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方法文章

使用宽场荧光显微镜测量用于力学生物学研究的软硅胶基底的刚度

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DOI：

10.3791/57797

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2018年7月3日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical & Aerospace Engineering, Old Dominion University, 2Department of Biological Sciences, Old Dominion University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

刚度在千帕范围内的基底可用于研究细胞对生理相关微环境刚度的响应。仅使用宽场荧光显微镜，即可通过使用合适微球进行压痕实验来测定软硅胶的杨氏模量。

摘要

人体内的软组织通常具有千帕（kPa）量级的刚度。因此，硅胶和水凝胶等柔性基底已被证实可用于细胞培养，提供一种在物理微环境上部分模拟天然组织特性的基底 体内 条件。本文介绍一种简单的方法，用于表征力学生物学研究中常用的各向同性线性弹性基底的杨氏模量。该方法包括：在培养皿或硬质硅胶上制备软硅胶基底，将荧光微球涂覆于硅胶基底的上表面，利用毫米级小球通过重力作用对硅胶上表面进行压痕，使用宽场荧光显微镜对压痕后硅胶表面的荧光微球成像，并分析所得图像以计算硅胶基底的杨氏模量。在硅胶基底上表面同时结合模量匹配的细胞外基质蛋白（除荧光微球外），可使该硅胶基底直接用于细胞铺板，并进一步开展牵引力显微镜实验。采用硬质硅胶而非培养皿作为软硅胶基底的支撑基底，可支持涉及外部拉伸的力学生物学研究。本方法的一个显著优势在于，所需主要设备为宽场荧光显微镜，而该设备在大多数实验室中均常见。我们通过测量不同弹性模量的软硅胶基底的杨氏模量，验证了该方法的可行性。

引言

软组织中的细胞所处的微环境刚度通常在千帕（kPa）范围内1，而传统组织培养皿的刚度则高出数个数量级。早期在包被了细胞外基质蛋白的软质基底上进行的细胞实验表明，基底刚度会影响细胞在基底表面的迁移行为以及对下方细胞外基质的黏附能力2,3。事实上，基底刚度对细胞功能具有根本性影响4 ，其作用方式类似于广泛存在的生化信号。聚丙烯酰胺凝胶（包被细胞外基质蛋白后）是一种可透水的水凝胶，已被广泛用作力学生物学研究中的细胞培养基底5。聚二甲基硅氧烷（PDMS）是最常见的硅酮（聚硅氧烷），长期以来被用作刚度在兆帕（MPa）范围内的硬质硅材料，适用于微米尺度的器件制备6。近年来，刚度更接近生理条件、处于千帕范围的软质硅基底也被用于力学生物学研究中的细胞培养7,8。

已有多种方法用于测量柔性基底的刚度，包括原子力显微镜、对整个样品拉伸时的宏观形变、流变学，以及使用球体或球形探针的微压痕法9。尽管每种技术都有其优缺点，但使用球体进行压痕测试是一种特别简单且相对准确的方法，仅需具备宽场荧光显微镜即可实现。在先前的研究中，已采用金属球压痕法测量水凝胶的刚度3,9,10。早期证明基底刚度对细胞运动具有重要意义的研究即利用该方法测定水凝胶基底的刚度3。近年来，共聚焦显微镜也被用于实现更为精细的表征10。

本文介绍了一种制备软质硅胶基底的逐步实验方案，包括仅在基底表面偶联荧光微球（以及如I型胶原等细胞外基质蛋白），分别利用相差成像和荧光成像技术对压痕球体和基底表面进行成像，最后通过图像分析计算硅胶基底的杨氏模量。采用该方法制备的软质硅胶基底可直接用于牵引力显微镜实验。使用刚性硅胶（而非培养皿）作为软质硅胶的支撑基底，还可实现对外加拉伸条件下进行力学生物学研究。文中还指出了在必要时为避免潜在问题所需注意的实用操作要点。

