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方法文章

用于光谱分析的TRPV1纯化与重组

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DOI：

10.3791/57796

⸱

2018年7月3日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

本文内容

摘要

本文描述了获取去垢剂溶解的TRPV1生化量以进行光谱分析的具体方法。这些联合方案提供了生物化学和生物物理工具，可经适当调整后用于在膜环境可控条件下开展哺乳动物离子通道的结构与功能研究。

摘要

多模态离子通道可将多种不同性质的刺激转化为变构变化；这些动态构象的确定具有挑战性，目前仍大多未知。随着单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术的最新进展，多种离子通道的激动剂结合位点结构特征及其激活机制得以揭示，这为利用光谱学方法深入分析其门控机制奠定了基础。电子顺磁共振（EPR）和双电子-电子共振（DEER）等光谱技术此前主要局限于研究可大量纯化的原核离子通道。由于需要大量功能完整且稳定的膜蛋白，哺乳动物离子通道在这些方法中的应用受到限制。EPR 和 DEER 具有诸多优势，包括能够测定蛋白质可移动区域的结构与动态变化（尽管分辨率较低），而这些信息可能难以通过X射线晶体学或cryo-EM获得，同时还能监测可逆的门控行为转变（即关闭态、开放态、致敏态和脱敏态）。本文中，我们提供了获取毫克级功能性去垢剂溶解的瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1（TRPV1）的实验方案，该蛋白可用于EPR和DEER光谱学的标记研究。

引言

随着单颗粒冷冻电镜技术（cryo-EM）的最新进展，哺乳动物离子通道结构正以前所未有的速度被解析。特别是对多模态离子通道（如瞬时受体电位香草素1型通道，TRPV1）的结构研究，进一步加深了我们对其激活机制的理解1,2,3,4,5。然而，要理解离子通道的多模态门控机制及药物结合机制，还需获得其在膜环境中嵌入状态下的动态信息。

电子顺磁共振（EPR）和双电子-电子共振（DEER）波谱技术为离子通道提供了部分最明确的机制模型6,7,8,9,10,11,12,13。这些方法主要局限于原核和古菌离子通道的研究，这些通道在细菌中过表达时可获得大量经去垢剂纯化的蛋白质。随着真核膜蛋白在昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达技术的发展，用于功能和结构表征14,15,16，目前已有可能获得足够生化量的去垢剂纯化蛋白用于波谱学研究。

EPR 和 DEER 信号来源于一个 顺磁性自旋标记（SL）即，甲硫基磺酸盐）连接到蛋白质的单个半胱氨酸残基上。自旋标记可提供三类结构信息：运动性、可及性和距离。这些信息可用于判断在无配体状态和配体结合状态下，残基是埋藏于蛋白质内部，还是暴露于膜环境或水相环境中。13,17,18,19在高分辨率结构（若可获得）的背景下，EPR 和 DEER 数据提供了一系列约束条件，可用于在其天然环境中构建动态模型，同时监测可逆的门控转变过程。即，关闭态、开放态、致敏态和脱敏态）。此外，利用这些环境数据集还可确定蛋白质中的二级结构及其位置，包括那些通过X射线晶体学或冷冻电镜难以解析的柔性区域。20在脂质纳米盘中获得的冷冻电镜结构为离子通道的门控机制提供了重要信息3,21,22,23,24,25；然而，光谱学方法可以提供来自构象状态的动态信息（例如，这些热力学变化可能难以通过冷冻电镜（cryo-EM）确定。

实施电子顺磁共振（EPR）和双电子-电子共振（DEER）技术时必须克服诸多困难，包括去除所有半胱氨酸残基后蛋白质功能的丧失（尤其是在哺乳动物离子通道中半胱氨酸含量丰富）、蛋白质产量低、纯化过程及自旋标记后蛋白质不稳定，以及蛋白质在去垢剂或脂质体中发生聚集等问题。本文中，我们设计了一系列实验方案以克服这些关键障碍，并成功获得了哺乳动物感觉受体的DEER和EPR谱图信息。本文旨在描述一种功能性、最小化且不含半胱氨酸的大鼠TRPV1（eTRPV1）构建体的表达、纯化、标记及重组方法，用于光谱学分析。该方法适用于那些即使去除半胱氨酸残基后仍能保持功能的膜蛋白，或含有形成二硫键半胱氨酸的膜蛋白。这一系列实验方案可被调整用于其他哺乳动物离子通道的光谱学分析。

