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方法文章

一种批量进行的酵母双杂交筛选方法用于比较蛋白质相互作用

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DOI：

10.3791/57801

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2018年6月6日

 ,  , 
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

本文内容

摘要

批量处理酵母双杂交筛选可实现多种诱饵蛋白与高度复杂的猎物融合蛋白集合之间相互作用谱的直接比较。本文介绍了优化的方法、新试剂及其在此类筛选中的应用方式。

摘要

利用酵母双杂交实验筛选蛋白质-蛋白质相互作用长期以来一直是一种有效的工具，但其应用在很大程度上局限于发现那些在相互作用候选文库中高度富集的高亲和力互作蛋白。在传统模式下，当在低严谨性条件下进行酵母双杂交实验时，可能会发现低亲和力的互作蛋白，但产生的菌落数量过多而难以分析。此外，若未针对不同的诱饵质粒对同一文库进行全面且完整的检测，则无法实现比较分析。尽管使用阵列化的猎物质粒文库可在一定程度上解决其中一些问题，但运行此类筛选所需的费用和基础设施可能过于昂贵。作为替代方案，我们对酵母双杂交实验进行了改进，采用一种称为DEEPN（动态富集用于蛋白质网络评估）的策略，在单次筛选中同时揭示数十种瞬时和稳定的蛋白质相互作用，该方法结合高通量DNA测序与计算分析，追踪编码相互作用伙伴的质粒群体的演化过程。本文中，我们描述了定制化的试剂和实验方案，可实现DEEPN筛选的简便且经济高效的执行。

引言

要全面理解细胞生物学过程，关键在于揭示其分子机制所依赖的蛋白质相互作用网络。鉴定蛋白质相互作用的一种方法是酵母双杂交（Y2H）实验，该方法通过目标蛋白结构域相互结合后组装成有功能的嵌合转录因子来实现检测1。典型的Y2H筛选是通过构建一群酵母细胞来完成，这些细胞同时含有编码相互作用蛋白与转录激活域融合的质粒文库（例如，“猎物”融合蛋白），以及一个给定的“诱饵”质粒，该质粒包含目标蛋白与DNA结合域的融合（例如，Gal4 DNA结合域，可结合Gal4上游激活序列）。Y2H方法的主要优势之一是，在具备常规分子生物学实验条件的典型实验室中，该实验相对容易且成本较低2。然而，在传统操作中，研究人员需对筛选出的阳性Y2H相互作用的单个菌落进行取样分析，这极大地限制了可检测的文库“猎物”克隆数量。当某一特定相互作用的猎物丰度远高于其他猎物时，该问题尤为突出，从而降低了检测低丰度猎物质粒相互作用的可能性。

利用酵母双杂交（Y2H）原理实现对蛋白质组全面覆盖的一种解决方案是采用矩阵式方法，即通过数字方式检测含有已知单个猎物质粒的阵列。然而，这种方法需要特定的基础设施，对于希望鉴定少数蛋白质或结构域相互作用组的独立研究人员而言，往往难以获得且成本高昂3。此外，若猎物文库极为复杂，可能编码多个相互作用蛋白的片段，这将使矩阵阵列的规模扩大到不切实际的程度。另一种替代方案是批量使用复杂文库进行实验，并通过大规模并行高通量测序来评估相互作用克隆的存在情况4。该方法可用于检测在多个菌落中出现的猎物质粒，其基于典型的Y2H实验格式，允许携带相互作用融合蛋白对的酵母细胞在平板上生长5,6。这一总体思路可进一步强化，以同时提高对多个诱饵和猎物组分的检测能力7,8。

然而，许多研究仅需针对少数几种蛋白质“诱饵”进行更简便且更集中的分析，通过全面且半定量地查询单一复杂猎物文库，可获得更大收益。我们开发并验证了一种基于酵母双杂交（Y2H）原理的批量操作方法，用于开展大规模蛋白质相互作用研究4。该方法利用特定猎物质粒扩增速率作为Y2H相互作用相对强度的替代指标9。对处于正常生长或选择性生长条件下的群体中所有质粒进行深度测序，可获得产生强或弱Y2H相互作用克隆的完整图谱。由此可获取相互作用蛋白的谱系，并在多个诱饵质粒之间进行直接比较。该工作流程被称为DEEPN（动态富集用于蛋白质网络评估），可用于从相同猎物文库中鉴定差异相互作用组，从而实现一种蛋白质与另一种蛋白质之间的比较分析。

本文中，我们演示了 DEEPN 技术，并介绍了可促进其应用的实验方法改进，这些改进如图1所示。主要改进包括：

猎物质粒酵母文库的构建。 DEEPN 的关键要求之一是构建含有不同诱饵质粒的酵母群体，且这些群体需具有相同的猎物质粒文库分布。为了在不同诱饵的相互作用组之间进行准确比较，必须确保猎物质粒文库具有等效的基础群体。当文库质粒已存在于单倍体酵母群体中，并通过交配将特定诱饵质粒导入该群体以形成二倍体时，最有利于实现这一目标。在此，我们提供了使用商业化的单倍体酵母文库构建此类群体的详细操作指南。尽管我们发现某些方法可产生大量二倍体，但这些含商业化文库的酵母菌株整体交配效率较低。因此，我们构建了一种新型菌株，该菌株可承载猎物质粒文库，并在每次交配反应中产生远更高数量的二倍体。

