需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

通过检测完整小鼠胚胎中β-半乳糖苷酶活性示踪基因表达

26.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/57785

⸱

2018年6月26日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biomedical and Health Sciences, Universidad Europea de Madrid, 2Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), 3School of Doctoral Studies and Research, Universidad Europea de Madrid

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了在早期小鼠全胚胎中检测β-半乳糖苷酶活性的标准实验方案，以及石蜡切片和复染的方法。该方法操作简便、快速，可用于监测发育过程中的基因表达，也可应用于组织切片、器官或培养细胞。

摘要

这 大肠杆菌 LacZ 基因，编码β-半乳糖苷酶，常被用作基因表达的报告基因以及细胞谱系研究中的示踪标记。经典的组织化学反应基于底物X-gal在铁氰化物和亚铁离子存在下的水解，生成不溶性的蓝色沉淀，易于观察。因此，随着发育的进行，β-半乳糖苷酶的活性可作为目的基因表达模式的标记。本文描述了在早期小鼠全胚胎中检测β-半乳糖苷酶活性的标准实验流程，以及后续进行石蜡切片和复染的方法。此外，还提供了一种全胚胎透明化处理的步骤，以更清晰地观察胚胎深层区域的X-gal染色结果。尽管需要优化反应条件以降低背景活性，但采用该方法可获得稳定可靠的结果。在实验应用中也应考虑其局限性，尤其是在进行整体染色时胚胎大小的影响。本实验方案为小鼠发育过程中β-半乳糖苷酶的检测提供了一种灵敏且可靠的方法，既适用于冷冻切片和整体器官，也可用于全胚胎检测。因此，利用该方案不仅可在全胚胎水平上分析发育过程中基因表达的动态模式，还可通过石蜡切片在细胞水平上进一步评估基因的精细表达情况。 关键词：β-半乳糖苷酶，X-gal染色，基因表达，细胞谱系，小鼠胚胎，组织化学，石蜡切片，整体透明化，发育生物学

引言

为了描述特定的基因表达模式，从Drosophila到哺乳动物，报告基因作为标记物的使用至关重要。在涉及转基因和基因敲除动物的实验中，大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）的细菌β-半乳糖苷酶基因（LacZ）是最广泛使用的报告基因之一1,2,3,4。β-半乳糖苷酶（β-gal）可催化β-半乳糖苷（如乳糖）水解为其单糖（葡萄糖和半乳糖）5。其最常用的底物是X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳吡喃糖苷），这是一种可被β-半乳糖苷酶水解为5-溴-4-氯-3-羟基吲哚和半乳糖的糖苷。前者可被氧化形成二聚体，当与铁氰化钾和亚铁氰化钾联合使用时，产生特征性的不溶性蓝色沉淀（图1）6。

的 LacZ 基因作为报告基因的使用已有三十多年的历史7,8通常， LacZ 插入到内源性启动子下游，取代开放阅读框，因此可用于细菌和细胞培养中可视化含有特定插入片段的细胞，以及在转基因动物中作为发育过程中内源性基因表达模式的示踪标记9在这方面，β-半乳糖苷酶活性的可视化已被广泛用于 果蝇 从单个细胞到整个组织，理解发育和细胞过程。 黑腹果蝇 遗传学方法有利于生成稳定品系，其中含有报告基因的修饰型P因子构建体 LacZ 被随机插入基因组的不同位置。因此，当其处于增强子元件的影响下时，可驱动报告基因以组织特异性的方式表达，这使得过去二十年中对大量基因表达模式的系统性分析成为可能10此外，利用转基因小鼠进行监测 LacZ 基因表达还能够通过Cre-loxP介导的重组检测基因重组事件，并在嵌合体分析中定位突变的胚胎干细胞衍生物11，这有助于实现对 LacZ 在特定组织中的表达以及时间上的表达变化。此外，在整体胚胎中，β-半乳糖苷酶活性的检测可能在不同强度下产生差异性染色模式，这些模式可在不同发育阶段方便地观察，以分析基因表达的时间动态变化8,12.