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方案

1. TRPV1 突变

注意：用于光谱分析的最小TRPV1构建体26 由全长无半胱氨酸的通道TRPV1构建而成27 采用聚合酶链式反应（PCR）方法（图1）。该无半胱氨酸的最小TRPV1构建体（以下简称eTRPV1）包含第110–603位和627–764位氨基酸残基。eTRPV1被克隆至pMO载体（一种基于pcDNA3.1的载体）用于功能分析，并克隆至一种重组供体质粒载体中28 含有8x组氨酸-麦芽糖结合蛋白（MBP）-烟草蚀刻病毒（TEV）标签，用于表达与纯化（图2A). eTRPV1单-半胱氨酸突变体通过定点诱变技术生成。载体和通道序列在下文中予以说明。 补充文件1：补充方法

  1. 使用在线工具设计定点突变引物29。
  2. 在0.2 mL离心管中混合以下组分：5 μL 10x反应缓冲液、1 μL dNTP混合液（100 mM）、各1 μL的10 μM正向和反向寡核苷酸引物、1 μL浓度为100 ng/μL的eTRPV1模板DNA26、1.5 μL DMSO、1 μL突变酶以及38.5 μL去离子水。将混合物短暂离心后放入PCR仪中。
  3. 进行PCR定点突变。
    1. 执行以下程序：(a) 95 °C变性2分钟，(b) 95 °C变性20秒，(c) 60 °C退火10秒，(d) 68 °C延伸4分钟（每1 kb延伸30秒）。重复步骤(b)至(d)共18个循环，随后在68 °C继续延伸5分钟，最后将反应体系维持在4 °C待用。
  4. 向反应体系中加入2 μL DpnI酶，混匀后于37 °C孵育30分钟。
  5. 进行转化实验
    1. 将E. coli感受态细胞置于冰上解冻。
    2. 向预冷的14 mL无菌离心管中加入75 μL感受态细胞和10 μL经DpnI处理的PCR产物，轻轻混匀。
    3. 将反应体系置于冰上孵育30分钟，随后在42 °C热激45秒，立即放回冰上冷却2分钟。将混合物涂布于含有羧苄青霉素（0.2 mg/mL）的Luria Broth（LB）琼脂平板上。于37 °C过夜培养。
    4. 从平板上挑取至少三个单菌落，分别接种至含羧苄青霉素（0.2 mg/mL）的4 mL LB培养基中，使用14 mL无菌离心管。于37 °C、250 rpm振荡培养过夜。
    5. 将过夜培养物在8,000 x g离心10分钟，收集菌体，并按照商品化质粒小提试剂盒说明书提取质粒DNA。
    6. 通过标准自动化DNA测序验证单半胱氨酸突变体的存在（参见材料表）。

