约为3小时。重要的是，该一步法可在接种培养基中含有Y-27632的条件下，同时获得两种细胞群体（表皮细胞和真皮细胞）。此外，若在细胞分离后接种相同数量的细胞，表皮细胞在新方法中的初始培养时间通常比传统方法至少缩短3天即可达到约80%的融合度。

新方法可获得更多的原代表皮细胞，这些细胞以集落形态生长。从人皮肤组织中分离的角质形成细胞（HKCs）接种于含有Y-27632的G培养基中。采用传统方法接种相同数量的细胞作为对照。图2A展示了初次接种后第3天和第5天表皮细胞的代表性图像。采用新方法获得的细胞.......

讨论

培养的原代人角质形成细胞（HKCs）已在临床上用于伤口治疗超过三十年。自那时起，及时高效地获得足量细胞以满足临床应用需求始终至关重要。然而在实际操作中，传统分离方法需要将表皮与真皮分离，由于细胞得率低且成年细胞传代能力差，难以满足这些需求。本文介绍了一种基于先前报道^13,14而开发的新型简易方法，可更高效地从成年组织中获取HKCs，该方法更适合实验室及临床应用。

为了使新方法获得最佳结果，必须注意以下关键步骤。首先，匀浆步骤至关重要；匀浆不充分会明显影响酶消化的效率，导致解离细胞的得率降低。其次，胰蛋白酶消化步骤不应超过30分钟；否则，解离细胞的活力将下降。第三，为了高效收集解离的细胞，过滤时所用细胞筛的孔径应为100 µm，且单个细胞筛过滤的细胞悬液体积不应超过20 mL。第四，初始接种密度是减少真皮细胞污染的重要因素，因为较高的细胞密度会显著削弱Y-27632对真皮细胞的抑制作用。因此，在接种前，必须在分离过程结束时准确计数解离细胞的总数。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Countess 自动细胞计数仪	Invitrogen 公司	C10227	自动细胞计数
CO2 培养箱	赛默飞世尔科技	51026333	用于细胞孵育
Sorvall ST 16R 离心机	赛默飞世尔科技	75004380	细胞离心机
恒温振荡器	上海博迅	150036	用于水浴
电子天平	哈尔滨中惠	1171193	用于组织称重
细胞培养皿	Eppendorf	30702115	用于细胞培养
50 ml 离心管	KIRGEN	171003	用于细胞离心
细胞筛	康宁公司	431792	细胞过滤
磷酸盐缓冲液	Solarbio Life Science	P1020-500	洗涤液
DMEM	赛默飞世尔科技	C11995500	中和培养基组分
定义的K-SFM	Life Technologies	10785-012	表皮细胞培养基
青霉素-链霉素	赛默飞世尔科技	15140-122	抗生素
胎牛血清	生物工业公司	04-001-1AC5	中和培养基的组分
0.05% 胰蛋白酶	Life Technologies	25300-062	用于 HKC 解离
0.25% 胰蛋白酶	北京索莱宝科技有限公司 &科技	T1350-100	用于 HKC 解离
包被基质试剂盒	Life Technologies	R-011-K	用于包被基质
Dispase	Gibco	17105-041	用于HKC的分离
I型胶原酶	Life Technologies	17100-017	用于HKC的分离
脱氧核糖核酸酶 I	Sigma	9003-98-9	用于HKC的分离
F12 营养混合物，Hams	Life Technologies	31765035	G培养基组分
B27添加剂	Life Technologies	17504044	G-培养基中的生长因子
FGF-2 Millipore	默克生物科学	341595	G-培养基中的生长因子
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	ROCK抑制剂
Fungizone	Gibco	15290026	G培养基的配制
EGF 重组人蛋白	Gibco	PHG0311	G-培养基中的生长因子
Cell Counting Kit-8	赛默飞世尔科技	NC9864731	细胞增殖与细胞毒性检测
小鼠抗人细胞角蛋白5	惠普开发公司	MA-20142	用于检测HKC分化标志物的免疫荧光染色
兔抗人兜甲蛋白	科文斯	PRB-145p	用于检测HKCs分化标志物的免疫荧光染色
小鼠抗人波形蛋白	Cell Signaling Technology	3390	用于真皮成纤维细胞的免疫荧光染色
整合素 α6(GOH3)	Santa Cruz	SC-19622	HKCs的流式细胞术分析
大鼠 IgG2a FITC	Santa Cruz	SC-2831	阴性对照抗体 α6-整合素  流式细胞术分析