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基于生物素的下拉实验验证细胞miRNA的mRNA靶标

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DOI：

10.3791/57786

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2018年6月12日

 ,  ,  , 
1School of Biotechnology, Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology, Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

本文内容

摘要

本报告描述了一种快速且可靠的细胞miRNA mRNA靶标验证方法。该方法利用合成的生物素标记的锁核酸（Locked Nucleic Acid, LNA）miRNA模拟物来捕获靶标mRNA。随后，使用链霉亲和素包被的磁珠对靶标mRNA进行下拉富集，并通过qPCR聚合酶链式反应进行定量分析。

摘要

microRNA（miRNA）是一类小型非编码RNA，可在转录后水平调控细胞基因表达。miRNA通过结合靶mRNA的3'非翻译区（3' UTR）来抑制蛋白质翻译，或在某些情况下导致mRNA降解。miRNA与靶mRNA的3' UTR结合依赖于miRNA 5'端一段2–8个核苷酸长度的“种子序列”。尽管miRNA作为细胞调控分子的作用已得到充分证实，但识别具有功能相关性的靶mRNA仍是一项挑战。生物信息学工具已被用于预测mRNA 3' UTR中的序列是否可能成为miRNA结合的靶点，同时也被用于分析这些序列在相关物种间的进化保守性，以预测其潜在功能。然而，这些计算方法常产生假阳性结果，且仅限于预测miRNA与mRNA之间的经典相互作用。因此，有必要采用能够检测miRNA与其靶mRNA直接结合的实验方法，以确认其功能性的相互作用。本报告中，我们描述了一种高灵敏度的方法，用于验证细胞内miRNA miR-125b与PARP-1 mRNA 3' UTR之间的直接相互作用。我们详细阐述了一种实验方案：将合成的生物素标记miRNA类似物转染至哺乳动物细胞，随后利用链霉亲和素包被的磁珠从细胞裂解液中下拉miRNA-mRNA复合物，最后通过基于qPCR的策略对下拉所得核酸复合物中的靶mRNA进行定量分析。

引言

microRNA（miRNA）是一类小型非编码RNA，可负向调控蛋白质表达1。miRNA前体分布在基因组的多个区域，最常见于蛋白编码基因的基因间区和内含子中2,3。miRNA的生成过程包括由miRNA编码基因转录生成初级miRNA（pri-miRNA）4。pri-miRNA随后经历连续的加工过程，首先在细胞核内，然后在细胞质中，最终生成单链成熟miRNA4,5。随后，成熟miRNA被整合到RNA诱导的沉默复合体（RISC）中：这是一种多聚体蛋白-RNA复合物，包含Argonaute蛋白家族成员，用于靶标识别4,5,6,7。RISC复合体中的成熟miRNA主要结合于靶mRNA的3'非翻译区（UTR）8,9,10，但偶尔也可结合于mRNA的编码区或5'UTR区域10,11。miRNA与mRNA序列的结合会导致翻译抑制12,13,14，在某些情况下还会引起mRNA的不稳定15。由于单个miRNA可靶向多个mRNA，这些调控分子几乎参与了所有细胞过程，并已被证实与多种疾病状态相关16,17,18。

要深入理解miRNA如何调控细胞通路，需要鉴定其靶标mRNA。目前已有多种生物信息学平台可用于预测潜在的miRNA:mRNA相互作用19,20。这些预测方法依赖于miRNA第2–8位核苷酸的“种子序列”与靶标mRNA中的互补序列之间完全的Watson-Crick碱基配对4,21。此外，这些工具还能生成miRNA:mRNA双链体的二级结构，计算该分子相互作用的热力学参数，并显示结合位点在不同物种间的保守性，以提高靶标预测的功能相关性。然而，这些工具也存在局限性，即假阳性靶标预测率较高（约27–70%）15,22。最重要的是，这些in silico平台无法识别miRNA与其靶标之间的非经典相互作用23。因此，此类预测分析通常需结合实验方法，以验证具有功能相关性的靶标。

目前已开发出多种实验方法用于验证miRNA与mRNA之间的相互作用。利用miRNA模拟物（mimics）、海绵吸附体（sponges）和抑制剂等遗传学实验手段，通过改变细胞内miRNA的表达水平，可为miRNA对靶基因表达的调控作用提供线索24,25,26。此外，通过将含有靶mRNA 3'非翻译区（3' UTR）的克隆与miRNA模拟物或抑制剂共转染入细胞，基于报告基因的检测方法也可为miRNA的调控功能提供证据26。尽管这些方法对于研究miRNA介导的基因表达转录后调控至关重要，但转染效率以及细胞内miRNA水平改变所引发的多效性影响，是这些遗传学方法的主要局限性23,26。因此，研究人员常采用互补的生物化学方法，直接检测miRNA与其靶标之间的相互作用，以更深入地理解miRNA在细胞中的功能。