2. eTRPV1 及单半胱氨酸突变体的功能分析

  1. HEK293细胞系转染30
    1. 在6孔板中培养HEK293细胞，每孔加入2 mL高糖培养基（DMEM）（37 °C，5% CO₂）2，95% 湿度）。准备融合度为 70 ‒ 80% 的 HEK293 细胞。
    2. 在两个独立的1.5 mL微量离心管中分别配制转染混合液。
      1. 对于反应A，将0.5 µg eTRPV1或含半胱氨酸突变的pMO加入250 µL最低必需培养基（例如 Opti-MEM)。对于反应B，将3 µL转染试剂加入250 µL最低必需培养基中。室温（RT）孵育各反应体系5分钟。
      2. 将反应液A和B用1 mL移液器混合，在室温下孵育45分钟。
    3. 从70–80%汇合度的孔中移除500 µL培养基，加入500 µL反应混合液。将培养板于4°C避光孵育过夜以进行Ca²⁺检测。2+ 成像（37 °C，5 % CO₂）2，以及95%湿度）。
  2. 钙2+ 在HEK293细胞中的成像30
    1. 用乙醇和水清洗直径为12 mm的玻璃盖玻片，并将其放入24孔板中。 
    2. 在每张盖玻片中央加入 75 µL 多聚-L-赖氨酸，将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 45 分钟2，95% 湿度）。 
    3. 除去多余的多聚-L-赖氨酸，用磷酸盐缓冲液（PBS）将盖玻片洗涤三次，以去除残留物。 
    4. 盖玻片准备好后，继续从6孔板上分离细胞。
    5. 吸去培养基，加入500 µL预热的PBS（37 °C）洗涤。
    6. 移除 PBS，加入 500 µL 胰蛋白酶，孵育 1 分钟。
    7. 加入500 µL预热的培养基（37 °C）以终止消化反应，并用移液器轻轻混匀；避免产生气泡。如有需要，可用更多培养基稀释该重悬液以调整细胞浓度。
    8. 将转染的HEK293细胞（70%汇合度）250 µL与250 µL培养基（每孔终体积为500 µL）接种至预处理的盖玻片上，置于培养箱（37 °C，5% CO₂，95%湿度）中孵育1–2小时，使细胞沉降并贴壁。 
    9. 同时，通过向林格缓冲液中加入0.02%普鲁尼克酸和1 µM Fluo-4-AM制备加载溶液，充分混匀。
    10. 移除孔中的 HEK293 培养基，加入 500 µL 负载溶液。 孵育细胞 1 小时（37 °C，5% CO₂）2，95% 湿度）。用预热的林格缓冲液将负载 Fluo-4 的细胞洗涤两次。
    11. 将载有细胞的盖玻片置于10毫米培养皿中，并放入显微镜载物台（使用10倍物镜；激发波长494 nm，发射波长506 nm），进行细胞内Ca2+ 测量。 
    12. 在灌注相应配体后，检测荧光强度的变化（例如，10 μM辣椒素）使用市售软件（参见 材料表). 
  3. mRNA 和 Xenopus laevis 卵母细胞制备30
    1. 用限制性内切酶线性化含eTRPV1及单个半胱氨酸突变体的pMO质粒 Pme在37 °C下孵育1小时。按照市售纯化试剂盒的说明纯化DNA。
    2. 使用经线性化和纯化的DNA，利用市售的兼容T7 RNA聚合酶的试剂盒合成带帽的RNA。
    3. 根据市售纯化试剂盒的说明纯化加帽RNA。通过测量260 nm波长处的吸光度定量RNA含量。  
    4. 转移 5 ‒ 10 mL 的 X. laevis 卵母细胞（商业可得）放入含有20 mL ND96溶液（96 毫摩尔 NaCl，2 毫摩尔 KCl，5 毫摩尔 HEPES，1 mM MgCl2；pH 7.4）中加入 1 mg/mL 胶原酶，室温下振荡孵育 50 分钟。
    5. 用ND96溶液冲洗卵母细胞，直至溶液澄清；加入新鲜的胶原酶，在室温下振荡消化30分钟。在体视显微镜下观察卵母细胞，当大多数卵母细胞（90%）的外层滤泡层（带有红色血管的光泽层）消失时，停止消化。再次用ND96溶液冲洗卵母细胞，直至溶液澄清。
    6. 将卵母细胞转移至含有 ND96 加 1 mM CaCl 的 50 mL 聚苯乙烯管中2 并振荡1小时。消化不足的卵母细胞会粘附在聚苯乙烯管上。
    7. 用含1 mM CaCl的ND96溶液冲洗卵母细胞2 并用50 µg/mL的庆大霉素和50 µg/mL的四环素补充溶液。
      注意：含四环素的溶液需避光保存。
    8. 选择膜完整且动物极与植物极界限清晰的大卵母细胞。在16 °C下孵育4小时，使其恢复后再进行显微注射。
    9. 使用玻璃移液管（外径：1.11 mm，内径：0.5 mm，长度：8.8 cm）通过纳升注射系统（46 nL/s）和体视显微镜（2倍放大）向卵母细胞中注射1–5 ng的eTRPV1及单半胱氨酸突变体mRNA。将卵母细胞储存在含CaCl₂的ND96溶液中，于16 °C保存。2 和抗生素（庆大霉素/四环素 1×）。
    10. 72小时后，使用双电极电压钳（TEVC）记录系统测量宏观电流31.
    11. 用拉制仪拉制硼硅酸盐玻璃微电极（0.3 MΩ），并用3 M KCl溶液填充。
    12. 使用移液管将卵母细胞放入记录室，并灌流浴液（120 毫摩尔 NaCl，2 毫摩尔 KCl，2 mM MgCl2, 1 毫摩尔 EGTA 和 10 mM HEPES 溶液；pH 7.4）中低速离心。
    13. 将两个电极浸入浴液中，以调节其移液管偏移量。将移液电极（硼硅酸盐玻璃移液管；外径：1.5 mm，内径：1.10 mm，长度：10 cm）轻轻推入卵母细胞，直至在体视显微镜（2倍放大）下观察到细胞表面出现微小压痕，同时膜电位发生变化。
    14. 将放大器设置切换至记录模式，施加持续1秒的电压钳制 ramp 程序（从 -80 mV 至 +80 mV），记录宏观电流。使用步骤 2.3.12 中的溶液，分别调节至 pH 7.4（作为对照）和 pH 5，加载至灌流系统，以检测 eTRPV1 活性。