本文介绍了一种通过X-gal染色在小鼠胚胎早期发育阶段对完整组织进行基因表达可视化的方法。我们提出这一组织化学方法是一种高度敏感且成本低廉的技术，适用于在整体标本中或对石蜡包埋的组织或胚胎进行细胞水平上的标记细胞精确检测。与其他方法相比，该方法能够在小鼠组织中实现染色的直接可视化，并具有最低的背景信号13。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有实验程序均经国家心血管研究中心（CNIC）动物实验伦理委员会和马德里自治区政府批准，以确保尽量减少动物痛苦。

1. 从怀孕小鼠中收集胚胎（从E8.5至E12.5）

  1. 通过颈椎脱位或吸入 CO2 的方法处死怀孕小鼠。首次观察到阴道栓的当天记为胚胎发育第 0.5 天（E0.5）。
  2. 将动物仰卧位放置在吸水垫上，并用 70% 乙醇清洁小鼠腹部皮肤。
    注意：后续步骤无需无菌操作。
  3. 使用齿状镊夹起并提起腹部皮肤。
  4. 用手术剪在腹部正中线处垂直切开皮肤和腹壁，切口长度为 2 至 4 cm。
  5. 打开腹腔，用镊子取出子宫角，同时用手术剪剪断沿子宫内侧弯曲部的血管。
  6. 取出整串胚胎，并将其转移至含有 10 mL 冰上预冷的 0.01 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4，PBS）的培养皿中。
  7. 在体视显微镜下，于盛有 10 mL 新鲜冰 PBS 的培养皿中仔细解剖分离胚胎。用钟表匠镊夹住肌层以暴露羊膜囊，然后用镊尖撕开羊膜，取出其中的胚胎和卵黄囊。
  8. 收集来自怀孕小鼠早期阶段（E8.5 至 E12.5）的同窝胚胎（图 2）。
  9. 使用弯头镊将胚胎转移至另一盛有 10 mL 冷 1×PBS 的新培养皿中；对于非常小的胚胎（E8.5–E9.5），建议使用塑料移液管转移样本，以避免损伤胚胎。
  10. 开始固定前，用钟表匠镊从胚胎上剪取一小块组织，或从小型胚胎（E8.5 至 E9.5）中取羊膜，放入微量离心管中用于基因型鉴定。
    注意：LacZ 基因型鉴定采用聚合酶链式反应（PCR）引物：上游引物 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´；下游引物 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA -3´。

2. 小鼠胚胎的固定

  1. 将每个胚胎转移至含有1 mL 1× PBS的2 mL圆底微量离心管中。
    注意：本方案所有步骤均需在这些管中进行，并使用滚轴摇床振荡操作。
  2. 在室温下用1× PBS洗涤胚胎1分钟，以去除残留血液。使用塑料移液管更换管中液体。
  3. 在冰上用1 mL 0.125%戊二醛固定胚胎。
    注意：固定时间取决于胚胎大小：E8.5–E9.5胚胎固定20分钟，E10.5胚胎固定30分钟，E12.5胚胎固定1小时。
  4. 去除固定液，在进行X-gal染色前，用1× PBS在室温下洗涤胚胎两次，每次10分钟。