研究miRNA与其靶标之间直接相互作用的一种常用方法是免疫沉淀RISC复合物，随后检测复合物中的mRNA靶标27,28,29,30。最近，一种改进的RISC捕获方法也被用于鉴定miRNA靶标；该方法通过稳定RISC-miRNA-mRNA中间体中的靶标，并结合mRNA靶标的纯化来实现。然而，这些方法面临RNA与RNA结合蛋白之间非特异性相互作用的固有挑战，而这些相互作用通常由细胞区室分隔开来31,32。此外，这些检测依赖于AGO2蛋白的存在，以进行RISC复合物的免疫沉淀33。鉴于AGO2并非唯一介导有效miRNA:mRNA相互作用的argonaute蛋白，排除其他argonaute蛋白可能导致结果偏差34。因此，需要替代策略来研究miRNA与mRNA的直接结合。

在本报告中，我们详细阐述了一种一步法，用于检测miRNA与其靶mRNA之间的直接相互作用。首先，将3'端生物素标记的锁核酸（LNA）miRNA模拟物转染至哺乳动物细胞中。随后，利用链霉亲和素包被的磁珠从细胞裂解液中捕获miRNA:mRNA复合物。通过qPCR定量与互补miRNA结合的靶mRNA。

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方案

1. 转染3'-生物素标记的miRNA

注意：以下步骤均需在无菌的层流罩内进行。

  1. 在2 mL完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）[DMEM补充10%胎牛血清（FBS）和1×青霉素-链霉素抗生素]中，每孔接种4 × 105–5 × 105个HEK-293T细胞。将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养过夜。
  2. 次日，在光学显微镜下检查接种细胞的生长状态和贴壁情况。
    注意：在进行下一步操作前，需确认细胞已充分贴壁并呈现正常形态。HEK-293T细胞通常在接种后18–24小时适合进行转染。
  3. 在无菌的1.7 mL微量离心管中，将75皮摩尔的生物素标记miRNA溶于200 µL最低必需培养基中。将此混合液转移至另一含有脂质体转染试剂（每孔8 µL）的1.7 mL微量离心管中，该管中已预先加入200 µL最低必需培养基。通过移液器轻轻混匀，室温孵育20–25分钟，以形成转染复合物。
  4. 用移液器轻柔吸除6孔板中的旧培养基，并向每孔加入1.6 mL新配制的完全DMEM（不含1×青霉素-链霉素抗生素）。
  5. 使用校准良好的移液器，将转染复合物（来自步骤1.3）逐滴加入6孔板的细胞中。在添加过程中轻轻摇动培养板，以确保复合物在孔内均匀分布。
    注意：此步骤对实现高效转染至关重要，必须谨慎且耐心操作。
  6. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下继续培养至少36小时。

2. 链霉亲和素包被磁珠的制备 — I

  1. 充分涡旋重悬链霉亲和素磁珠。将30 µL珠悬浮液（每样本）转移至一支2 mL无核酸酶的微量离心管中。
  2. 将含有珠悬浮液的离心管置于磁珠分离架上（"磁铁" 此后）孵育2分钟。确保磁珠吸附在管壁与磁铁接触的一侧后，用微量移液器小心吸除上清液。
  3. 向珠子中加入100 µL珠子洗涤缓冲液（10 mM Tris-Cl pH 7.5，0.5 mM EDTA，1 M NaCl）。将离心管从磁力架上取下，在室温下涡旋振荡15秒以洗涤珠子。
  4. 将含有珠子的离心管置于磁力架上2分钟，小心移除并弃去上清液。
  5. 重复步骤 2.3 和 2.4，共洗涤三次。最后一次洗涤结束后，将试管从磁铁上取下。
  6. 向珠子中加入 100 µL RNase 去除溶液（0.1 M NaOH，0.05 M NaCl），涡旋振荡 15 秒充分混匀，室温孵育 5 分钟。将含有珠子的管置于磁力架上 2 分钟，小心移除并弃去上清液。
  7. 重复步骤 2.6，共进行三次。
  8. 加入洗脱液（0.5 M NaCl）至珠子中，涡旋振荡15秒，室温孵育5分钟。将重悬的珠子置于磁力架上2分钟，小心移除上清液。
  9. 加入200 µL封闭液（1 µg/µL BSA，2 µg/µL酵母tRNA）至珠粒中，室温下轻轻涡旋混匀15秒。在4 °C下于多管旋转仪中孵育16小时（过夜）。