3. 生成用于蛋白表达的重组杆状病毒基因组及杆状病毒

  1. Bacmid
    1. 将7.5 ng含有eTRPV1和/或单半胱氨酸突变体的重组供体质粒转化至100 μL DH10Bac E. coli 感受态细胞中。
    2. 加入900 μL SOC培养基（20 mg/mL胰蛋白胨、5 mg/mL酵母提取物、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4 和20 mM葡萄糖），在37 °C、225 rpm条件下孵育6–7小时。
    3. 直接从混合液及系列稀释液（1/10和1/100）中取100 µL，接种于含有100 μg/mL X-gal、40 μg/mL IPTG、7 μg/mL庆大霉素、10 μg/mL四环素和50 μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上。在37 °C下孵育至少48小时。
    4. 挑选直径约为2 mm的白色菌落，因为蓝色菌落不含目标插入片段。使用体视显微镜确认白色菌落内部无任何蓝色斑点。
    5. 挑取至少三个单菌落，转移至含4 mL LB培养基的14 mL无菌试管中，培养基中添加7 μg/mL庆大霉素、10 μg/mL四环素和50 μg/mL卡那霉素。在37 °C、250 rpm条件下过夜培养（约16小时）。
    6. 取1.5 mL过夜培养物，提取重组bacmid DNA（详细步骤参见补充文件1）。将提取的bacmid在4 °C保存，最长可保存两个月。
      注意：制备含有bacmid DNA的DH10Bac E. coli 的甘油保存菌种。取300 μL培养物，加入200 μL 50%甘油（终浓度为20%），分装后于-80 °C保存以备后续使用。
    7. 通过PCR验证重组bacmid中eTRPV1的存在（详细步骤参见补充文件1）。
  2. 杆状病毒
    注意：本实验采用6孔板格式转染Sf9昆虫细胞。所有试剂用量和体积均以每孔计。避免使用抗生素。
    1. 在2 mL昆虫细胞培养基中接种1 × 106个Sf9细胞。静置至少45分钟，使细胞贴壁。
    2. 将1 μg重组bacmid DNA溶于100 μL昆虫细胞培养基中，轻轻混匀。
    3. 将6 μL转染试剂（TR）溶于100 μL昆虫细胞培养基中，轻轻混匀。
    4. 将步骤3.2.2和3.2.3中的DNA溶液与转染试剂溶液混合，轻轻混匀后在室温下孵育30分钟。
    5. 向DNA/TR混合液中加入0.8 mL昆虫细胞培养基，轻轻混匀。
    6. 移除Sf9细胞中的培养基，并用1 mL新鲜培养基洗涤一次。
    7. 移除洗涤液，将DNA/TR混合液（步骤3.2.2–3.2.5）加入细胞中。在27 °C下孵育5小时（不振荡）。
    8. 移除转染混合液，更换为含0.5%胎牛血清（FBS）的2 mL昆虫细胞培养基。在27 °C下继续孵育5天。
      注意：为防止培养基蒸发，需在空孔中加入培养基，并用两层封口膜覆盖6孔板。
    9. 将细胞培养上清转移至15 mL离心管中。在4 °C、8,000 × g条件下离心15分钟，收集第一代病毒原液（P1）。将上清转移至新的15 mL离心管中，立即于4 °C保存。
      注意：用铝箔包裹离心管，避免病毒暴露于光照下。
    10. 制备第二代病毒原液（P2）时，将25 mL含2% FBS的昆虫细胞培养基中Sf9细胞密度调整为1 × 106个/mL，置于125 mL通风锥形瓶（平底）中。向25 mL培养物中加入25 μL P1病毒液。
    11. 在27 °C下孵育72小时。
    12. 收获P2病毒原液时，将培养物转移至新的50 mL离心管中，在4 °C、8,000 × g条件下离心15分钟。
    13. 将上清转移至新的50 mL离心管中，立即于4 °C保存。
      注意：用铝箔包裹离心管，避免光照。进行小规模实验以滴定P2病毒与Sf9细胞的比例，获得最佳TRPV1表达水平（详细步骤参见补充文件1中第4节“P2病毒小规模实验”）。
    14. 进行大规模蛋白表达时，在2.8 L硼硅酸盐玻璃烧瓶中配制1 L昆虫细胞培养基，细胞密度为2 × 106个/mL，培养基中添加0.5% FBS。
    15. 向1 L培养物中加入1 mL P2病毒原液，在27 °C下孵育72小时。 
      注意：第三天时，细胞密度应约为1.5至2.5 × 106个/mL。

