从人网膜和皮下脂肪组织中分离、扩增及诱导CD34+CD31+内皮细胞的脂肪生成

摘要

从脂肪组织血管前体细胞分化出白色和米色脂肪细胞在改善肥胖相关代谢方面具有潜在价值。本文描述了从人类脂肪组织中分离CD34+CD31+内皮细胞以及后续的分化方案 体外 扩增及向白色和米色脂肪细胞的分化。文中讨论了多种下游应用。

摘要

肥胖伴随着脂肪组织的广泛重塑，主要通过脂肪细胞肥大实现。脂肪细胞的过度生长会导致对胰岛素反应不良、局部缺氧和炎症。通过促进前体细胞分化为功能性白色脂肪细胞，可防止脂肪细胞群体的极端肥大，从而改善脂肪组织的代谢健康，并减轻炎症。此外，通过促进米色/棕色脂肪细胞的分化，可增加机体总能量消耗，进而导致体重减轻。这一策略有望预防肥胖相关合并症的发生，例如2型糖尿病和心血管疾病。

本文描述了从共表达 CD31 和 CD34 标志物的人类脂肪组织内皮细胞亚群中分离、扩增和诱导白色及米色脂肪细胞分化的方法。该方法成本相对较低，且不需耗费大量人力。该技术需要获取人类脂肪组织，皮下脂肪库适用于取样。在本实验方案中，于减重手术过程中收集病态肥胖受试者[体重指数（BMI）>35]的新鲜脂肪组织样本。通过从基质血管组分进行连续免疫分离，仅需 2–3 克脂肪即可获得足够数量的细胞。这些细胞可在体外培养中扩增 10–14 天，可进行冷冻保存，并在传代至第 5–6 代时仍保持其成脂分化能力。细胞使用含人胰岛素和 PPARγ 激动剂罗格列酮的成脂诱导剂混合物处理 14 天。

该方法可用于获得脂肪组织内皮细胞中驱动成脂反应的分子机制的概念验证实验，或用于筛选能够增强定向分化为白色或米色/棕色脂肪细胞的成脂反应的新药。利用小的皮下活检样本，该方法可用于在旨在刺激米色/棕色和白色脂肪细胞以治疗肥胖及其合并症的临床试验中，筛选出无反应的受试者。

引言

最近的证据表明，在小鼠和人类中，存在于脂肪组织血管中的一类细胞可分化为白色或米色/棕色脂肪细胞^1,2,3。这类细胞的表型尚存争议，有研究支持其为内皮细胞、平滑肌/周细胞，或一系列中间表型^4,5,6,7。本方法的开发旨在检测从肥胖个体不同脂肪库中分离出的CD34+CD31+内皮细胞的脂肪生成潜能。文献中其他研究主要关注整个基质血管组分或已知脂肪细胞前体细胞的脂肪生成能力^2,8,9。由于目前已有技术可特异性地将药物递送至脂肪组织内皮细胞¹⁰，因此了解这些细胞向白色或米色脂肪细胞诱导分化的潜能，对未来实现靶向治疗具有重要意义。

不同研究团队已报道将 CD31 与 CD34 标记物的组合用作从人脂肪组织中分离内皮细胞的替代方法^11,12,13。通常，该分离过程采用两步连续操作，并通过磁珠进行阳性筛选。在本报告中，我们采用了结合 CD34+ 磁珠与 CD31 塑料珠的免疫分离方法。我们发现，与连续磁性免疫分离相比，该技术在维持典型的鹅卵石样内皮细胞形态方面更具优势。此外，我们能够仅从 1–2 g 脂肪起始材料中获得足够数量的细胞，用于后续扩增及脂肪生成诱导。仅需少量皮下脂肪活检样本，即可获得下游应用所需的细胞数量。这一特点可能具有重要意义，尤其当该方法用于筛选个体对脂肪生成诱导反应性时。