3. 细胞裂解物的制备

  1. 在超净台内使用无菌细胞刮棒轻轻刮取转染后的HEK-293T细胞，随后将每份样品转移至无菌的2 mL微量离心管中。
  2. 通过在1,500 x g下离心收集刮下的细胞沉淀 g 5分钟。将沉淀重悬于1×无菌PBS（磷酸盐缓冲液），pH 7.2。再次以1,500 × g离心 g 5 分钟以获得无残留培养基的沉淀。立即将含有沉淀的离心管浸入冰中。
  3. 配制新鲜的完全细胞裂解缓冲液（150 mM NaCl，25 mM Tris-Cl，pH 7.5，5 mM DTT，0.5% IGEPAL，60 U/mL Superase，1×蛋白酶抑制剂）。
    注意：可预先配制不含IGEPAL、Superase和蛋白酶抑制剂混合物的细胞裂解缓冲液，并于室温保存。使用时，将上述添加剂按推荐的终浓度加入到基础细胞裂解缓冲液中，新鲜配制完全细胞裂解缓冲液，并置于冰上保存。
  4. 向每个微量离心管中的样品加入 260 µL 冰冷的完全细胞裂解缓冲液（即， 每个微量离心管含有从6孔板中一个孔收获的细胞），通过移液将细胞沉淀重悬为均一的悬浮液。
  5. 使用冻融法裂解细胞：将离心管置于 -80 °C 冰箱中孵育 10–15 分钟，随后置于冰上使细胞解冻。
  6. 将所得细胞裂解液在16,000 x g 在4 °C的制冷台式离心机中离心5分钟。
  7. 将澄清的细胞裂解液转移至预冷的无菌1.7 mL微量离心管中，置于冰上。弃去沉淀。
    注意：澄清裂解液的最终体积应为约 240–250 µL。
  8. 向澄清的裂解液中加入5 M NaCl，使其终浓度为1 M，并将样品置于冰上保存。

4. 链霉亲和素磁珠的制备 — II

  1. 配制新鲜的完整下拉洗涤缓冲液（10 mM KCl、1.5 mM MgCl2、10 mM Tris-Cl pH 7.5、5 mM DTT、1 M NaCl、0.5% IGEPAL、60 U/mL Superase 和 1× 蛋白酶抑制剂混合物）。
    注意：可预先配制不含 IGEPAL、Superase 和蛋白酶抑制剂混合物的下拉洗涤缓冲液母液，并在室温下保存。通过将上述添加剂以推荐的终浓度加入该母液中，新鲜配制完整的细胞裂解缓冲液，并将其置于冰上保存。
  2. 将含有已制备磁珠的离心管（来自步骤 2.9）置于磁力架上 2 分钟。小心移除并弃去上清液。
  3. 向磁珠中加入 150 µL 冰冷的完整下拉洗涤缓冲液。涡旋振荡 15 秒，在室温下孵育 30–60 秒。将离心管置于磁力架上 2 分钟。小心移除并弃去上清液。
  4. 重复步骤 4.3，共进行 3 次。
  5. 将磁珠重悬于 300 µL 完整下拉洗涤缓冲液中。

5. 拉下靶标 mRNA-miRNA 复合物

  1. 将300 µL细胞裂解液（来自步骤3.8）转移至含有300 µL珠子（来自步骤4.5）的微量离心管中。
  2. 将混合物在室温下于旋转摇床上孵育1小时。
  3. 将离心管置于磁力架上5分钟，小心移除并弃去上清液。
  4. 向珠子中加入300 µL预冷的完整免疫沉淀洗涤缓冲液，室温下涡旋振荡15秒，然后将离心管置于磁力架上5分钟，小心移除并弃去上清液。
  5. 重复步骤5.4两次。
  6. 将珠子重悬于100 µL无核酸酶的水中，并置于冰上孵育。

6. 总RNA提取、cDNA合成和qPCR

  1. 使用适当的方法（参见材料表）从重新悬浮的磁珠（来自步骤 5.6）中提取总 RNA。将提取的总 RNA 重悬于 25 µL 无核酸酶水中。使用分光光度计测定 RNA 浓度和质量（260/280 吸光度）。配制浓度为 50 ng/µL 的 RNA 工作液。
  2. 以 50 ng 总 RNA（来自步骤 6.1）为模板，在终体积 20 µL 的反应体系中，使用适当的 cDNA 合成试剂盒（参见材料表）并采用 oligo dT 引物进行三重重复的 cDNA 合成（表 1）。随后，将 PCR 管放入 qPCR 仪器中，按照表 2所述条件进行热循环。
  3. 使用 SYBR Green 化学法对 cDNA（来自步骤 6.2）进行 qPCR 检测（参见材料表）：
    1. 在无菌条件下，于 96 孔透明底板上进行所有 qPCR 反应，每个样本设三重重复。
    2. 将 qPCR 预混液（参见表 3）取 9 µL 分装至各孔中，然后向每孔加入 1 µL cDNA，使终体积为 10 µL。使用耐高温 PCR 板封膜密封 PCR 板，并将其装入 qPCR 仪器中。
    3. 按照表 4所述条件进行热循环。
    4. 将各样本的表达水平（Ct 值）相对于阴性对照（scrambled control）进行归一化处理，并利用这些数值计算基因表达的倍数变化。