新的诱饵质粒组合许多当前用于表达“诱饵”融合蛋白的质粒，其融合蛋白由目标蛋白与DNA结合域组成 2µ基于此，它们能够扩增自身的拷贝数。该拷贝数在群体中可能具有较大变异性，从而导致酵母双杂交转录响应的差异。这反过来可能影响根据细胞在选择性条件下的生长反应来评估特定蛋白质相互作用强度的准确性。部分可通过使用低拷贝质粒来缓解这一问题，其中一些已有文献报道，例如 commercially available pDEST3210我们构建了一种新的诱饵质粒（pTEF-GBD），可在其中表达Gal4-DNA结合结构域融合蛋白 TRP1 基于着丝粒的低拷贝质粒，携带Kanr抗性基因，同时允许将诱饵片段克隆至Gal4 DNA结合域的上游和下游。

新型高密度 Y2H 片段文库。我们构建了一种新的质粒用于承载 Y2H 捕食者文库，并利用该质粒构建了一个高度复杂的 Y2H 文库，该文库由酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）基因组 DNA 的随机剪切片段组成。序列分析显示，该文库包含超过 100 万个不同的元件，其复杂性远高于此前报道的酵母基因组 Y2H 质粒文库11。利用这一新文库，我们证实 DEEPN 工作流程具有足够的稳健性，能够以可靠且可重复的方式容纳包含大量不同质粒的复杂文库。

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方案

1. 培养基与平板的制备

注意：所有平板至少需要在开始实验方案前两天制备。培养基可在任意时间配制，但缓冲型酵母提取物蛋白胨葡萄糖腺嘌呤培养基（bYPDA）必须在使用当天配制。某些培养基使用含有较高浓度腺嘌呤的补充混合物配制。大多数最小培养基补充剂中腺嘌呤的浓度为 10 mg/L。标注为 '+40Ade' 的补充剂则表示腺嘌呤总浓度为 40 mg/L。

  1. 配制葡萄糖溶液（50% w/v）。配制 1 L：在 1,000 mL 烧杯中，将 500 g D-(+)-葡萄糖溶解于 800 mL 蒸馏水中。用刻度量筒定容至 1,000 mL，并通过 0.2 µm 无菌滤膜过滤至无菌的 1,000 mL 培养基储存瓶中。
  2. 配制酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）平板。配制 1 L：在 1,000 mL 烧杯中，将 20 g 蛋白胨和 10 g 酵母提取物溶解于 800 mL 蒸馏水中。倒入刻度量筒，加蒸馏水至 960 mL。转移至 2,000 mL 三角烧瓶，加入 15 g 琼脂。高压灭菌后，置于 37 °C 水浴中冷却，待水浴温度降至约 42–50 °C 时，用移液器加入 40 mL 50% 葡萄糖溶液，轻轻旋转混匀。
    1. 用移液器将 20 mL 培养基分装至一系列 100 mm 培养皿中。
  3. 配制完全合成基本培养基（CSM）-Trp 平板。配制 1 L：在 1,000 mL 烧杯中，将 6.7 g 无氨基酸酵母氮源基础溶解于 800 mL 蒸馏水中。倒入刻度量筒，加蒸馏水至 960 mL。转移至 2,000 mL 三角烧瓶，加入 0.7 g -Trp -Met 缺陷型混合物、20 mg 甲硫氨酸和 15 g 琼脂。高压灭菌后，置于 37 °C 水浴中冷却，待水浴温度降至约 42–50 °C 时，用移液器加入 40 mL 50% 葡萄糖溶液，轻轻旋转混匀。
    1. 用移液器将 20 mL 培养基分装至一系列 100 mm 培养皿中。
  4. 配制 CSM-Leu-Met 平板。配制 1 L：在 1,000 mL 烧杯中，将 10.05 g 无氨基酸酵母氮源基础溶解于 800 mL 蒸馏水中。倒入刻度量筒，加蒸馏水至 940 mL。转移至 2,000 mL 三角烧瓶，加入 1.005 g -Leu -Met 缺陷型混合物和 15 g 琼脂。高压灭菌后，置于 37 °C 水浴中冷却，待水浴温度降至约 42–50 °C 时，用移液器加入 60 mL 50% 葡萄糖溶液，轻轻旋转混匀。
    1. 用移液器将 20 mL 培养基分装至一系列 100 mm 培养皿中。
  5. 配制 CSM-Leu-Trp 平板。配制 1 L：在 1,000 mL 烧杯中，将 10.05 g 无氨基酸酵母氮源基础溶解于 800 mL 蒸馏水中。倒入刻度量筒，加蒸馏水至 940 mL。转移至 2,000 mL 三角烧瓶，加入 1.005 g -Trp -Leu+40Ade 缺陷型混合物、240 mg 腺嘌呤和 15 g 琼脂。高压灭菌后，置于 37 °C 水浴中冷却，待水浴温度降至约 42–50 °C 时，用移液器加入 60 mL 50% 葡萄糖溶液，轻轻旋转混匀。
    1. 用移液器将 20 mL 培养基分装至一系列 100 mm 培养皿中。
  6. 配制 CSM-Leu-Trp-His 平板。配制 1 L：在 1,000 mL 烧杯中，将 10.05 g 无氨基酸酵母氮源基础溶解于 800 mL 蒸馏水中。倒入刻度量筒，加蒸馏水至 940 mL。转移至 2,000 mL 三角烧瓶，加入 0.975 g -Trp -Leu-His+40Ade 缺陷型混合物、240 mg 腺嘌呤和 15 g 琼脂。高压灭菌后，置于 37 °C 水浴中冷却，待水浴温度降至约 42–50 °C 时，用移液器加入 60 mL 50% 葡萄糖溶液，轻轻旋转混匀。
    1. 用移液器将 20 mL 培养基分装至一系列 100 mm 培养皿中。
  7. 配制 CSM-Leu-Trp-His-3AT 平板。配制 1 L：在 1,000 mL 烧杯中，将 10.05 g 无氨基酸酵母氮源基础溶解于 800 mL 蒸馏水中。倒入刻度量筒，加蒸馏水至 940 mL。转移至 2,000 mL 三角烧瓶，加入 0.975 g -Trp -Leu-His+40Ade 缺陷型混合物、240 mg 腺嘌呤和 15 g 琼脂。高压灭菌后，置于 37 °C 水浴中冷却，待水浴温度降至约 42–50 °C 时，用移液器加入 60 mL 50% 葡萄糖溶液，再加入 100 µL 1 M 无菌 3-氨基-1,2,4-三唑（3AT）储备液，轻轻旋转混匀。
    1. 用移液器将 20 mL 培养基分装至一系列 100 mm 培养皿中。
  8. 配制 LB-Kanr 平板。配制 1 L：在 1,000 mL 烧杯中，将 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物和 10 g NaCl 溶解于 800 mL 蒸馏水中。倒入刻度量筒，加蒸馏水至 1,000 mL。转移至 2,000 mL 三角烧瓶，加入 15 g 琼脂。高压灭菌后，置于 37 °C 水浴中冷却，待水浴温度降至约 42–50 °C 时，加入 50 mg 卡那霉素，轻轻旋转混匀。
    1. 用移液器将 20 mL 培养基分装至一系列 100 mm 培养皿中。
  9. 配制 YPD、CSM-Leu-Met、CSM-Trp、CSM-Leu-Trp 和 CSM-Leu-Trp-His 液体培养基。采用上述平板配制方法，但将培养基倒入培养基储存瓶而非三角烧瓶，并省略琼脂。
  10. 配制 bYPDA（缓冲 YPDA）。取无菌 YPD 培养基，加入 200 mg/L 腺嘌呤的无菌蒸馏水溶液。用 HCl 调节 pH 至 3.7，通过 0.2 µm 无菌滤膜过滤至无菌瓶中。
  11. 配制转化缓冲液：2 M 山梨醇、1 M 二水合乙酸锂、10 mM Tris（pH 7.6）、0.5 mM EDTA、0.2 mM 氯化钙，溶于蒸馏水中。通过 0.2 µm 无菌滤膜过滤至无菌瓶中。
  12. 配制 PEG 溶液：70% w/v 聚乙二醇 3350 溶于蒸馏水中。高压灭菌灭菌。
  13. 配制 Twirl 溶液：8 M 尿素、4% w/v SDS、50 mM Tris（pH 6.8）、10% v/v 甘油、0.02% w/v 溴酚蓝，溶于无菌蒸馏水中。
  14. 配制 sTE（强 TE）：50 mM Tris、20 mM EDTA（pH 8.0），溶于蒸馏水中。通过 0.2 µm 无菌滤膜过滤至无菌瓶中。
  15. 配制 Zymolase 储备液：10 mg/mL Zymolase 100T 溶于 50 mM 磷酸氢二钾缓冲液（pH 7.5）中，含 50% v/v 甘油，溶于无菌蒸馏水中（-20 °C 保存）。