3. 小鼠胚胎整体β-半乳糖苷酶组织化学染色

  1. 在开始实验前，配制 X-Gal 漂洗缓冲液和 X-Gal 染色液（参见表1和材料表）。使用野生型（WT）同窝胚胎作为酶促反应的阴性对照。
  2. 将胚胎在 X-Gal 漂洗缓冲液中室温孵育 10 分钟（图2）。
  3. 将胚胎在 X-Gal 染色液中于 37 °C 避光孵育 2 小时至过夜。通过体视显微镜定期观察显色反应，直至胚胎中出现足够强度的蓝色染色且无背景干扰。在整个染色过程中，保持溶液 pH 在 8 至 9 之间以降低背景。若染色液开始褪色，应更换为新鲜底物溶液以延长酶促反应时间。
  4. 当获得理想信号后，将胚胎在微量离心管中用 1 mL 1x PBS 洗涤两次，每次 10 分钟，室温操作，以终止反应。
  5. 将染色后的胚胎转移至 1 mL 4% 多聚甲醛（PFA）中重新固定，4 °C 下孵育 1 小时至过夜。
    注意：胚胎可在 4% PFA/PBS 中于 4 °C 长期保存，也可立即进行切片处理。此最终固定步骤对染色模式的长期保存至关重要。
  6. 将胚胎在 1 mL 1x PBS 中室温洗涤两次，每次 10 分钟。
  7. 方案一：将胚胎依次浸入浓度递增的甘油溶液（20%、40%、60% 和 80% 甘油溶于 1x PBS）中，每种溶液室温孵育 1 小时，以实现透明化。
    注意：在 80% 甘油中可延长洗涤时间，甚至数天，直至胚胎完全透明，随后在此步骤将胚胎保存于 80% 甘油中，4 °C 存放（图2）。建议向保存于 4 °C 的甘油或 1x PBS 中的胚胎添加极少量叠氮化钠或一颗硫柳汞晶体，以防止霉菌生长。透明化完成后，可对整体胚胎进行拍照（步骤 4）。
  8. 方案二：将胚胎进行石蜡包埋，并使用切片机进行切片（图2）。在切片前，应先记录整体染色胚胎中的表达模式（步骤 4 和 5）。

4. 整体胚胎的摄影

  1. 在切片前对整体染色的胚胎进行拍照时，将胚胎转移至含有凝固的1-2%琼脂糖（溶于1x PBS）基底的培养皿中。
  2. 用10 mL 1x PBS完全覆盖琼脂糖包被培养皿中的胚胎，以防止在液体中拍照时发生脱水和反光。
  3. 使用镊子在1x PBS中调整胚胎的方向。对于较晚期的胚胎（E10.5–E12.5），可用镊子在琼脂糖中戳出小孔，将样本置于其中并从不同角度固定位置，以避免拍照过程中胚胎自由漂浮。
  4. 将培养皿放置在体视显微镜载物台上，使用透射光（下光源）。在拍照过程中切换“暗场”和“明场”模式，以设定所需的照明条件，并优化样本的透光性。
    注意：对晚期胚胎拍照时，建议使用光纤照明，以避免胚胎表面产生反光。拍摄透明化处理后的胚胎时，操作步骤相同，但需将其转移至含有100%甘油的培养皿中，并完全浸没。

