通过检测完整小鼠胚胎中β-半乳糖苷酶活性示踪基因表达

摘要

本文介绍了在早期小鼠全胚胎中检测β-半乳糖苷酶活性的标准实验方案，以及石蜡切片和复染的方法。该方法操作简便、快速，可用于监测发育过程中的基因表达，也可应用于组织切片、器官或培养细胞。

摘要

这 大肠杆菌 LacZ 基因，编码β-半乳糖苷酶，常被用作基因表达的报告基因以及细胞谱系研究中的示踪标记。经典的组织化学反应基于底物X-gal在铁氰化物和亚铁离子存在下的水解，生成不溶性的蓝色沉淀，易于观察。因此，随着发育的进行，β-半乳糖苷酶的活性可作为目的基因表达模式的标记。本文描述了在早期小鼠全胚胎中检测β-半乳糖苷酶活性的标准实验流程，以及后续进行石蜡切片和复染的方法。此外，还提供了一种全胚胎透明化处理的步骤，以更清晰地观察胚胎深层区域的X-gal染色结果。尽管需要优化反应条件以降低背景活性，但采用该方法可获得稳定可靠的结果。在实验应用中也应考虑其局限性，尤其是在进行整体染色时胚胎大小的影响。本实验方案为小鼠发育过程中β-半乳糖苷酶的检测提供了一种灵敏且可靠的方法，既适用于冷冻切片和整体器官，也可用于全胚胎检测。因此，利用该方案不仅可在全胚胎水平上分析发育过程中基因表达的动态模式，还可通过石蜡切片在细胞水平上进一步评估基因的精细表达情况。 关键词：β-半乳糖苷酶，X-gal染色，基因表达，细胞谱系，小鼠胚胎，组织化学，石蜡切片，整体透明化，发育生物学

引言

为了描述特定的基因表达模式，从Drosophila到哺乳动物，报告基因作为标记物的使用至关重要。在涉及转基因和基因敲除动物的实验中，大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）的细菌β-半乳糖苷酶基因（LacZ）是最广泛使用的报告基因之一^1,2,3,4。β-半乳糖苷酶（β-gal）可催化β-半乳糖苷（如乳糖）水解为其单糖（葡萄糖和半乳糖）⁵。其最常用的底物是X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳吡喃糖苷），这是一种可被β-半乳糖苷酶水解为5-溴-4-氯-3-羟基吲哚和半乳糖的糖苷。前者可被氧化形成二聚体，当与铁氰化钾和亚铁氰化钾联合使用时，产生特征性的不溶性蓝色沉淀（图1）⁶。

的 LacZ 基因作为报告基因的使用已有三十多年的历史^7,8

方案

所有实验程序均经国家心血管研究中心（CNIC）动物实验伦理委员会和马德里自治区政府批准，以确保尽量减少动物痛苦。

1. 从怀孕小鼠中收集胚胎（从E8.5至E12.5）

1. 通过颈椎脱位或吸入 CO₂ 的方法处死怀孕小鼠。首次观察到阴道栓的当天记为胚胎发育第 0.5 天（E0.5）。
2. 将动物仰卧位放置在吸水垫上，并用 70% 乙醇清洁小鼠腹部皮肤。
   注意：后续步骤无需无菌操作。
3. 使用齿状镊夹起并提起腹部皮肤。
4. 用手术剪在腹部正中线处垂直切开皮肤和腹壁，切口长度为 2 至 4 cm。
5. 打开腹腔，用镊子取出子宫角，同时用手术剪剪断沿子宫内侧弯曲部的血管。
6. 取出整串胚胎，并将其转移至含有 10 mL 冰上预冷的 0.01 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4，PBS）的培养皿中。
7. 在体视显微镜下，于盛有 10 mL 新鲜冰 PBS 的培养皿中仔细解剖分离胚胎。用钟表匠镊夹住肌层以暴露羊膜囊，然后用镊尖撕开羊膜，取出其中的胚胎和卵黄囊。
8. 收集来自怀孕小鼠早期阶段（E8.5 至 E12.5）的同窝胚胎（图 2）。
9. 使用弯头镊将胚胎转移至另一盛有 10 mL 冷 1×PBS 的新培养皿中；对于非常小的胚胎（E8.5–E9.5....