2. 钓饵质粒的克隆与验证

注意：Gal4-DNA结合域质粒的构建。目前有多种市售或学术界可获得的酵母双杂交（Y2H）系统。DEEPN 能够兼容其中许多系统，前提是表达目标蛋白与DNA结合域融合的诱饵质粒需位于含有 TRP1 的质粒中。其他下游要求包括：猎物质粒插入片段上游的序列必须已知，且可通过His3蛋白的表达来判断阳性Y2H相互作用，从而实现缺乏组氨酸培养基中的筛选。本文将描述一种新型Y2H诱饵质粒（pTEF-GBD，图2）的使用方法，但其他Y2H诱饵质粒（如pGBKT7）也可适用。在诱饵质粒的构建与评估中，我们将以pTEF-GBD为例进行说明。一般建议采用基因合成方法，获得符合酵母密码子偏好的开放阅读框，以确保良好的表达并简化克隆操作。需确保克隆方案使诱饵序列与Gal4 DNA结合域保持正确的阅读框，并在克隆至3'位点时，在诱饵编码区之后包含终止密码子。

  1. 准备质粒载体。质粒pTEF-GBD可通过快速组装方法，将编码目标蛋白的片段克隆至编码Gal4 DNA结合域区域的5'端或3'端。若需插入5'位点，进行酶切消化 3 µg 使用 NarI 和 EcoRI 对 pTEF-GBD 进行消化以用于插入 5' 位点，或使用 BamHI 和 XhoI 消化以用于插入 3' 位点 2 - 4 小时。在含有 0.2 - 0.5 µg/mL 溴化乙锭（EtBr）中以100 V电压电泳。切下5,630 bp的TEF-GBD条带，使用DNA凝胶回收试剂盒按照制造商说明书进行纯化，并通过分光光度计在260 nm处测定吸光度以定量DNA12.
    注意：编码诱饵的插入片段的制备。可通过基因合成方法制备编码目标蛋白质或蛋白质片段的DNA片段，并以未克隆片段形式提供。建议对密码子进行优化，以利于在 酿酒酵母 以及材料列表中包含用于密码子优化的在线工具。
  2. 对于5'端插入，分别使用5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3'和5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3'对编码ATG起始密码子的DNA片段进行侧翼包围。对于与Gal4 DNA结合域保持阅读框一致的3'端插入，使用5'-ctgcatatggccatggaggccgaa-3'和5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3'对编码片段进行侧翼包围。
  3. 对于质粒构建，采用制造商指定的快速组装方法，将片段克隆至经切割的 pTEF-GBD 载体中。
    1. 接种所有转化后的菌液 E. coli onto LB-Kanr 平板并孵育 16 小时 - 20 小时在 37 °C含有带目的插入片段的pTEF-GBD质粒的菌落可通过PCR扩增进行鉴定，所用引物如下：用于5'端插入片段的引物为5'- CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG -3'和5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3'，用于3'端插入片段的引物为5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3'和5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3'。这些寡核苷酸也可作为插入片段测序的引物。
    2. 计划准备 >10 µg 每种pTEF-GBD衍生物及单独的pTEF-GBD，以提供用于测序和酵母转化的材料。
    3. 使用以下 PCR 条件：3 分钟，94 °C 98 °C，随后进行25个循环，每个循环包括30秒的95 °C变性步骤 98 °C，30 秒 55 °C，以及2分钟 72 °C，随后在5分钟内 72 °C 使用含有 2.5 mM MgCl 的缓冲液2，0.5 U/100 µL DNA聚合酶和专用缓冲液。