4. eTRPV1 及单半胱氨酸突变体的纯化

  1. 膜的分离28
    1. 将1 L昆虫细胞悬浮培养物在4,500 × g、4 °C条件下离心20分钟，收集细胞。称量细胞沉淀（预期重量约为6–9 g）。
    2. 将细胞沉淀用25 mL预冷的缓冲液A（36.5 mM蔗糖、2 mM三(2-羧乙基)膦（TCEP）和50 mM Tris；pH 7.4）重悬，同时加入蛋白酶抑制剂（1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）、3 μg/mL亮抑酶肽、3 μg/mL抑肽酶和1 μg/mL胃蛋白酶抑制剂）。充分分散细胞团块以获得均一悬液，并在4 °C下旋转孵育20分钟。
    3. 使用手动匀浆器（Dounce组织研磨器）或高压均质器裂解细胞。在4 °C下以8,000 × g离心20分钟，去除细胞碎片。
      注：整个操作过程中应将裂解后的细胞及离心管置于冰上。 
    4. 收集上清液，在4 °C下以100,000 × g离心30分钟。弃去上清液，将膜沉淀用总共20 mL预冷的缓冲液B（150 mM NaCl、10%甘油、2 mM TCEP、50 mM HEPES；pH 7.4）重悬，同时补充蛋白酶抑制剂（同步骤4.1.2）。
    5. 将20 mL膜悬液分装至50 mL离心管中，液氮速冻。样品保存于-80 °C，待后续使用。
  2. 蛋白纯化26,28
    1. 将膜分装样品置于冰上解冻，每管加入3 mL正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）（200 mM储存液）。在4 °C下旋转孵育2小时。
    2. 在4 °C下以100,000 × g离心30分钟。收集上清液，加入1 mL预先平衡的湿态直链淀粉树脂。在4 °C下旋转孵育2小时。将蛋白-直链淀粉混合物上样至重力流层析柱。
      注意：洗涤过程中切勿让树脂干燥。
    3. 用10倍柱体积的预冷缓冲液C（150 mM NaCl、10%甘油、50 mM HEPES、0.5 mM DDM、0.1 μg/mL豆磷脂、0.5 mM TCEP；pH 7.4）洗涤结合蛋白的直链淀粉树脂。随后用10倍柱体积的预冷缓冲液D（150 mM NaCl、10%甘油、50 mM HEPES、0.5 mM DDM、0.1 μg/mL豆磷脂，pH 7.4）进行洗涤。
      注：洗涤前，将不含去垢剂和脂质的缓冲液D用氮气吹扫脱气。脱气完成后，再加入DDM和豆磷脂。
    4. 使用含20 mM麦芽糖的预冷脱气缓冲液D，以0.5 mL为一馏分，最多收集5 mL，洗脱eTRPV1蛋白。如条件允许，洗涤和洗脱过程均应在4 °C下进行。
    5. 通过测定280 nm波长处的吸光度定量蛋白含量。
      注：本方案每升培养物可获得0.5至1.0 mg蛋白。不同eTRPV1单半胱氨酸突变体的蛋白产量可能有所差异。进行EPR和DEER实验时，建议培养4–6 L细胞。