与其他文献报道的系统不同，该方法仅使用两种成分对CD34+CD31+细胞进行脂肪生成诱导：一种PPARγ激动剂——罗格列酮，以及人胰岛素。γ 激动剂——罗格列酮——和人胰岛素。重要的是，所使用的人胰岛素剂量处于人体空腹状态下循环胰岛素的正常/较高水平范围内。¹⁴细胞对胰岛素的反应程度 体外，通过Akt磷酸化水平测定，与其对诱导试剂盒的响应能力无关。有趣的是，在本诱导试剂盒及实验条件下，细胞表现出白色与米色/棕色脂肪细胞的混合表型，该结果基于细胞内脂滴的大小与数量以及分子标志物的表达情况确定。这一简单且经济高效的诱导方案，结合对响应细胞表型（白色 对比 米色）可实现对可能改变分化后的米色与白色脂肪细胞平衡的试剂进行筛选。

该方法还为理解人脂肪组织中血管内皮祖细胞成脂作用的潜在机制提供了一种可转化的研究途径。利用这种特定的分离与分化技术，研究人员可以探究在瘦型和肥胖个体的不同脂肪库中，特定亚群血管内皮细胞成脂过程所涉及的多种信号通路。

方案

东弗吉尼亚医学院的机构审查委员会批准了本研究及所用人体脂肪组织样本的采集。已从患者处获得知情书面同意。

1. 缓冲液、培养基和仪器的准备

1. 配制克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液（KRBBS）：135 mM 氯化钠、5 mM 氯化钾、1 mM 硫酸镁、0.4 mM 磷酸氢二钾、5.5 mM 葡萄糖、1 mM 腺苷、0.01% 抗生素/抗真菌素混合液（含青霉素 50 µg/mL、链霉素 50 µg/mL、庆大霉素 30 µg/mL、两性霉素 15 ng/mL）以及 10 mM HEPES（pH = 7.4）。该溶液每次组织采集和消化前均需新鲜配制。
2. 配制新鲜的胶原酶溶液：将 1 型胶原酶以 1 mg/mL 的浓度溶于 KRBSS 中，每克脂肪组织使用 3 mL。在组织消化前，将胶原酶溶液置于 37 °C 水浴中预热。
3. 配制 CD34 细胞分离缓冲液：在无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中加入 2% 胎牛血清（FBS）和 1 mM EDTA。
4. 配制脂肪生成培养基：DMEM/F12 培养基，添加 5% FBS、50 µg/mL 青霉素/链霉素、1.25 µL/mL 人胰岛素（终浓度为 5 µg/mL 或 144 mU/mL）以及 0.36 µL/mL 的 2.8 mM 罗格列酮溶液（终浓度为 1 µM）。
5. 配制 0.3% 油红 O（ORO）储备液（质量/体积）：将 0.3 g 油红 O 溶解于 100 mL 异丙醇中。

2. 脂肪基质血管组分的分离

注意：本研究纳入了一组在Sentara代谢与减重手术中心（Sentara医疗集团，弗吉尼亚州诺福克）接受减重手术的重度肥胖2型糖尿病（T2D）及非糖尿病受试者，年龄为18–65岁。排除标准包括自身免疫性疾病（如1型糖尿病）、需要长期免疫抑制治疗的疾病、使用抗炎药物或噻唑烷二酮类药物、正在吸烟、慢性或急性感染，以及在过去12个月内接受过恶性肿瘤治疗的病史。2型糖尿病的诊断标准为：空腹血浆葡萄糖≥126 mg/dL，口服2小时葡萄糖耐量试验后血糖≥200 mg/dL，或正在使用降糖药物。