3. Gal4-DNA结合域融合蛋白的表达

  1. 制备感受态酵母。
    1. 将无菌木制涂布棒置于PJ69-4A酵母菌种上，刮取约1 mm的菌体，在YPD平板上划线接种3 的 -80 °C 冻存菌种并在YPD平板上轻轻划线。移动木制接种棒，使每次划线都经过培养基表面未接触过的区域。将YPD平板置于 30 °C 2 天或直至单菌落可见。通过将 PJ69-4A 酵母悬浮于水或生长培养基中，加入 DMSO 至终浓度 7%，并于 -80 °C 冻存，制备酵母冻存菌种。80 °C.
    2. 用无菌木签挑取单菌落，接种于20 mm × 150 mm培养管中的5 mL YPD培养基中，30 °C过夜培养 30 °C 在200 rpm的摇床培养箱中。
    3. 在250 mL无菌锥形瓶中加入50 mL YPD培养基，并接种4 mL PJ69-4A酵母菌株的过夜培养物。置于摇床培养箱中振荡培养，温度为 30 °C，200 rpm，至光密度（OD600约为 1.2，通过标准 1 cm 光程的分光光度法测定。通常培养需要 5 - 7 小时。
    4. 在台式离心机中，将酵母于50 mL锥形管内以4,696 × g离心5 min（室温）进行沉淀。将上清液倾入液体废物容器中弃去。用移液器将沉淀重悬于5 mL转化缓冲液中，并转移至15 mL锥形管。再次离心沉淀以弃去上清液，然后将酵母重悬于1 mL终体积的转化缓冲液中。 1000 µL 移液器
    5. 将酵母细胞在30°C下孵育60分钟 30 °C 在200 rpm振荡条件下孵育，随后置于冰上30 - 90分钟。
  2. 酵母质粒转化。
    1. 在1.5 mL无菌微量离心管中，加入 1 µg 基于 pTEF-GBD 的质粒 5 µL 10 mg/mL 鲑鱼精子载体DNA溶液。同时设置一个仅含鲑鱼精子载体DNA的试管作为阴性转化对照。加入 100 µL 用移液器向每根试管中加入冰冷的酵母细胞悬液。添加 100 µL 70% PEG 溶液的 1000 µL 用移液器轻轻吹打混匀， flick 轻弹管壁 5 - 10 次（切勿涡旋振荡）。
    2. 孵育于 30 °C在200 rpm摇床培养箱中振荡孵育45分钟。
    3. 热激处理 42 °C 15 分钟
    4. 在室温下以 845 x g 离心 3 分钟，用移液器吸除并弃去上清液，将沉淀重悬于 150 µL 用移液器反复吹打使无菌水混匀，并涂布于CSM-Trp平板表面。
    5. 将平板正面朝上放置 30 °C 培养箱中孵育2-3天，直至菌落可见。孵育后，可将平板倒置以避免表面产生冷凝水 30 °C 6 - 12 小时。
    6. 每次转化取 2 - 3 个菌落，用无菌牙签将其点种于 CSM-Trp 平板上，30 ℃ 培养 24 小时 °C.
  3. 制备蛋白表达用裂解液。
    1. 用火柴头大小的酵母菌体接种至3 mL CSM-Trp液体培养基中，于30°C培养过夜 30 °C 在20 mm × 150 mm的培养管中，于200 rpm振荡条件下培养。每种诱饵以及空pTEF-GBD载体各制备两份过夜培养物。
    2. 向每3 mL CSM-Trp过夜培养物中加入1 mL YPD，于30°C在摇床中以200 rpm振荡培养1 h。 30 °C，同时以 200 rpm 振荡。使用分光光度计检测细胞的 OD 值。
    3. 离心收集等量细胞，根据OD值进行归一化。使用无菌的1.5 mL微量离心管，在微量离心机中室温下以2,348 × g离心5分钟。用移液器弃去上清液。最终菌体沉淀对应OD值不低于2.1。
      注意：在计算等量细胞数时，可能需要从各 Overnight 培养物中取不同体积，以达到最低 2.1 OD。
    4. 将沉淀重悬于 450 µL 用移液器反复吹打，加入0.2 M NaOH。室温孵育5分钟。在室温下以2,348 × g离心2分钟，用移液器弃去上清液。
    5. 用 50 µL 轻轻吹打以重悬 TWIRL 缓冲液，注意避免产生气泡。将样品在 5 分钟内加热至 70 °C.
  4. 通过SDS-PAGE检测蛋白质表达情况。
    1. 使用4 - 20%的梯度凝胶，以确保能够分辨较宽范围的分子量。将等量（相同OD值）的样品上样至SDS-PAGE凝胶中，并确保至少包含一个含有未修饰pTEF-GBD载体的样品。13,14,15.
    2. 电泳分离后，将凝胶转移至硝酸纤维素膜，使用抗-myc 单克隆或多克隆抗体及 ECL 检测液进行免疫印迹图3).

