Method Article

基于生物素的下拉法对细胞 miRNAs mRNA 靶点的验证

DOI:

10.3791/57786

⸱

June 12th, 2018

 ,  ,  , 
1School of Biotechnology, Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology, Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

In This Article

Summary

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本报告描述了一种快速可靠的方法来验证细胞 miRNAs 的 mRNA 目标。该方法采用合成生物素化锁定核酸 (低噪声放大) miRNA 模拟捕获靶 mRNA。随后, 采用链亲和素包覆磁性微珠对靶 mRNA 进行 qPCR 聚合酶链反应的定量。

Abstract

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MicroRNAs (miRNAs) 是一类小非编码 rna, 后转录调节细胞基因表达。MiRNAs 绑定到 3 ' 未翻译的区域 (UTR) 的目标 mRNA, 以抑制蛋白质的翻译或在某些情况下导致 mRNA 退化。miRNA 对目标 mRNA 的 3 ' UTR 的绑定由 miRNA 5 ' 末端的2–8核苷酸种子序列介导。虽然 miRNAs 作为细胞调控分子的作用已经建立, 但与功能相关的目标基因的识别仍然是一个挑战。生物信息学工具被用来预测 3 ' UTR 基因中的序列, 作为 miRNA 绑定的潜在目标。这些工具也被用来确定这些序列在相关物种之间的进化守恒, 以预测功能作用。然而, 这些计算方法往往产生假阳性结果, 仅限于预测 miRNA 和 mRNA 之间的典型交互作用。因此, 测量 miRNA 对其 mRNA 靶的直接约束的实验程序是建立功能交互的必要条件。在本报告中, 我们描述了一种敏感的方法来验证细胞 miRNA miR-125b 和 3 ' UTR PARP-1 mRNA 之间的直接相互作用。我们制定了一个协议, 其中合成生物素化 miRNA 模仿被转染成哺乳动物细胞和 miRNA mRNA 复合体的细胞裂解物被拉下来与链亲和素涂层磁性珠。最后, 采用 qPCR 策略对下拉核酸复合体中的靶 mRNA 进行量化。

Introduction

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MicroRNAs (miRNAs) 是小的非编码 rna, 负调节蛋白表达1。miRNA 的前体通过基因组的许多区域聚集, 最频繁地在基因间区域和蛋白质编码基因的内含子2,3。合成的 miRNAs 涉及转录 miRNAs 从 miRNA 编码基因4。miRNAs 进行序贯处理, 先在细胞核内, 然后在细胞质中生成单股 miRNAs4,5。随后, 成熟的 miRNAs 被纳入到 RNA 诱导的沉默复合体 (RISC): 一个 multimeric 蛋白-RNA 复合物, 其中包括 Argonaute 的蛋白质家族成员的目标识别4,5, 6,7。在 RISC 复杂的成熟 miRNAs 主要绑定到目标基因8,9,

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Protocol

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1. 转染 3 '-生物素化 miRNA

注: 在无菌层流罩内执行以下步骤。

  1. 种子 4 x 105–5 x 105 HEK-293T 细胞每井在2毫升完全 Dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM) [DMEM 补充10% 胎牛血清 (血清) 和1x 笔链球菌抗生素]。培养细胞在孵化器设置在37°c, 5% CO2隔夜。
  2. 第二天, 检查在光显微镜下被镀细胞的健康和黏附。
    注意: 确保细胞在继续下一步之前坚持并获得适当的形态学。HEK-293T 细胞通常准备转染 18–24 h 后电镀。
  3. 在一个无菌的1.7 毫升离心管, 稀释 75 picomoles 生物素化 miRNA 200 µL 最小的基本介质。将这种混合物转移到另一种1.7 毫升离心管, 含有脂质体基转染试剂 (8 µL/井) 稀释200µL 的最小基本介质。完全混合, 但轻轻地, 通过吹打和孵化20–25分钟在室温允许形成转染复合物。
  4. 用温和的吹打从6井培养板中取出旧介质, 用1.6 毫升新鲜制备的完整 DMEM (不需要1x 枝链球菌抗生素) 补充每一个井。
  5. 使用校准良好的吸管将转染复合物 (从 1.3) 降为6井板中的细胞。在添加复合物的同时, 轻轻地旋转盘子, 以确保其均匀分布在板材上。
    注意: 这一步对于实现高效转染非常关键, ....