1. 从接受减重手术的人类受试者中采集大网膜（OM）和皮下（SC）脂肪组织（AT）。
2. 组织取出后，立即将OM和SC脂肪组织分别置于含有50 µg/mL青霉素/链霉素的Hank's平衡盐溶液中的离心管内，并在室温下保存。
3. 样本送达实验室后，使用经70%乙醇擦拭过的剪刀和镊子仔细清理并去除组织中的纤维化和烧灼部分。
4. 称量脂肪组织，并将其分割为每份5 g（或更少）的等分试样，用于胶原酶消化。
5. 在室温下，使用两把剪刀将5 g脂肪组织在5 mL胶原酶溶液中精细剪碎，置于闪烁瓶中。
6. 向剪碎的组织中再加入10 mL胶原酶溶液，使总体积达到15 mL。
7. 将样品在37 °C水浴中持续振荡消化1小时。
8. 剪掉20 mL注射器的尖端，制成钝端。
9. 从250 µm孔径的筛网中裁剪一块9 cm × 9 cm的正方形，用钝端注射器将其推入50 mL锥形管中约一半深度。
10. 将样品倒入20 mL钝端注射器中，通过250 µm尼龙筛网过滤至50 mL锥形管中，以分离脂肪细胞和基质血管细胞与未消化的组织。
    注意：每个50 mL锥形管中使用的脂肪组织不得超过5 g，否则由于过量未消化的纤维化物质会导致筛网堵塞。
11. 用10 mL KRBBS冲洗闪烁瓶，并将冲洗液通过滤网倒入锥形管，以收集残留细胞。
12. 将过滤后的样品在室温下静置孵育5分钟。
    注意：此步骤至关重要，可使脂肪细胞上浮至管顶，部分基质血管细胞沉降至管底。
13. 使用20 mL注射器和20 G × 6 in移液针吸取基质血管组分层，并转移至洁净的50 mL锥形管中。
14. 加入10 mL KRBBS，在室温下静置5分钟。
15. 重复步骤2.12–2.14两次。
    注意：这些步骤可确保基质血管细胞中无漂浮脂肪细胞的污染。
16. 将两个部位来源的基质血管组分置于冰上，用于后续处理，具体步骤如下所述。
    注意：细胞在冰上放置时间不得超过1小时，以免影响细胞活力。脂肪细胞可立即用于实验或在液氮中速冻以长期保存。

3. 脂肪组织内皮细胞的分离

1. 在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心基质血管组分（SVF）5 分钟。
2. 从离心机中取出样品，小心倾倒上清液；保留含有 SVF 细胞的沉淀。
3. 用 5 mL PBS 轻柔重悬细胞沉淀。
   注意：如果处理的脂肪库（AT depot）超过 5 g 并分装成多个等份（参见步骤 2.4），则需将所有细胞沉淀合并。
4. 在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心样品 5 分钟。
5. 弃去上清液，将细胞重悬于 1 mL PBS 中并进行细胞计数。
   注意：此处使用自动细胞计数仪进行细胞计数。通过将 12 µL 细胞悬液与 12 µL 蒽啶橙/碘化丙啶（AO/PI）溶液混合（参见材料表）测定细胞活力。各脂肪库每克 AT 的平均细胞数为：(a) 大网膜（OM）库：1.69 × 10⁵ ± 4.51 × 10⁴；(b) 皮下（SC）库：1.24 × 10⁵ ± 6.45 × 10⁴。两个脂肪库来源细胞的活力均 >90%。
6. 在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心样品 5 分钟。
   注意：步骤 3.7–3.15 采用 CD34 免疫磁珠分离方案（参见材料表）。
7. 将沉淀重悬于 100 µL CD34 分离缓冲液中。
   注意：根据总细胞数确定所需重悬体积：(a) <2 × 10⁷ 个细胞：将沉淀重悬于 100 µL 中；(b) 2 × 10⁸–5 × 10⁸ 个细胞：将沉淀重悬于 1 mL 中。在步骤 3.9–3.16 中，对于 <2 × 10⁷ 个细胞的情况，所用试剂体积相应缩小。
8. 加入 10 µL CD34 混合液，在室温下孵育 15 分钟。
9. 加入 5 µL 磁珠，在室温下孵育 10 分钟。
10. 向每个样品中加入 2.5 mL CD34 分离缓冲液，将样品置于磁架上放置 5 分钟，室温操作。
11. 将磁架倒置 5 秒，倒掉分离缓冲液。
12. 从磁架上取下样品，重复步骤 3.10 和 3.11 四次。
13. 将试管从磁架上取下，加入 2 mL CD34 分离缓冲液。
14. 在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心细胞 5 分钟。
15. 将细胞沉淀重悬于 1 mL CD34 分离缓冲液中并进行细胞计数。
    注意：此时每克 AT 的平均细胞数为：(a) OM 库：4.75 × 10⁴ ± 3.36 × 10⁴；(b) SC 库：1.06 × 10⁴ ± 9.53 × 10³。步骤 3.16–3.34 采用 CD31 塑料免疫珠分离方案（参见材料表）。
16. 以 500 × g 离心 5 分钟，将沉淀重悬于 250 µL Buffer B 和 250 µL 洗涤缓冲液中。
17. 通过涡旋充分重悬 CD31 珠子。
18. 加入 20 µL CD31 珠子。
    注意：由于总细胞数 >1 × 10⁶，根据制造商建议调整了使用体积。
19. 在室温下轻轻摇动孵育 30 分钟。
20. 将滤器连接至无菌 50 mL 锥形管。
    注意：滤器较大开口端必须朝上。
21. 在细胞分离前，加入 1 mL 洗涤缓冲液以平衡滤器。将步骤 3.16 所得混合物加至滤器上。
22. 以 5 mL 洗涤缓冲液沿圆周方向洗涤滤器，共洗涤至总体积达 20 mL。将连接器接至无菌 50 mL 锥形管并关闭鲁尔锁。
23. 将滤器连接至连接器。沿滤器壁加入 1 mL 洗涤缓冲液。再沿滤器壁加入 1 mL 活化缓冲液 D。轻柔旋转样品，并在室温下孵育 10 分钟。
24. 加入 1 mL 洗涤缓冲液。通过上下吹打 10 次使细胞与珠子分离。
    注意：避免产生气泡。
25. 打开鲁尔锁，使脱离的细胞流入 50 mL 锥形管中。每次用 1 mL 洗涤缓冲液洗涤滤器，共洗涤 10 次。
26. 弃去连接器和滤器，在 4 °C 条件下以 300 × g 离心样品 10 分钟。将细胞沉淀重悬于 2 mL 完全 EGM-2 培养基中用于培养。
    注意：此时每克 AT 的平均细胞数为：(a) OM 库：5.92 × 10³ ± 4.27 × 10³；(b) SC 库：4.12 × 10³ ± 2.1 × 10³。两个脂肪库来源细胞的活力均超过 90%。