4. 自激活测试

  1. 使用无菌木制涂布棒从对应于含有目标猎物文库菌株的 -80 °C 甘油菌中蘸取少量酵母，在 YPD 平板上划线。将 YPD 平板在 30 °C 下培养 2 天，直至可见单菌落。挑取数个单菌落转接到新的 YPD 平板上，30 °C 过夜培养。
    注：本研究中用于承载猎物文库的新菌株为 PLY5725，而一些 commercially available Y2H 文库则构建于 Y187 菌株中。
  2. 按照 3.3.1 - 3.3.4 的步骤，将基于 LEU2 的质粒转化至 PLY5725 菌株中，该质粒用于承载目标猎物文库。本研究中构建的文库所对应的质粒为 pGal4AD（pPL6343）。为回收酵母转化子，将转化产物涂布于 CSM-Leu-Met 平板。待菌落出现后，以菌块形式转接到 CSM-Leu-Met 平板，并在 30 °C 培养 24 小时。
  3. 按照 3.4 节的方案，使用抗 HA 单克隆或多克隆抗体及 ECL 检测液，验证 pPL6343 空载体的蛋白表达。
  4. 将已转化的 PJ69-4A 酵母与经 3.4 和 4.3 节方案验证可表达蛋白的 PLY5725 构建体在 YPD 平板上以十字交叉方式划线，30 °C 过夜培养。取两种菌株交界处约 1 mm3 的菌体，分别转接到 CSM-Leu-Met、CSM-Trp 和 CSM-Trp-Leu 平板上，培养 24 小时。
    注：目标二倍体菌株将在 CSM-Trp-Leu 平板上生长。在 CSM-Leu-Met 和 CSM-Trp 平板上的生长情况用作酵母生长的阳性对照。
  5. 将二倍体菌株在 1 mL CSM-Trp-Leu 培养基中于 30 °C 过夜培养。取 500 µL 菌液，于 1.5 mL 微量离心管中以 2,348 × g 离心 3 分钟（室温）沉淀细胞。用移液枪吸弃上清。将细胞重悬于 1 mL 无菌水中，重复离心与重悬一次。测定细胞的 OD600 值。
  6. 以无菌水对每种细胞悬液进行 1:10 系列稀释，起始浓度为 OD 0.5。分别取 5 µL 各稀释液点样于 CSM-Leu-Trp 平板、CSM-Leu-Trp-His 平板和 CSM-Leu-Trp-His+3AT 平板。30 °C 培养，并在 3 天内每日观察生长情况（图 4）。
    注：进行 1:10 系列稀释时，将 10 µL OD 为 0.5 的菌液加入 90 µL 水中，通过反复吸打混匀。继续进行 1:10 稀释，共制备六种不同浓度用于点样。

5. 创建含有诱饵和猎物文库的酵母群体

注意：含有商业猎物文库质粒的 Y187 菌株交配效率较低，因此需要以下优化条件以维持文库的复杂性。含有 Y2H 猎物文库的 PLY5725 菌株交配性能更佳，可采用相同的交配程序进行操作（图 5）。

  1. 在培养管中，将携带不同含TRP1的pTEF-GBD诱饵质粒的PJ69-4A转化子分别接种于3 mL CSM-Trp培养基中。另设两份独立的培养物，仅含pTEF-GBD空载体质粒，作为操作对照。 于30 °C、200 rpm条件下培养6小时，随后转接至含25 mL培养基的无菌锥形瓶中过夜培养。
  2. 室温下解冻一支保存于-80 °C的含LEU2标记“猎物”文库的MATα细胞冻存管。将整支解冻后的细胞加入含125 mL CSM-Leu-Met培养基的无菌锥形瓶中。所有培养物均于30 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。
    注：过夜培养物的OD600值需在1.0至1.5之间，方可进行后续步骤。
  3. 取等量21 OD的各PJ69-4A转化子培养物，在室温下以4,696 × g离心5分钟。每需进行10次交配反应，另取携带文库质粒的MATα菌株39 OD600等量细胞，分别置于50 mL锥形管中离心。
    1. 用10 mL无菌水重悬细胞，并转移至新的50 mL锥形管中，在台式离心机中以4,696 × g、室温离心5分钟。使用移液器小心吸除上清液，避免扰动沉淀细胞。
    2. 将PJ69-4A细胞沉淀重悬于4 mL bYPDA（pH 3.7）中，PLY5725细胞沉淀重悬于10 mL bYPDA（pH 3.7）中。
  4. 进行交配反应时，向新的50 mL锥形管中加入1 mL PJ69-4A转化细胞、1 mL含文库的MATα细胞及1 mL pH 3.7的bYPDA。于30 °C下以轻柔振荡（100–130 rpm）培养90分钟。
    1. 在台式离心机中以4,696 × g、室温离心5分钟，用移液器吸除上清液，将沉淀重悬于2 mL 1:1比例的bYPDA:YPD混合液中。用移液器将全部2 mL悬液接种至一个100 mm YPD平板上，于30 °C培养约20 小时。
  5. 使用细胞刮刀从YPD平板上收集细胞，将其刮入2–3 mL CSM-Leu-Trp培养基中。用移液器将脱落的细胞转移至50 mL锥形管中。使用1000 µL移液器，以2–3 mL CSM-Leu-Trp培养基冲洗平板4–5次，将培养基反复吹打于YPD平板表面并轻轻排出。
    1. 在台式离心机中以4,696 × g、室温离心5分钟，用移液器弃去上清液，通过反复吹打将细胞重悬于40 mL CSM-Leu-Trp培养基中（切勿涡旋振荡）。
  6. 为估算形成的二倍体细胞数量，取4 µL二倍体混合液分别加入200 µL和2000 µL CSM-Trp-Leu培养基中进行稀释。将每种稀释液各取200 µL涂布于CSM-Leu-Trp平板上。
    注：这两个平板分别代表收获的二倍体原液的1:10,000和1:100,000稀释倍数。在30 °C培养36–40小时后，预期1:10,000稀释平板上形成约9,000–27,000个菌落。请在步骤5.7后检查平板，1:10,000稀释平板上至少需有200个菌落方可进入步骤5.8。
  7. 立即将剩余的每份40 mL细胞悬液转移，接种至含500 mL CSM-Leu-Trp培养基的1,000 mL锥形瓶中。测定初始OD600值。将锥形瓶于30 °C、180 rpm振荡培养至饱和（约2.0 OD/mL），通常需要36–40小时。在24小时和36小时时通过OD600监测生长情况。
  8. 用移液器从各500 mL饱和培养物中取出20 mL分装，分别接种至两个2,000 mL锥形瓶中：一个含750 mL CSM-Leu-Trp培养基，另一个含750 mL CSM-Leu-Trp-His培养基（其中3AT浓度为可消除背景的最低浓度，该浓度已在第4.5节中预先确定）。通过轻轻旋转充分混匀新培养物（770 mL），并测定初始OD600值。
  9. 将培养物于30 °C、180 rpm振荡培养至饱和，未选择的CSM-Leu-Trp培养物通常在24小时内达到饱和，而受Y2H相互作用选择压力的培养物可能需要超过70小时。
  10. 当培养物达到饱和（OD ~2.0）后，用移液器取出11 mL，于室温下以4,696 × g离心5分钟沉淀细胞，用移液器弃去上清液，样品可于-20 °C冷冻保存，或直接进行DNA提取。所获得的选择性与非选择性样品均将用于深度测序。