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方案

1. 软硅胶基底的制备

  1. 使用（聚苯乙烯）称量盘，从软质硅胶弹性体试剂盒中称取1.75 g A组分和1.75 g B组分（A:B = 1:1）。
  2. 将A组分加入称量盘中的B组分中，并使用适当的涂布棒混合5分钟。
  3. 将上述混合物倒入一个35 mm的培养皿中。静置数分钟，使混合物均匀铺展。
    注意：培养皿的直径和软质硅胶的用量将决定硅胶层的厚度。此处厚度约为3.5 mm；有关弹性体厚度选择的更多内容，请参见讨论部分。
  4. 将装有硅胶混合物的培养皿（不加盖）放入真空腔中抽真空15分钟，以去除其中的气泡。在此期间，将加热板预热至70 °C。
  5. 当加热板达到70 °C后，先将一块载玻片放置在加热板上，然后将装有硅胶混合物的培养皿置于载玻片上。在70 °C下加热固化硅胶30分钟。切勿将聚苯乙烯培养皿直接放置在加热板上，以免培养皿受热熔化。

2. 将荧光微珠与软质硅胶偶联

  1. 将已固化的软质硅胶（置于未加盖的培养皿中）放入深紫外（UV）腔室（内含波长为185 nm和254 nm的深紫外灯的密闭腔室）中。将软质硅胶样品置于距离紫外灯约5 - 10 cm处，暴露于深紫外光下5分钟。
    1. 在硅胶暴露于深紫外光的同时，继续进行以下步骤2.2 - 2.6。深紫外照射结束后，在取出样品前，需对深紫外腔室抽气至少5分钟。
  2. 在此期间，称取19 mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）至1.5 mL微量离心管中，并加入500 μL去离子水（DI水），通过轻轻振荡使EDC溶解。
  3. 另取一个1.5 mL微量离心管，称取11 mg的N-羟基磺基琥珀酰亚胺（sulfo-NHS），加入500 μL去离子水，通过轻轻振荡使其溶解。随后，将EDC溶液与sulfo-NHS溶液合并至同一微量离心管中。
  4. 向上述EDC/sulfo-NHS溶液中加入30 μL直径为0.44 μm的红色（或根据荧光显微镜可用的滤光片选择其他荧光颜色）羧基修饰荧光微球（储存浓度为1% w/v）。
  5. 向EDC/sulfo-NHS/微球混合物中加入0.02 mg的I型胶原蛋白（来源于大鼠尾部，储存浓度为4 mg/mL，溶于0.02 M乙酸中），使其终浓度约为0.02 mg/mL。
  6. 短暂涡旋EDC/NHS/微球/胶原蛋白I混合物，确保微球均匀分散，然后进行偶联反应。
  7. 将1 mL的EDC/NHS/微球/胶原蛋白I混合物滴加至置于另一浅平盖（直径较小）上方的Parafilm膜上。将带有软质硅胶的培养皿倒置，使其硅胶面接触混合物，但不直接接触下方较小培养皿盖的表面。可通过在倒置培养皿两侧下方各放置一至两张载玻片，以抬高培养皿。
    注：请参见图1以了解步骤2.7的具体操作方式。
  8. 用铝箔覆盖样品，并在室温下孵育30分钟。
  9. 取下带有软质硅胶的培养皿，将其正放（硅胶面朝上）。
  10. 用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗软质硅胶表面：向培养皿中加入2 mL PBS（pH 7.4），静置数分钟。吸除PBS后，再用2 mL PBS清洗一次。让硅胶继续固化约一天。为此，将软质硅胶样品置于37 °C的PBS中过夜。