5. X-gal 染色胚胎的石蜡包埋与切片

  1. 石蜡包埋
    1. 从 4 °C 取出经 X-gal 染色的胚胎（步骤 3.5），用 1 mL 1× PBS 洗涤三次，以去除多余的固定剂。
    2. 使用镊子将每个胚胎转移至组织学包埋盒中。
    3. 将装有胚胎的包埋盒放入烧杯中，于室温下依次通过梯度乙醇系列进行脱水：70% 乙醇处理一次，每次 30 分钟；96% 乙醇处理两次，每次 30 分钟；100% 乙醇处理两次，每次 30 分钟。
      注意：胚胎可在 4 °C 下于 70% 乙醇中长期保存，直至开始脱水过程。
    4. 将整个包埋盒在异丙醇中室温孵育 30 分钟。
    5. 用镊子将包埋盒转移至盛有预热异丙醇的玻璃染色缸中，并置于 60 °C 烤箱中 30 分钟。
    6. 将包埋盒放入另一个盛有 50% 异丙醇/50% 熔化石蜡混合液的玻璃染色缸中，在 60 °C 烤箱中放置 4 小时。
    7. 用熔化的石蜡更换两次，每次在 60 °C 孵育 30 分钟，对含胚胎的包埋盒进行孵育。
    8. 最后一次石蜡洗涤结束后，打开包埋盒，将每个胚胎转移至独立的组织包埋模具中，并在体视显微镜下观察样本。
    9. 向模具孔中加入 60 °C 的熔化石蜡。使用加热的镊子保持石蜡处于熔融状态，并小心地在模具中调整胚胎的方向。
      注意：正确摆放样本方向是实现胚胎在目标切面上切片的关键步骤。
    10. 在石蜡凝固前，将一个无盖的包埋盒置于蜡块顶部，并用熔化石蜡填满，然后在室温下静置过夜，使其完全冷却凝固。
    11. 待石蜡完全凝固后，从模具中取出固体蜡块，并将石蜡块在室温或 4 °C 下保存，直至进行切片14。
  2. 石蜡切片
    1. 在切片机上安装刀片，并设定切片厚度为 5–7 µm。将石蜡块在冰上冷却，并修整成立方体或金字塔形。
    2. 用少量熔化石蜡将蜡块固定在切片机夹持器上。
    3. 调整蜡块方向以实现最佳切割效果。使用标准切片机在室温下将石蜡块切成 5–7 µm 厚的切片。
    4. 使用细毛刷将切片转移至室温水浴中，以便操作和挑选切片。
    5. 用载玻片从水浴中捞取切片，并将其转移至 42 °C 水浴中进行展片。
    6. 从水浴中取出切片，轻轻放置于防脱载玻片上。
    7. 将载玻片置于 37 °C 烤箱中过夜充分干燥，以确保切片完全贴附，否则在染色过程中可能发生脱落。
      注意：在开始染色程序前，将载玻片在 4 °C 下保存。
  3. X-gal 染色石蜡切片的脱蜡与复染
    1. 将载玻片置于载玻片架上，放入 60 °C 烤箱中至少 45 分钟，使石蜡更易流动。
    2. 将载玻片转移至架上，使用玻璃染色缸进行以下操作：将架浸入含有浓度递减乙醇的染色缸中，以彻底去除石蜡并使组织水化：在 60 °C 下用异丙醇处理 5 分钟；再用异丙醇处理 3 分钟；100% 乙醇处理 2 分钟；96% 乙醇处理 1 分钟；70% 乙醇在室温下处理 1 分钟。
    3. 用蒸馏水冲洗切片两次，确保无乙醇残留。
    4. 在室温下用复染剂（例如 核固红溶液）复染切片 5 分钟（通常为 3–8 分钟）（图 2）。
      注意：此染色有助于显示切片中的整体组织结构。
    5. 染色后，用蒸馏水冲洗载玻片 1 分钟，并在显微镜下检查切片染色情况。
      注意：若染色效果过弱，可延长复染时间再次复染。
    6. 按以下递增浓度乙醇系列对切片进行脱水：95% 乙醇洗涤两次，每次 2 分钟；100% 乙醇洗涤两次，每次 2 分钟；为避免溶解蓝色沉淀物，仅用二甲苯快速洗涤一次。
    7. 将载玻片逐个从架上取下，放置于纸面上。然后使用合成的永久性封片介质对每张载玻片进行封片并加盖盖玻片。
      注意：二甲苯为易燃物质，其蒸气对人类健康及水生生物具有刺激性和危害性，必须在通风橱内操作，并佩戴适当的个人防护装备。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本文展示了在整只小鼠胚胎中使用X-gal作为底物进行β-半乳糖苷酶组织化学反应的标准实验方案所得结果（图1 和 图2）。通过该方案，我们利用在内源性Mt4-mmp启动子调控下表达LacZ报告基因的Mt4-mmp基因突变小鼠，检测了不同胚胎发育阶段（E9.5、E11.5和E12.5）中膜型4-基质金属蛋白酶（Mt4-mmp）的表达情况（图3、图4 和 图5）9,15。Mt4-mmp是一种通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定于细胞膜上的内肽酶。尽管已在多种人类癌症中检测到Mt4-mmp，并发现其与肿瘤生长进展相关，但目前关于其对细胞外基质成分的蛋白水解活性的信息仍十分有...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

E. coli 的 LacZ 基因由于具有高灵敏度和易于检测的特点，已被广泛用作基因表达模式研究中的报告基因。本方案描述了一种基于酶促反应的经典方法，用于检测 β-半乳糖苷酶（β-gal）的表达，该方法操作简便、快速且成本低廉。此方法也可在未经重大修改的情况下，应用于整体胚胎、完整器官、冰冻切片组织或培养细胞的检测。