6. DEEPN 深度测序的样品制备

  1. DNA 提取。
    1. 使用移液器将第 5.7 节实验步骤中的细胞沉淀重悬于 500 µL sTE 缓冲液中，并转移至 1.5 mL 微量离心管中。加入 3 µL 巯基乙醇和 10 µL Zymolase 储液。充分混匀后，在 37 °C 培养箱中孵育 24–36 小时。
    2. 使用分液漏斗在通风橱中用 500 µL 酚/氯仿/异戊醇对样品进行两次抽提16。
    3. 加入 7 µL 4 M NaCl 和 900 µL 冰冷的 100% 乙醇（ETOH），通过倒置混匀，随后在 –20 °C 冷冻，或在微量离心机中于室温下以 21,130 × g 离心 10 分钟以沉淀 DNA。
    4. 用移液器弃去上清液。用 900 µL 70% 乙醇洗涤沉淀三次。
    5. 以 21,130 × g 离心 2 分钟沉淀沉淀物，并用移液器去除残留的乙醇洗涤液。在 42 °C 下干燥沉淀 7 分钟。
    6. 将沉淀物在 37 °C 水浴中用 120 µL 0.1x sTE 重悬 90 分钟，每 30 分钟轻弹管壁混匀一次。
    7. 将 60 µL 提取的 DNA 转移至无菌的 1.5 mL 微量离心管中。加入 120 µL sTE 和 3.5 µL RNase A 储液，轻弹混匀后于 37 °C 孵育 1 小时。
    8. 按第 6.1.3–6.1.5 节所述进行乙醇沉淀，但使用 7 µL 5 M 醋酸铵代替 4 M NaCl。
    9. 将经 RNase A 处理的 DNA 在 37 °C 水浴中用 55 µL 0.1x sTE 重悬 90 分钟，每 30 分钟轻弹管壁混匀一次。 使用分光光度计在 260 nm 处测定吸光度以定量 DNA。
  2. PCR 扩增 cDNA 插入片段。
    1. 对每个 DNA 样品进行两组 50 µL 的 PCR 反应。每组反应包含 25 pmol 的正向引物和反向引物（与猎物文库质粒匹配，参见材料部分）。反应体系还包括 25 µL 高保真 2x PCR 预混液、5 µg DNA 样品，并加水至总体积 50 µL。扩增程序为 25 个循环，每个循环包括在 72 °C 延伸 3 分钟、55 °C 退火 30 秒、98 °C 变性 10 秒。循环前在 98 °C 预变性 30 秒，循环结束后在 72 °C 延伸 5 分钟。
    2. 取每组 PCR 反应产物 4 µL，通过含 0.2–0.5 µg/mL 溴化乙锭（EtBr）的 1% DNA 琼脂糖凝胶电泳进行分析17。通过紫外透射成像观察 DNA 样品。样品将显示约 1–3 kb 范围内的 DNA 弥散条带，而在发生 Y2H 相互作用的样品中可观察到特定的条带模式（图 6）。
    3. 合并重复的 PCR 样品，按照制造商说明书使用 PCR 纯化试剂盒进行纯化，并使用分光光度计在 260 nm 处测定吸光度以定量 DNA。

7. 深度测序

注意：样品制备以及在深度测序平台上的测序通常可在商业或学术机构的DNA测序核心设施中完成。

  1. 使用高性能超声波破碎仪对600 ng PCR产物进行剪切，得到平均长度约为300 bp的片段。
  2. 使用深度测序文库制备试剂盒，将编码条形码、引物结合位点和捕获序列的接头以不对称方式连接至DNA片段两端，从而构建带索引的测序文库。
  3. 按照制造商说明书进行文库制备。将带有索引的文库合并，并在深度测序平台上进行长片段双端测序（例如， 2 × 150 bp 双端测序读长）。每个样本的目标读数应在 1000 万至 4000 万之间，对于通常复杂度较高的未选择文库，建议获得更多的读数。我们建议未选择文库至少获得 2000 万或更多的读数。

