本文描述了获取去垢剂溶解的TRPV1生化量以进行光谱分析的具体方法。这些联合方案提供了生物化学和生物物理工具，可经适当调整后用于在膜环境可控条件下开展哺乳动物离子通道的结构与功能研究。
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本文内容
摘要
摘要
多模态离子通道可将多种不同性质的刺激转化为变构变化；这些动态构象的确定具有挑战性，目前仍大多未知。随着单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术的最新进展，多种离子通道的激动剂结合位点结构特征及其激活机制得以揭示，这为利用光谱学方法深入分析其门控机制奠定了基础。电子顺磁共振（EPR）和双电子-电子共振（DEER）等光谱技术此前主要局限于研究可大量纯化的原核离子通道。由于需要大量功能完整且稳定的膜蛋白，哺乳动物离子通道在这些方法中的应用受到限制。EPR 和 DEER 具有诸多优势，包括能够测定蛋白质可移动区域的结构与动态变化（尽管分辨率较低），而这些信息可能难以通过X射线晶体学或cryo-EM获得，同时还能监测可逆的门控行为转变（即关闭态、开放态、致敏态和脱敏态）。本文中，我们提供了获取毫克级功能性去垢剂溶解的瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1（TRPV1）的实验方案，该蛋白可用于EPR和DEER光谱学的标记研究。
引言
随着单颗粒冷冻电镜技术（cryo-EM）的最新进展，哺乳动物离子通道结构正以前所未有的速度被解析。特别是对多模态离子通道（如瞬时受体电位香草素1型通道，TRPV1）的结构研究，进一步加深了我们对其激活机制的理解1,2,3,4,5。然而，要理解离子通道的多模态门控机制及药物结合机制，还需获得其在膜环境中嵌入状态下的动态信息。
电子顺磁共振（EPR）和双电子-电子共振（DEER）波谱技术为离子通道提供了部分最明确的机制模型6,7,8,9,10,11,12,
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方案
1. TRPV1 突变
注意：用于光谱分析的最小TRPV1构建体26 由全长无半胱氨酸的通道TRPV1构建而成27 采用聚合酶链式反应（PCR）方法（图1）。该无半胱氨酸的最小TRPV1构建体（以下简称eTRPV1）包含第110–603位和627–764位氨基酸残基。eTRPV1被克隆至pMO载体（一种基于pcDNA3.1的载体）用于功能分析，并克隆至一种重组供体质粒载体中28 含有8x组氨酸-麦芽糖结合蛋白（MBP）-烟草蚀刻病毒（TEV）标签，用于表达与纯化（图2A). eTRPV1单-半胱氨酸突变体通过定点诱变技术生成。载体和通道序列在下文中予以说明。 补充文件1：补充方法
- 使用在线工具设计定点突变引物29。
- 在0.2 mL离心管中混合以下组分：5 μL 10x反应缓冲液、1 μL dNTP混合液（100 mM）、各1 μL的10 μM正向和反向寡核苷酸引物、1 μL浓度为100 ng/μL的eTRPV1模板DNA26....
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结果
无半胱氨酸最小TRPV1构建体（eTRPV1）及单一半胱氨酸突变体的功能表征
进行光谱研究的第一步是设计并表征无半胱氨酸的功能性蛋白构建体（图2A），以获得可用于生化实验量的蛋白质。eTRPV1具有功能活性，这一点已通过Ca2+成像和双电极电压钳（TEVC）技术确认（图2B-C）。此外，eTRPV1能够提供足量经去垢剂纯化的蛋白，可用于电子顺磁共振（EPR）和双电子-电子共振（DEER）实验（每升Sf9细胞可获得0.5 - 1 mg蛋白）26。在特定蛋白区域引入单个半胱氨酸可能会影响其功能。图2B展示了eTRPV1上两个单半胱氨酸突变体（E651C和A702C）的示例，它们的功能.......