结果

本文展示了在整只小鼠胚胎中使用X-gal作为底物进行β-半乳糖苷酶组织化学反应的标准实验方案所得结果（图1 和 图2）。通过该方案，我们利用在内源性Mt4-mmp启动子调控下表达LacZ报告基因的Mt4-mmp基因突变小鼠，检测了不同胚胎发育阶段（E9.5、E11.5和E12.5）中膜型4-基质金属蛋白酶（Mt4-mmp）的表达情况（图3、图4 和 图5）^9,15。Mt4-mmp是一种通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定于细胞膜上的内肽酶。尽管已在多种人类癌症中检测到Mt4-mmp，并发现其与肿瘤生长进展相关，但目前关于其对细胞外基质成分的蛋白水解活性的信息仍十分有.......

讨论

E. coli 的 LacZ 基因由于具有高灵敏度和易于检测的特点，已被广泛用作基因表达模式研究中的报告基因。本方案描述了一种基于酶促反应的经典方法，用于检测 β-半乳糖苷酶（β-gal）的表达，该方法操作简便、快速且成本低廉。此方法也可在未经重大修改的情况下，应用于整体胚胎、完整器官、冰冻切片组织或培养细胞的检测。

准确应用本方法可获得稳定且易于解读的染色结果。然而，强烈建议同时设置对照并进行后续验证步骤。为此，本方案需平行开展于野生型同窝胚胎中，作为阴性对照，用于监测非特异性X-gal染色。此外，通过β-gal染色获得的表达数据应通过蛋白质印迹（western-blot）和定量PCR（Q-PCR）分析，或β-gal免疫组织化学染色予以验证。图5），与其他抗体联用还可鉴定表达LacZ的特定细胞类型⁹固定步骤需予以充分考虑，以保持β-半乳糖苷酶的酶活性并尽量减少染色过程中的背景信号。因此，与多聚甲醛固定相比，胚胎必须使用戊二醛进行固定，因其可获得最为一致且可.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
2-丙醇	SIGMA-ALDRICH	24137-1L-R
琼脂糖	SCHARLAU	50004/ LE3Q2014
水性封片剂	VECTOR LABS	H-5501
合成封片剂	MERCK	100579
96% 乙醇	PROLABO	20824365
99.9% 绝对乙醇	SCHARLAU	ET00021000
50% 戊二醛溶液	SIGMA-ALDRICH	G6403-100ml
85% 甘油	MERCK	104094
99.9% 甘油	SIGMA-ALDRICH	G5516
六水合氯化镁	SIGMA-ALDRICH	63064
非离子型表面活性剂（Nonidet P-40）	SIGMA-ALDRICH	542334
核固红复染剂	SIGMA-ALDRICH	N3020
石蜡片	MERCK	111609
多聚甲醛	SIGMA-ALDRICH	158127-500g
磷酸盐缓冲液（片剂）	SIGMA-ALDRICH	P4417-50TAB
亚铁氰化钾	MERCK	1049840500
铁氰化钾	MERCK	1049731000
叠氮化钠	SIGMA-ALDRICH	S8032
脱氧胆酸钠	SIGMA-ALDRICH	30970
一水合磷酸二氢钠	SIGMA-ALDRICH	106346
二水合磷酸氢二钠	SIGMA-ALDRICH	71638
百里酚	SIGMA-ALDRICH	T0501
Tris 盐酸盐（Tris HCl）	SIGMA-ALDRICH	10812846001 (Roche)
X-GAL	VENN NOVA	R-0004-1000
二甲苯	VWR CHEMICALS	VWRC28973.363
设备
一次性塑料冷冻模具（15×15×5 mm）	SAKURA	4566
旋转式切片机	Leica	RM2235
包埋盒	Oxford Trade	OT-10-9046
显微镜盖玻片（24×60 mm）	VWR	ECN631-1575
显微镜载玻片	Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER	AGAA000001#12E
防脱显微镜载玻片	Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER	J1820AMNZ
漂浮水浴锅	Leica	HI1210
一次性低剖面切片机刀片	Feather	UDM-R35
石蜡烘箱	J.R. SELECTA	2000205
石蜡分配器	J.R. SELECTA	4000490
体视显微镜	Leica	DM500
聚丙烯微量离心管（2.0 mL）	SIGMA-ALDRICH	T2795
聚丙烯微量离心管（1.5 mL）	SIGMA-ALDRICH	T9661
旋转摇床	IKA Labortechnik	HS250 BASIC
搅拌加热板	Bibby	HB502
涡旋振荡器	IKA Labortechnik	MS1
实验室天平	GRAM	FH-2000
精密天平	Sartorius	ISO9001
pH计	Crison	Basic 20
光纤	Optech	PL2000