8. 生物信息学处理与验证

  1. 以 fastq 格式处理 DNA 测序数据，使用一组独立的软件程序，用于（1）将序列读取文件以通用 SAM 格式进行比对 (2）量化不同数据集之间的基因富集程度 (3）对数据进行统计学分析，以确定哪些候选基因在酵母双杂交（Y2H）相互作用中呈阳性 (4）提供产生阳性Y2H相互作用的每个猎物cDNA基因片段所包含的区域及翻译阅读框信息；（5）提供工具以重建相互作用片段的5'端和3'端，从而可在传统Y2H体系中对其进行重建与验证。这些程序的操作详见配套研究。

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结果

Y2H 检测已广泛用于发现蛋白质：蛋白质相互作用，且已开发出多种改进方法和系统。在很大程度上，那些有助于先前方法取得成功的关键因素，对于 DEEPN 同样重要。其中一些关键指标包括：确保 DNA 结合结构域融合蛋白的表达；确保在含有目标诱饵和空载体猎物质粒的二倍体中，非特异性 His+ 生长背景信号较低；含有诱饵的 MATA 酵母与含有文库的 MATalpha 酵母具有高效的交配效率；最后，采用低严谨性筛选条件，使群体能够在选择多种阳性 Y2H 反应的条件下生长，即使这些反应产生的 His3 活性水平较低、Y2H 转录响应较弱也能被检出。

DEEPN 的一个关键方面是可重复地将 Y2H 文库导入含有不同诱饵质粒的菌株中，并可靠地筛选出能够产生阳性 Y2H 相互作用的文库质粒群体。当 Y2H 文库的复杂性增加时，这一过程变得更加困难，因为更难确保在整个不同起始群体之间充分转移完整的文库。此外，为选择条件下的生长所选取的群体规模以及测序深度必须足够大，以便...

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讨论

本文提供了使用优化方法批量进行酵母双杂交（Y2H）实验的操作指南。该实验流程中有若干关键步骤，有助于确保用于筛选的酵母群体能够代表起始文库，并使用足够数量的起始酵母群体进行筛选，以减少变异性。重要的是，这些基准在对传统Y2H实验的方法和材料进行调整时相对容易实现，因此大多数具备常规分子生物学实验条件的实验室均可采用该方法。DEEPN技术允许在使用不同诱饵质粒的同时，从相同的猎物文库群体中进行筛选，因此可直接比较与不同诱饵产生Y2H相互作用的候选互作分子。由于采用了深度测序技术，可以验证每种诱饵特异性酵母群体的起始文库组成，并独立追踪文库中每个候选猎物基因的富集情况。批量处理可实现对同一文库与不同诱饵的半定量检测，从而能够计算出统计学排序4。

本方案中有多个步骤对成功至关重要。其一是必须获得大量二倍体细胞，以确保酵母双杂交（Y2H）猎物文库得到充分代表，并与每种目标诱饵质粒充分混合。本文所述的接合（mating）程序已通过优化多个参数而改进。我们发现，某些承载商业化Y2H文库的菌株通常接合效率较低，但采用此处描述的接合方法可产生 2 ×...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