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Results

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MiRNAs 通过绑定到目标基因来调节细胞过程。因此, 识别 mRNA 目标是理解 miRNA 功能的关键。在此, 我们详细阐述了一种识别细胞 miRNA mRNA 靶的方法。这个协议是从迩那里改编的。35利用生物素化低噪声的 miRNA 模拟到下拉靶 mRNA 的改进。基于低噪声的寡核苷酸模拟提高了靶结合的特异性, 由于改性核糖环的稳定性较高, 不含毒性效应36,37,38。我们采用这种方法将 PARP-1 mRNA 作为细胞 miRNA miR-125b 的靶向。在调节神经元功能39、40的脑组织中检测到最高的 miR-125b 表达水平。为了确定神经元细胞中 miR-125b 的靶点, 我们最近报告说.......

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Discussion

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细胞 miRNAs mRNA 靶点的鉴定对于了解其调控功能具有重要意义。基于种子序列互补和保护目标序列19、20, 采用了几种计算工具对目标进行预测。虽然这些工具很有价值, 但它们可以产生高级别的误报和假阴性。因此, 这些预测结合了实验方法, 如 RISC 复合体的免疫沉淀和 miRNA 的拉下: mRNA 复合体, 以确认 miRNAs 对各自目标27,31的直接约束力。本报告详述了一个实验策略, 利用生物素化 miRNA 模拟到下拉靶 mRNA。生物素下拉可用于识别高灵敏度、低假阳性率35、43的 miRNA 靶。因此, 通过耦合序列筛选捕获的 RNA 池, 也可以利用该方法对 miRNA 目标进行识别。但是, 此方法44有几个限制。外源.......

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Disclosures

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作者声明没有竞争的金融和非金融利益。

Acknowledgements

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这项工作得到了国家卫生研究院 (NIH)、DA024558、DA30896、DA033892、DA021471、AI22960 和 MD007586 (C.D.) DA037779 的部分支持。这项工作还得到了 RCMI 赠款 G12MD007586、范德比尔特 CTSA 补助金 UL1RR024975、Meharry 翻译研究中心 MeTRC 赠款 (CTSA U54/nih、RR026140/国立卫生研究院 NCRR 补助金和田纳西州艾滋病中心) 的支持。研究 (P30 AI110527)。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
细胞系 - HEK293T 细胞ATCCCRL-3216
热灭活胎牛血清 （Hi-FBS）GIBCO/Thermofisher10438-026
Dulbecco's 修改后的鹰's 培养基 （DMEM）GIBCO/Thermofisher11995-065
磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （1x）GIBCO/Thermofisher20012-027
胰蛋白酶-EDTA （0.25%） GIBCO/Thermofisher25200-056
青霉素-链霉素溶液 （100x）Cellgro/Mediatech30-002-CI
DNase AmbionAM2238
Opti-MEM 减血清培养基GIBCO/Thermofisher3198-088
Liopfectamine 2000 转染试剂Invitrogen/Thermofisher11668-019
生物素化 hsa-miR-125bExiqon339178/ID-27281622
生物素化加扰对照Exiqon479997-671/ID-714884
IGEPALSigma-Aldrich18896
链霉亲和素磁珠Pierce88816
酵母 tRNAInvitrogen/Thermofisher15401-011
牛血清白蛋白 （BSA）Sigma-AldrichA2153
氯化钾 （KCl） 溶液Sigma-Aldrich60142
氯化镁 （MgCl2）溶液Sigma-AldrichM1028
氢氧化钠 （NaOH）Sigma-Aldrich795429
乙二胺四乙酸二钠盐 （EDTA） 溶液，0.5 M，pH 8.0Sigma-AldrichE7889
二硫苏糖醇 （DTT）Sigma-Aldrich43815
超级酶Ambion/ThermofisherAM2694
蛋白酶抑制剂混合物Sigma-AldrichP8340
不含 RNAse/DNAse 的水GIBCO/Thermofisher10977-015
RNeasy 提取试剂盒Qiagen74104
iScript-Select cDNA 合成试剂盒Biorad170-8897
qPCR 引物 Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR 绿色超混合液Biorad172-5120
DynaMag-Spin 磁力架Invitrogen/Thermofisher12320D

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Izaurralde, E. MicroRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay. Cold Spring Harborsymposia on quantitative biology. 71, 523-530 (2006).
  2. Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A.

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