3. 使用宽场荧光显微镜通过球形压痕法测量硅胶硬度

  1. 取出带有软硅胶的培养皿，并确保其中含有至少1 mL的PBS，使硅胶表面位于液面以下数毫米处。
  2. 使用尖头镊子，将五个直径为1 mm的氧化锆球形压痕器置于柔软的硅胶表面。将压痕器浸入液体介质中，并滴加在硅胶层边缘以外的位置，且各压痕器之间相距至少五个压痕器直径的距离。
    注意：由于液体介质的表面张力，当球体被投放至液面以上时，可能无法进入液体介质（漂浮）。
  3. 将带有软质硅胶的培养皿放置在显微镜载物台上，确保能够通过培养皿底部进行成像。
  4. 使用10倍物镜（如数值孔径为0.30的干式10倍物镜）进行相差成像，定位并聚焦球形压头。
  5. 拍摄压头部分或整体的相位图像，并保存该图像。如有条件，使用拼图扫描。若压头存在任何可见缺陷，应弃用并更换另一个压头。
  6. 在活细胞相差成像下，将视野向压痕器边缘的左侧平移，使图像帧的左边缘距离压痕器中心至少约1.5 R。确保压痕器中心仍可见于图像帧右侧，靠近右侧边缘。拍摄一张相差图像并保存。
  7. 将显微镜光源切换至红色荧光通道的照明。使用 x- 和 y-坐标保持不变（该 x-y 压痕探针中心位于框架内靠近右侧边缘的位置），向下聚焦（降低Z轴），直至球形压痕探针中心下方的红色荧光微珠刚好失焦。
  8. 以每个 z 轴步进为间隔采集一幅图像，形成 z 轴层扫图像序列 0.5 µm 直到硅胶上层远离压痕器（靠近成像视野左边缘）的微珠失焦为止。
  9. 用样品上的其他压头重复步骤 3.4 - 3.8。

4. 计算硅胶的刚度（杨氏模量）

  1. 使用 ImageJ 打开压头的相差图像，点击直线工具，以像素为单位测量压头的直径。在压头边缘上单击并按住一个点，将光标移动到边缘上正对的另一点，在释放光标前记录 ImageJ 主窗口状态栏中显示的像素长度。
    1. 通过点击 分析 | 设定比例尺 并检查长度单位，确保长度单位已设置为像素。
    2. 根据物镜放大倍数和 CCD 相机像素尺寸，将压头半径从像素转换为 μm（R（μm）= R（像素）× CCD 相机像素尺寸（μm）/ 物镜放大倍数）。
  2. 通过点击 文件 | 导入 | 图像序列 在 ImageJ 中打开微珠图像的红色通道 z 轴堆栈（如果微珠为红色荧光），选择堆栈中的任意一幅图像并点击 确定 以打开堆栈。
    注：F1 是指位于压头中心下方的微珠处于最佳聚焦状态时的帧编号，F2 是指距离微珠中心约 1.5 R 区域附近、靠近图像左侧边缘的微珠处于最佳聚焦状态时的帧编号。两帧之间的 z 方向差值即为压痕深度 δ。
    1. 在 ImageJ 中使用直线工具，在图像中一个轮廓清晰的微珠上画一条线。点击 分析 | 绘制剖面图，然后点击 实时 按钮，以便在切换不同帧时获得穿过微珠的实时线扫描强度图。选择最大强度值最高的帧作为最佳聚焦帧。
    2. 由于 z 轴堆栈中各帧之间的 z 步进为 0.5 μm，因此以 μm 为单位计算压痕深度：δ = (F2 - F1) × 0.5。
  3. 计算压头因其自身重量（减去相反方向的浮力）对凝胶施加的力，即压痕力 F，其值等于压头体积 ×（压头密度 - 液体介质密度）× 重力加速度。使用公式 F = (4/3) × 3.142 × (R3) × (ρindentor­ - ρmedium) × g，其中 R 为压头半径，ρindentor 为压头密度，ρmedium 为液体介质密度，g 为重力加速度（9.81 m/s2）。将等式右侧所有量均以国际单位制（SI）表示，以得到以 N 为单位的 F。
  4. 使用改进的11赫兹模型12公式计算硅胶的杨氏模量（E）：
    弹性模量公式，E = c*[3(1-v²)F]/4R⁰.⁵δ¹.⁵，用于压痕分析。
    其中：
    c = 修正因子，用于修正其后所跟的赫兹模型表达式；
    v = 硅胶凝胶的泊松比（对于不可压缩材料取值为 0.57）；
    F = 压痕力；
    R = 压头半径；以及
    δ = 压痕深度。
    将等式右侧所有量均以国际单位制（SI）表示，以得到以 Pa 为单位的 E。
    1. 按如下方式计算修正因子 c3：
      静力平衡方程；复杂公式；用于教学与科研
      其中：
      静力平衡分析中的 χ 方程；公式包含 R、δ、h；数学概念
      气动系数方程；公式：a = -(1.2876-1.4678v+1.3442v^2)/(1-v)。；以及
      材料力学中计算 \(b\) 的方程；b 为 v 的函数；包含数学公式。
      需注意，该修正因子仅适用于软硅胶良好粘附于其下方的培养皿（或硬硅胶）的情况（本实验即为此情况）。
    2. 根据所加硅胶的量和培养皿的直径计算软硅胶层的高度 h。或者，通过相差成像直接获取硅胶层顶面和底面的 z 坐标来确定 h（微小杂质在任一表面会变得清晰可见）。需注意，当 h 较大时（h2 > Rδ），修正因子 c 接近于 1。
  5. 对每个压头重复步骤 4.1 至 4.4。将每个压头测得的杨氏模量取平均值，得到该硅胶样品的平均杨氏模量。