感谢人类遗传学研究所工作人员在下一代测序文库制备与测序方面提供的支持。感谢Einat Snir在制备本研究中所用酵母双杂交质粒文库的基因组文库片段方面的专业贡献。本研究由美国国立卫生研究院（NIH R21 EB021870-01A1）和美国国家科学基金会研究项目基金（1517110）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
llumina HiSeq 4000Illumina深度测序平台
单克隆抗HA抗体Biolegend901514用于检测pGal4AD载体中HA表达的一抗
多克隆抗myc抗体QED Biosciences Inc18826用于检测pTEF-GBD载体中MYC表达的一抗
NarINew England BioLabsR0191S
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S
BamHI-HFNew England BioLabsR3236S
XhoINew England BioLabsR0146S
聚乙二醇3350，粉末J.T. BakerU2211-08
鲑鱼精子DNATrevigen, Inc 销售于 Fisher Scientific50-948-286酵母转化中使用的载体DNA，见第3.2.1节
硫酸卡那霉素Research Products InternationalK22000
LE琼脂糖GeneMateE-3120-500用于制备DNA琼脂糖凝胶
氯化钠Research Products InternationalS23025
胰蛋白胨Research Products InternationalT60060
D-山梨醇Research Products InternationalS23080
乙酸锂二水合物MP Biomedicals155256
氯化钙ThermoFisherC79
EDTA钠盐Research Products InternationalE57020
酵母提取物粉末Research Products InternationalY20020
酵母氮源基础（含硫酸铵）不含氨基酸Research Products InternationalY20040
CSM-Trp-Leu+40ADEFormediumDCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADEFormediumDCS1169
CSM-Leu-MetFormediumDCS0549
CSM-Trp-MetBio 101, Inc4520-922
L-甲硫氨酸FormediumDOC0168
腺嘌呤Research Products InternationalA11500
D-(+)-葡萄糖Research Products InternationalG32045
Bacto琼脂BD214010用于第1节中培养基平板的制备
蛋白胨Research Products InternationalP20240
3-氨基-1,2,4-三唑SigmaA8056
2-巯基乙醇（BME）Sigma-AldrichM6250
Zymolyase 100TUSBiologicalZ1004
磷酸氢二钾SigmaP8281
苯酚:氯仿:异戊醇AmbionAM9732
乙酸铵Sigma-Aldrich238074
乙醇Decon Laboratories, INC2716
RNase AThermoFisherEN0531
尿素Research Products InternationalU20200
SDSResearch Products InternationalL22010
甘油Sigma AldrichG5516
Tris-HClGibco15506-017
溴酚蓝Amresco449
Gibson Assembly克隆试剂盒New England BiolabsE5510S第2节中用于质粒克隆的快速组装方法
NEBNext高保真2x PCR预混液New England BiolabsM0541S用于第2.3节中Gibson Assembly产物的扩增，以及第6.2.1节DEEPN深度测序的样品制备
溴化乙锭Amresco0492-5G
QIAquick PCR纯化试剂盒Qiagen28104用于第6.2.3节中PCR产物的纯化
Qiaquick DNA凝胶回收试剂盒Qiagen28704用于第2.1节中消化后的pTEF-GBD质粒的纯化
KAPA Hyper Prep试剂盒KAPA BiosystemsKK8500深度测序样品制备试剂盒
密码子优化http://www.jcat.de
密码子优化https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocksIntegrated DNA Technologies第2.2节克隆中使用的DNA片段
StringsThermofisher第2.2节克隆中使用的DNA片段
GenCatch质粒DNA小量提取试剂盒EPOCH Life Sciences用于第2.3节中DNA的制备
Covaris E220Covaris第7节中使用的高性能超声破碎仪
寡核苷酸 5’- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’		Integrated DNA Technologies 或 Thermofisher用于质粒构建过程中pTEF-GBD 5'插入片段的PCR扩增和测序
寡核苷酸 5’-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3’		Integrated DNA Technologies 或 Thermofisher用于质粒构建过程中pTEF-GBD 5'插入片段的PCR扩增和测序
寡核苷酸 5’-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3’		Integrated DNA Technologies 或 Thermofisher用于质粒构建过程中pTEF-GBD 3'插入片段的PCR扩增和测序
寡核苷酸 5’-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3’		Integrated DNA Technologies 或 Thermofisher用于质粒构建过程中pTEF-GBD 3'插入片段的PCR扩增和测序
寡核苷酸 5’-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3’		Integrated DNA Technologies 或 Thermofisher用于pGAL4AD插入片段扩增的5'引物
寡核苷酸 5’-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3’		Integrated DNA Technologies 或 Thermofisher用于pGAL4AD插入片段扩增的3'引物
寡核苷酸 5’-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3’		Integrated DNA Technologies 或 Thermofisher用于pGADT7插入片段扩增的5'引物
寡核苷酸 5’- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3’		Integrated DNA Technologies 或 Thermofisher用于pGADT7插入片段扩增的3'引物
PJ69-4A MatA酵母菌株http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: 酵母中高效双杂交筛选用基因组文库及宿主菌株设计. GENETICS 1996 144:1425-1436MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBDDr. Robert Piper 实验室Gal4-DNA结合结构域表达质粒
pGal4AD (pPL6343)Dr. Robert Piper 实验室Gal4-激活结构域表达质粒
100 mm培养皿Kord-Vallmark 销售于 VWR2900
125 mL PYREX三角烧瓶Fisher ScientificS63270
250 mL PYREX三角烧瓶Fisher ScientificS63271
1,000 mL PYREX三角烧瓶Fisher ScientificS63274
2,000 mL PYREX三角烧瓶Fisher ScientificS63275
20 X 150 mm 一次性培养管Thermofisher14-961-33
移液器辅助装置（pipet-aid）Drummond4-000-100
5 mL 移液管DenvilleP7127
10 mL 移液管DenvilleP7128
25 mL 移液管DenvilleP7129
1,000 mL PYREX Griffin烧杯Fisher Scientific02-540P
1,000 mL PYREX可重复使用培养基储存瓶Fisher Scientific06-414-1D
1,000 mL量筒Fisher Scientific08-572-6G
SpectraMax 190Molecular Devices用于测定细胞的光密度
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000用于定量DNA含量的分光光度计
电子式紫外透射仪Ultra LumMEB 20用于在溴化乙锭琼脂糖凝胶中观察DNA
P1000 Gilson移液器Fisher ScientificF123602G
P200 Gilson移液器Fisher ScientificF123601G
P20 Gilson移液器Fisher ScientificF123600G
P10 Gilson移液器Fisher ScientificF144802G
1250 µL低吸附移液器吸头GeneMateP-1236-1250
200 µL低吸附移液器吸头VWR10017-044
10 µL XL低吸附移液器吸头VWR10017-042
50 mL离心管VWR490001-627
15 mL离心管VWR490001-621
细胞刮刀Denville ScientificTC9310
1.5 mL微量离心管USA Scientific1615-5500
HClFluka Analytical318949-1L
NaOHJ.T. Baker5674-02
木制涂布棒Solon Care55900
Eppendorf微量离心机5424Fisher Scientific05-400-005微量离心机
Sorvall ST16RThermo Fisher Scientific75004381台式离心机
Amersham ECL兔IgG，HRP标记全抗体（驴源）GE HealthcareNA934-1ML二抗
Amersham ECL小鼠IgG，HRP标记全抗体（羊源）GE HealthcareNA931-1ML二抗
SuperSignal West Pico化学发光底物Thermo Fisher Scientific34080ECL检测溶液
Isotemp培养箱Thermo Fisher Scientific培养箱
Mutitron 2INFORS HT摇床培养箱
Isotemp数字控制水浴锅 205型Fisher Scientific水浴锅
Y2H小鼠cDNA文库（泛组织）于Y187菌株中Clontech630482商业化cDNA文库
Y2H小鼠cDNA文库（小鼠脑组织）于Y187菌株中Clontech630488商业化cDNA文库
pGADT7 AD载体Clontech630442商业化AD载体，可承载多种cDNA文库
pGBKT7 DNA-BD载体Clontech630443商业化DNA-BD载体
Biolase DNA聚合酶BiolineBIO-21042第2.4节中使用的DNA聚合酶
GeneMate GCL-60 PCR仪BioExpressP-6050-60PCR仪
TempAssure 0.5 mL PCR管USA Scientific1405-8100

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蛋白质-蛋白质相互作用DEEPN方法深度测序诱饵质粒构建猎物质粒文库制备酵母交配反应DNA提取方案PCR扩增生物信息学分析
一种批量进行的酵母双杂交筛选方法用于比较蛋白质相互作用
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