5. eTRPV1 单半胱氨酸突变位点的定点自旋标记

  1. 使用离心过滤装置（截留分子量 = 100 kDa）将含有 eTRPV1 的组分浓缩至 2 ‒ 2.5 mg/mL 用于标记（在 4 °C 下以 7,000 × g 离心 2 分钟，重复循环）。
  2. 从 DMSO 中配制的 100 mM 储存液中，向浓缩后的蛋白中加入 10 倍摩尔过量的 (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-3-yl) methyl methanethiosulfonate（MTSSL）自旋标记试剂（每 30 分钟添加一次，共 3 次，eTRPV1 单体与 MTSSL 的摩尔比为 1:10）17。反应在室温避光条件下进行 1 小时 30 分钟，随后在 4 °C 下过夜孵育。
    注意：在此步骤中，可在过夜自旋标记孵育期间加入 TEV 蛋白酶以去除 MBP 标签。
  3. 将标记后的 eTRPV1 上样至预先用缓冲液 E（150 mM NaCl，20 mM HEPES，0.5 mM DDM；pH 7.4）平衡的尺寸排阻色谱柱，通过快速蛋白液相色谱（FPLC）系统进行分离，收集含有 eTRPV1 四聚体的组分。
    注意：此步骤中不要加入 10% 甘油，因其会降低重组效率。
  4. 通过测定 280 nm 波长处的吸光度来定量蛋白含量。
  5. 通过运行 SDS-PAGE 凝胶（无染胶，4 ‒ 20%）评估样品纯度。样品现可用于溶液中和/或蛋白脂质体中的光谱测量。

6. eTRPV1 单半胱氨酸突变体的自旋标记与重组

  1. 将10 mg卵磷脂在40 °C、真空（≤100 mbar）条件下使用旋转蒸发仪干燥1小时。制备卵磷脂脂质体时，加入1 mL缓冲液F（200 mM NaCl，5 mM MOPS；pH 7.4），并将混合物超声处理15分钟，直至样品均匀。
  2. 加入DDM至终浓度为2 mM，以破坏脂质体结构，并在室温下孵育30分钟。
  3. 将标记蛋白浓缩至2 mg/mL，并按1:5的蛋白/脂质质量比加入脂质体中。
    注意：必须保持上述蛋白浓度，因为自旋标记效率在浓度过低时会下降，而浓度过高时蛋白可能发生沉淀。
  4. 加入缓冲液F，将蛋白/脂质体混合物调节至DDM的临界胶束浓度（CMC），并在4 °C下轻轻振荡孵育过夜。
  5. 用缓冲液F将蛋白/脂质体混合物体积加倍，并在室温下轻轻振荡，每隔1小时依次加入三份非极性聚苯乙烯吸附珠（分别为30 mg、50 mg和80 mg），以逐步去除去垢剂。
  6. 将混合物上样至柱式滤器（重力流层析柱）以去除吸附珠，然后将蛋白脂质体混合物转移至超速离心管中。在4 °C下以100,000 × g离心1小时。弃去上清液，将沉淀物重悬于30 μL缓冲液F中。
    注：样品可直接用于光谱分析或注射入Xenopus卵母细胞。若当日无法使用，应将样品在液氮中速冻后于-80 °C保存。
  7. 蛋白脂质体-Xenopus卵母细胞电生理学26,32
    1. 按照第2.2节所述方法，向Xenopus卵母细胞中注射50 nL不同稀释度的自旋标记蛋白脂质体。
    2. 注射12小时后，按照第2.3.10节所述进行两电极电压钳（TEVC）测量。
  8. 继续进行光谱测量与分析（第7节）。