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结果

根据上述详细方案，我们在35 mm培养皿中制备了软质硅胶，并在70 °C下固化30分钟，随后将荧光微球（及I型胶原）偶联至其表面顶部，如图1示意图所示。此前已有研究使用深紫外光（deep UV）实现蛋白质与基底的最终偶联13。需注意：（I）此处所用的固化条件专用于此种软质硅胶；（II）压痕测量在次日进行，因为软质硅胶在一天内会继续略微固化。

表征硅胶表面球形压痕的各种参数如图 2A所示。相位成像用于获取（I）压头的完整图像（如图 2B所示，必要时采用图像拼接）或（II）球体的部分图像。从压头图像中唯一需要提取的参数是其直径。例如，在本实验方案中使用1:1软硅胶时，同一批次的不同压头直径范围为950 µm至1,200 µm，平均值为1,037 µm，标准差为47 µm（共8个压头）。请注意，在计算由特定压头...

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讨论

尽管球形压痕法易于实施，但仍需仔细选择压头以及软硅胶样品的厚度。用于计算杨氏模量的方程仅在一组特定条件下成立11且这些条件通常在硅胶样品厚度满足时达成 > 压头半径的10% < 约为压头半径的13倍。我们发现，硅胶厚度为压头半径的5至10倍是一个较优选择，此时样品厚度不会过高（即，工作距离不会成为限制因素），且计算得到的刚度对硅胶厚度的确切值也不过于敏感。球形压头的选择应确保压痕深度δ满足 < 硅胶厚度的10%以及 < 压头半径的10%。基于上述考虑，可使用不同材质和直径的压头来测量较软或较硬硅胶的刚度。本方案中最关键的步骤是确定压痕深度。本方案建议采用的方法是识别合焦图像，以可靠地确定压痕深度。还应注意，球形压痕法所用的刚度计算基于赫兹理论，该理论假设为无摩擦接触。在此，对于表面粗糙度较低的压头，这一假设是合理的。尽管我们使用了一种特定的软质硅胶弹性体（见配套材料清单中的产品） 特定试剂一览表），也可使用其他商用硅胶弹性体试剂盒。需注意，常用于微加工的硬质硅胶并不适合制备刚度在千帕（kPa）范围的基底。然...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Margaret Gardel慷慨允许使用流变仪。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）（1R15GM116082）的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CY 52-276 A/B 硅酮弹性体试剂盒 Dow CorningCY 52-276室温保存
Thermo Scientific Pierce EDCFisher ScientificPI22980于 -20°C 保存
Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS 交联剂Fisher ScientificPI-24510于 4°C 保存
羧基荧光粉红色颗粒，0.4–0.6 µm，2 mLSpherotech, Inc.CFP-0558-2于 4°C 保存，切勿冷冻
1.0 mm 酸洗氧化锆珠OPS Diagnostics LLCBAWZ 1000-250-33
深紫外臭氧清洗腔Novascan Technologies, Inc.PSD-UV4, OES-1000D
宽场荧光显微镜Leica MicrosystemsDMi8
Ⅰ型胶原蛋白，来自大鼠尾腱Corning354236储存浓度 = 4 mg/mL；于 4°C 保存
ImageJ-NIHN/AN/A公共领域软件

参考文献

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