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讨论
目前用于表达和纯化哺乳动物膜蛋白的技术已能够获得足量的蛋白质，用于光谱学研究14,15,16,42。在此，我们已将这些技术应用于TRPV1蛋白的表达、纯化、重组以及光谱分析。
在本实验方案的关键步骤中，以下是我们针对TRPV1已进行故障排查、并可能需要根据其他蛋白质进行调整的步骤。应修改DNA序列以生成可产生0.5–1 mg/mL去垢剂纯化蛋白的模板；若模板产生的蛋白量低于0.5 mg/mL，则会带来困难，因为每种突变体需要培养超过6升的昆虫细胞培养物。蛋白必须浓缩至不低于2 mg/mL，且不含TCEP，以提高自旋标记效率。在低蛋白浓度下和/或存在TCEP残留的情况下进行标记将产生噪声较大的EPR谱图。尽管蛋白在纯化过程中保持在4 °C，但自旋标记必须在室温（RT）下进行，以提高效率。在纯化和标记过程中，甘油有助于提高蛋白稳定性.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们非常感谢 H. Mchaourab 博士提供 EPR 和 DEER 波谱仪的使用权限，以及 T. Rosenbaum 博士提供全长无半胱氨酸 TRPV1 质粒。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| QuikChange Lightning 定点突变试剂盒 | 安捷伦科技 | 210519-5 | |
| 2-丙醇（异丙醇） | Fisher Scientific | A416 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | GoldBio.com | A-420-10 | |
| 直链淀粉树脂 | NEB | E8021L | |
| 抑肽酶 | GoldBio.com | A-655-25 | |
| 大豆卵磷脂 | Sigma | 11145 | |
| 杆状病毒-杆状病毒表达系统 | Invitrogen Life Technologies | 10359016 | |
| Biobeads SM-2 吸附剂 | 伯乐（Bio-Rad） | 152-3920 | |
| 硼硅酸盐玻璃移液管（3.5''（卵母细胞注射） | Drummond Scientific | 3-000-203 G/X | |
| 硼硅酸盐玻璃移液管（卵母细胞记录） | Sutter Instrument | B150-110-10HP | |
| CaCl₂·2H₂O | Fisher Scientific | C79 | |
| 羧苄西林（二钠） | GoldBio.com | C-103-5 | |
| Cellfectin 试剂 | Invitrogen Life Technologies | 10362-010 | |
| cellSens | 奥林巴斯 | ||
| 氯仿 | Fisher Scientific | C606SK | |
| I 型胶原酶 | Worthington-Biochem | LS004196 | |
| Critiseal | VWR | 18000-299 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma | G8270 | |
| D-(+)-麦芽糖一水合物 | Fisher Scientific | BP684 | |
| DDM（正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷） | Anatrace | D310S | |
| 高葡萄糖培养基（Dulbecco’s 改良伊格尔’s 中等） | Sigma | D0572 | |
| 一次性 PD-10 脱盐柱 | GE Healthcare | 45-000-148 | |
| EGTA | Fisher Scientific | O2783 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen Life Technologies | 10082-147 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F-14201 | |
| GenCatch Plus 质粒DNA小量提取试剂盒 | Epoch Life Science, Inc | 2160250 | |
| GenCatch PCR 纯化试剂盒 | Epoch Life Science, Inc | 2360050 | |
| 硫酸庆大霉素 | Lonza | 17-518Z | |
| 玻璃毛细管（25 µl) | VWR | 53432-761 | |
| 玻璃烧瓶 2800 mL | Pyrex USA | 4423-2XL | |
| 甘油 | Fisher BioReagents | BP229 | |
| HEK293S GnTl- | ATCC | CRL-3022 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| IPTG（异丙基-硫代-β-半乳糖苷） | GoldBio.com | I2481C25 | |
| 硫酸卡那霉素 | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| KCl | Fisher Chemical | P217 | |
| LB肉汤，Miller | Fisher bioReagents | BP1426 | |
| 亮肽素半硫酸盐 | GoldBio.com | L-010-5 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Life Technologies | 11668-019 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | BP214 | |
| MgSO4 7H2O | Fisher Scientific | BP213 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 试剂盒 | Ambion | AM1344 | |
| MOPS | Fisher bioReagents | BP2936 | |
| MTSL（1-氧基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷-3-基）甲基甲烷硫代磺酸酯 | 多伦多研究化学品公司 | O873900 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-062 | |
| 胃蛋白酶抑制剂A | GoldBio.com | P-020-5 | |
| 泊洛沙姆 F-127（20%） | PromoKine | CA707-59004 | |
| PMSF | GoldBio.com | P4170 | |
| 聚-L-赖氨酸溶液 | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| 密封毛细管 | VitroCom | 特殊订单 | |
| SF-900 II SFM（昆虫细胞培养基） | Gibco，Life Technologies | 10902-088 | |
| Sf9细胞（SFM适应性） | Invitrogen Life Technologies | 11496-015 | |
| 大豆极性脂质提取物 | Avanti Polar Lipids, Inc | 541602C | |
| 蔗糖 | Fisher Scientific | S25590 | |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | 29091596 | |
| TCEP HCl | GoldBio.com | TCEP1 | |
| 盐酸四环素 | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Tris碱 | Fisher BioReagents | BP152 | |
| 胰蛋白胨 | Difco | 0123-01 | |
| X-gal | GoldBio.com | X4281C | |
| 非洲爪蟾卵母细胞 | Nasco | LM00935M | |
| XL1-Blue 感受态细胞 | Agilent Technologies, Inc | 200249 | |
| 酵母提取物 | Difco | 0127-01-7 | |
| Econo-Pack 层析柱 | Bio-Rad | 7321010 | |
| Mini-PROTEAN TGX 免染预制胶 | 伯乐（Bio-Rad） | 17000436 | |
| pFastBac1 表达载体 | Invitrogen Life Technologies | 10360-014 | |
| DH10Bac感受态细胞 | Invitrogen Life Technologies | 10361-012 | |
| Critiseal毛细管密封剂 | Leica Microsystems | 02-676-20 | |
| ABI Model 3130XL 遗传分析仪 | Applied Biosystems | 4359571 | |
| 移液管 | Fishebrand | 13-711-9AM | |
| Nanoject II | Drummond Scientific | 3-000-204 |
参考文献
- Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504, 107-112 (2013).
- Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature.
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