7. DEER 与 EPR 波谱学

  1. 双电子-电子共振（DEER）波谱法
    1. 使用配备10 W放大器的Q波段（34 GHz）脉冲式电子顺磁共振（EPR）波谱仪，采用制造商提供的软件，以83°的四脉冲无死时间序列进行DEER测量33.
    2. 在缓冲液 E（步骤 5.5）中加入 30%（v/v）甘油作为冷冻保护剂，配制含 50 µM 去垢剂纯化的 eTRPV1 自旋标记半胱氨酸突变体溶液。
    3. 将样品加入密封的石英毛细管中，通过短暂低速离心（100 × g）使其沉降至管底。
    4. 将毛细管放入液氮中以冻结样品。样品可在此时于 -80 °C 保存，以备后续测定。
    5. 将样品直接放入微波共振腔中，在 -83° 下重新平衡 10 ‒ 20 分钟。
    6. 使用标准的四脉冲 DEER 协议测量样品：(π/2)mw1–τ1–(π)mw1–τ1–(π)mw2–τ2–(π)mw1–τ2–echo34(π/2)mw1 和 (π)mw1 的脉冲长度分别为 10 和 20 ns，(π)mw2 的脉冲长度为 40 ns。将频率间隔设置为 63 MHz。
      注意：初级 DEER 衰减数据可使用自行开发的软件进行分析（例如 在Matlab中）假设自旋标签间距离的分布为高斯分布的和19,35.
  2. 连续波电子顺磁共振（CW EPR）波谱法
    1. 使用厂家提供的软件，在X波段（9.6 GHz）波谱仪上于室温下进行连续波电子顺磁共振（CW EPR）实验。
    2. 打开水冷机、控制台和磁体电源以启动仪器。将软件与仪器连接，使仪器进入调谐状态，并等待至少30分钟，让仪器充分预热。
    3. 使用毛细作用将步骤5.5中的20 µL样品加入一支25 µL玻璃毛细管中，并用封口剂密封管端。
    4. 将毛细管装入微波腔，并使用软件的自动调谐功能手动或自动临界耦合谐振器。
    5. 在标准仪器条件下采集一阶导数谱：100 kHz 微波调制频率，1.6 G 磁场调制幅度，10 mW 微波功率。
    6. 在数据分析与展示时，先对光谱进行背景校正，再通过除以双重积分的峰峰值对光谱进行归一化处理。
    7. 通过测量一阶导数吸收谱中心线宽的倒数（ΔH）来确定自旋标记的流动性o-1)36.

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结果

无半胱氨酸最小TRPV1构建体（eTRPV1）及单一半胱氨酸突变体的功能表征

进行光谱研究的第一步是设计并表征无半胱氨酸的功能性蛋白构建体（图2A），以获得可用于生化实验量的蛋白质。eTRPV1具有功能活性，这一点已通过Ca2+成像和双电极电压钳（TEVC）技术确认（图2B-C）。此外，eTRPV1能够提供足量经去垢剂纯化的蛋白，可用于电子顺磁共振（EPR）和双电子-电子共振（DEER）实验（每升Sf9细胞可获得0.5 - 1 mg蛋白）26。在特定蛋白区域引入单个半胱氨酸可能会影响其功能。图2B展示了eTRPV1上两个单半胱氨酸突变体（E651C和A702C）的示例，它们的功能...

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讨论

目前用于表达和纯化哺乳动物膜蛋白的技术已能够获得足量的蛋白质，用于光谱学研究14,15,16,42。在此，我们已将这些技术应用于TRPV1蛋白的表达、纯化、重组以及光谱分析。