准确应用本方法可获得稳定且易于解读的染色结果。然而，强烈建议同时设置对照并进行后续验证步骤。为此，本方案需平行开展于野生型同窝胚胎中，作为阴性对照，用于监测非特异性X-gal染色。此外，通过β-gal染色获得的表达数据应通过蛋白质印迹（western-blot）和定量PCR（Q-PCR）分析，或β-gal免疫组织化学染色予以验证。图5），与其他抗体联用还可鉴定表达LacZ的特定细胞类型9固定步骤需予以充分考虑，以保持β-半乳糖苷酶的酶活性并尽量减少染色过程中的背景信号。因此，与多聚甲醛固定相比，胚胎必须使用戊二醛进行固定，因其可获得最为一致且可...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢国家心血管研究中心（CNIC）组织病理学服务部门在技术方面提供的协助。同时感谢Motoharu Seiki博士慷慨提供Mt4-mmpLacZ小鼠，以及Alicia G. Arroyo博士对本项目的支持和对本文稿的审阅。我们还要感谢Peter Bonney对本文的校对。本研究由马德里欧洲大学通过授予C.S.C.的资助（# 2017UEM01）支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
2-丙醇SIGMA-ALDRICH24137-1L-R
琼脂糖SCHARLAU50004/ LE3Q2014
水性封片剂VECTOR LABSH-5501
合成封片剂MERCK100579
96% 乙醇PROLABO20824365
99.9% 绝对乙醇SCHARLAUET00021000
50% 戊二醛溶液SIGMA-ALDRICHG6403-100ml
85% 甘油MERCK104094
99.9% 甘油SIGMA-ALDRICHG5516
六水合氯化镁SIGMA-ALDRICH63064
非离子型表面活性剂（Nonidet P-40）SIGMA-ALDRICH542334
核固红复染剂SIGMA-ALDRICHN3020
石蜡片MERCK111609
多聚甲醛SIGMA-ALDRICH158127-500g
磷酸盐缓冲液（片剂）SIGMA-ALDRICHP4417-50TAB
亚铁氰化钾MERCK1049840500
铁氰化钾MERCK1049731000
叠氮化钠SIGMA-ALDRICHS8032
脱氧胆酸钠SIGMA-ALDRICH30970
一水合磷酸二氢钠SIGMA-ALDRICH106346
二水合磷酸氢二钠SIGMA-ALDRICH71638
百里酚SIGMA-ALDRICHT0501
Tris 盐酸盐（Tris HCl）SIGMA-ALDRICH10812846001 (Roche)
X-GALVENN NOVAR-0004-1000
二甲苯VWR CHEMICALSVWRC28973.363
设备
一次性塑料冷冻模具（15×15×5 mm）SAKURA4566
旋转式切片机LeicaRM2235
包埋盒Oxford TradeOT-10-9046
显微镜盖玻片（24×60 mm）VWRECN631-1575
显微镜载玻片Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSERAGAA000001#12E
防脱显微镜载玻片Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSERJ1820AMNZ
漂浮水浴锅LeicaHI1210
一次性低剖面切片机刀片FeatherUDM-R35
石蜡烘箱J.R. SELECTA2000205
石蜡分配器J.R. SELECTA4000490
体视显微镜LeicaDM500
聚丙烯微量离心管（2.0 mL）SIGMA-ALDRICHT2795
聚丙烯微量离心管（1.5 mL）SIGMA-ALDRICHT9661
旋转摇床IKA LabortechnikHS250 BASIC
搅拌加热板BibbyHB502
涡旋振荡器IKA LabortechnikMS1
实验室天平GRAMFH-2000
精密天平SartoriusISO9001
pH计CrisonBasic 20
光纤OptechPL2000

参考文献

  1. Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
  2. Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182(1994).
  3. Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
  4. Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
  5. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  6. Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
  7. Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
  8. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  9. Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767(2017).
  10. Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux's Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
  11. Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
  12. Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
  13. Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
  14. Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797(2011).
  15. Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
  16. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  17. Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
  18. Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
  19. Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
  20. Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
  21. Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
  22. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
  23. Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
  24. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  25. Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
  26. Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
  27. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
  28. Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937(2013).
  29. Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
  30. Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
  31. Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
  32. Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
  33. Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
  34. Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
  35. Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
  36. Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
  37. Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
  38. Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
  39. Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
  40. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  41. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  42. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  43. Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
  44. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

β-半乳糖苷酶检测X-gal染色小鼠胚胎分析石蜡切片组织化学检测基因表达示踪整体染色细胞谱系研究胚胎透明化发育生物学
通过检测完整小鼠胚胎中β-半乳糖苷酶活性示踪基因表达
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。