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结果

miRNA 通过与靶标 mRNA 结合来调控细胞过程。因此，鉴定 mRNA 靶标是理解 miRNA 功能的关键。本文详细阐述了一种用于鉴定细胞内 miRNA 的 mRNA 靶标的方法。该方案改编自 Wani et al.35，改进之处在于使用生物素标记的基于锁核酸（LNA）的 miRNA 模拟物来富集靶标 mRNA。基于 LNA 的寡核苷酸模拟物由于修饰后的核糖环具有更高的稳定性，且无毒性，因而增强了靶标结合的特异性36,37,38。我们采用该方法成功富集了细胞 miRNA miR-125b 的靶标 mRNA PARP-1 mRNA。miR-125b 在脑组织中的表达水平最高，可调控神经元功能39,40。为...

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讨论

鉴定细胞miRNA的mRNA靶标对于理解其调控功能至关重要。目前已有多种计算工具通过种子序列互补性和靶序列保守性来预测靶标19,20。尽管这些工具具有重要价值，但仍可能产生较高比例的假阳性和假阴性结果。因此，通常需结合实验方法，如RISC复合物的免疫沉淀或miRNA:mRNA复合物的下拉实验，以验证miRNA与其靶标的直接结合27,31。本文详细描述了一种利用生物素标记的miRNA模拟物（miRNA mimics）下拉靶标mRNA的实验策略。生物素下拉法具有高灵敏度和低假阳性率，可用于miRNA靶标的鉴定35,43。因此，该方法还可结合对捕获RNA文库的序列分析，用于系统性鉴定miRNA靶标。然而，该方法也存在若干局限性44。外源性miRNA...

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务和非财务利益。

致谢

本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 DA037779（J.P.）、DA024558、DA30896、DA033892、DA021471、AI22960 和 MD007586（C.D.）。本工作还得到了 RCMI 资助项目 G12MD007586、范德堡临床与转化科学奖（CTSA）资助项目 UL1RR024975、梅哈里转化研究中心（MeTRC）CTSA 资助项目（NCRR/NIH 资助号 U54 RR026140）、NIMHD/NIH 资助项目 U54 MD007593，以及田纳西艾滋病研究中心（P30 AI110527）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞系- HEK293T 细胞ATCCCRL-3216
热灭活胎牛血清（Hi-FBS）GIBCO/Thermofisher10438-026
Dulbecco’s 修饰的 Eagle’s 培养基（DMEM）GIBCO/Thermofisher11995-065
磷酸盐缓冲液（PBS）（1x）GIBCO/Thermofisher20012-027
胰蛋白酶-EDTA（0.25%） GIBCO/Thermofisher25200-056
青霉素-链霉素溶液（100x）Cellgro/Mediatech30-002-CI
DNase AmbionAM2238
Opti-MEM 低血清培养基GIBCO/Thermofisher3198-088
Lipofectamine 2000 转染试剂Invitrogen/ Thermofisher11668-019
生物素标记的 hsa-miR-125bExiqon339178/ID-27281622
生物素标记的随机对照序列Exiqon479997-671/ID-714884
IGEPALSigma-Aldrich18896
链霉亲和素磁珠Pierce88816
酵母 tRNAInvitrogen/Thermofisher15401-011
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA2153
氯化钾（KCl）溶液Sigma-Aldrich60142
氯化镁（MgCl2）溶液Sigma-AldrichM1028
氢氧化钠（NaOH）Sigma-Aldrich795429
乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）溶液，0.5 M，pH 8.0Sigma-AldrichE7889
二硫苏糖醇（DTT）Sigma-Aldrich43815
SuperaseAmbion/ThermofisherAM2694
蛋白酶抑制剂混合物Sigma-AldrichP8340
无 RNase/DNase 的水GIBCO/Thermofisher10977-015
RNeasy 提取试剂盒Qiagen74104
iScript-Select cDNA 合成试剂盒Biorad170-8897
qPCR 引物 Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR green supermixBiorad172-5120
DynaMag-Spin 磁力架Invitrogen/Thermofisher12320D

参考文献

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miRNA miRNA qPCR miR 125b PARP 1 RNA

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