在本实验方案的关键步骤中，以下是我们针对TRPV1已进行故障排查、并可能需要根据其他蛋白质进行调整的步骤。应修改DNA序列以生成可产生0.5–1 mg/mL去垢剂纯化蛋白的模板；若模板产生的蛋白量低于0.5 mg/mL，则会带来困难，因为每种突变体需要培养超过6升的昆虫细胞培养物。蛋白必须浓缩至不低于2 mg/mL，且不含TCEP，以提高自旋标记效率。在低蛋白浓度下和/或存在TCEP残留的情况下进行标记将产生噪声较大的EPR谱图。尽管蛋白在纯化过程中保持在4 °C，但自旋标记必须在室温（RT）下进行，以提高效率。在纯化和标记过程中，甘油有助于提高蛋白稳定性...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们非常感谢 H. Mchaourab 博士提供 EPR 和 DEER 波谱仪的使用权限，以及 T. Rosenbaum 博士提供全长无半胱氨酸 TRPV1 质粒。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
QuikChange Lightning 定点突变试剂盒安捷伦科技210519-5
2-丙醇（异丙醇）Fisher ScientificA416
牛血清白蛋白（BSA）GoldBio.comA-420-10
直链淀粉树脂NEBE8021L
抑肽酶GoldBio.comA-655-25
大豆卵磷脂Sigma11145
杆状病毒-杆状病毒表达系统Invitrogen Life Technologies10359016
Biobeads SM-2 吸附剂 伯乐（Bio-Rad）152-3920
硼硅酸盐玻璃移液管（3.5''（卵母细胞注射）Drummond Scientific3-000-203 G/X
硼硅酸盐玻璃移液管（卵母细胞记录）Sutter InstrumentB150-110-10HP
CaCl₂·2H₂OFisher ScientificC79
羧苄西林（二钠）GoldBio.comC-103-5
Cellfectin 试剂Invitrogen Life Technologies10362-010
cellSens奥林巴斯
氯仿Fisher ScientificC606SK
I 型胶原酶Worthington-BiochemLS004196
CritisealVWR18000-299
D-(+)-葡萄糖Sigma G8270
D-(+)-麦芽糖一水合物Fisher ScientificBP684
DDM（正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷）AnatraceD310S
高葡萄糖培养基（Dulbecco’s 改良伊格尔’s 中等）SigmaD0572 
一次性 PD-10 脱盐柱GE Healthcare45-000-148
EGTAFisher ScientificO2783
胎牛血清Invitrogen Life Technologies10082-147
Fluo-4 AMLife TechnologiesF-14201
GenCatch Plus 质粒DNA小量提取试剂盒Epoch Life Science, Inc2160250
GenCatch PCR 纯化试剂盒Epoch Life Science, Inc2360050
硫酸庆大霉素Lonza17-518Z
玻璃毛细管（25 µl)VWR53432-761
玻璃烧瓶 2800 mLPyrex USA4423-2XL
甘油Fisher BioReagentsBP229
HEK293S GnTl-ATCCCRL-3022
HEPESSigma H4034
IPTG（异丙基-硫代-β-半乳糖苷）GoldBio.comI2481C25
硫酸卡那霉素Fisher ScientificBP906-5
KClFisher ChemicalP217
LB肉汤，MillerFisher bioReagentsBP1426
亮肽素半硫酸盐GoldBio.comL-010-5
Lipofectamine 2000Invitrogen Life Technologies11668-019
MgCl2 6H2OFisher ScientificBP214
MgSO4 7H2OFisher ScientificBP213
mMESSAGE mMACHINE T7 试剂盒AmbionAM1344
MOPSFisher bioReagentsBP2936
MTSL（1-氧基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷-3-基）甲基甲烷硫代磺酸酯多伦多研究化学品公司O873900
NaClFisher ChemicalS271
Opti-MEMLife Technologies31985-062
胃蛋白酶抑制剂AGoldBio.comP-020-5
泊洛沙姆 F-127（20%）PromoKine  CA707-59004
PMSFGoldBio.comP4170
聚-L-赖氨酸溶液Sigma-AldrichP4707
RNeasy Mini KitQiagen74104
密封毛细管VitroCom特殊订单
SF-900 II SFM（昆虫细胞培养基）Gibco，Life Technologies10902-088
Sf9细胞（SFM适应性）Invitrogen Life Technologies11496-015
大豆极性脂质提取物Avanti Polar Lipids, Inc541602C
蔗糖Fisher ScientificS25590
Superose 6 Increase 10/300 GLGE Healthcare29091596
TCEP HClGoldBio.comTCEP1
盐酸四环素Fisher ScientificBP912-100
Tris碱Fisher BioReagentsBP152
胰蛋白胨Difco0123-01
X-galGoldBio.comX4281C
非洲爪蟾卵母细胞NascoLM00935M
XL1-Blue 感受态细胞Agilent Technologies, Inc200249
酵母提取物Difco0127-01-7
Econo-Pack 层析柱Bio-Rad7321010
Mini-PROTEAN TGX 免染预制胶伯乐（Bio-Rad）17000436
pFastBac1 表达载体Invitrogen Life Technologies10360-014
DH10Bac感受态细胞Invitrogen Life Technologies10361-012
Critiseal毛细管密封剂Leica Microsystems02-676-20
ABI Model 3130XL 遗传分析仪Applied Biosystems4359571
移液管Fishebrand13-711-9AM
Nanoject IIDrummond Scientific3-000-204

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TRPV1 纯化电子顺磁共振双电子-电子共振去垢剂增溶蛋白质重组定点突变杆状病毒表达尺寸排阻色谱蛋白脂质体形成
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