4. 分离内皮细胞中脂肪生成的诱导

1. 在37℃、5% CO₂培养箱中，使用完全EGM-2培养基，在6孔组织培养处理板中培养细胞。 °℃，5% CO₂₂ 培养箱中培养，每3–4天更换一次培养基，直至细胞达到80–90%汇合度。
   注：群体倍增时间为2–3天。
2. 将细胞接种于100 mm培养皿中进行扩增，并以1:3比例传代一次。此时细胞处于第2代。
3. 使用自动细胞计数器对细胞进行计数（参见 材料表).
4. 将约100,000–200,000个细胞接种至6孔板中，每个组织来源设置复孔，用完全EGM-2培养基培养2天。
5. 吸弃所有生长培养基，替换为 2 mL 含 5% FBS 和 50 µ对照细胞中加入含青霉素/链霉素（终浓度为 g/mL）的培养基，处理细胞则更换为 2 mL 脂肪生成培养基（见步骤 1.4）。
6. 将细胞在37℃下孵育 °5% CO₂ 湿润环境中₂ 在培养箱中孵育13天，每3至4天更换相应培养基。
   注意：细胞在处理4天后将开始积累脂质。
7. 根据已发表的方法进行油红O和尼罗红染色^15-17.
8. 为提取RNA而分离细胞时，从6孔诱导板中移除培养基，并用1 mL无菌PBS洗涤。
9. 加入350 µ硫氰酸胍-苯酚-氯仿溶液的 L（参见 材料清单向每个孔中加入适量溶液，在室温下孵育5–10分钟。
10. 使用细胞刮刀将细胞从培养板上刮下，并将细胞转移至1.5 mL微量离心管中。
    注意：样品可在 -80 ℃保存 °C 冻存用于后续 RNA 提取及进一步处理。
11. 使用改良的RNA提取方案从样品中提取mRNA（参见 材料表).
12. 使用以下探针通过实时聚合酶链式反应（RT-PCR）检测基因表达：adiponectin、UCP-1 和 CIDEA（参见 材料表).
    注意：此处RT-PCR操作采用以下标准程序：变性（95 °C；15 秒），退火和延伸（60 °C；1 分钟）进行 40 个循环。表达基因的样本其 C_T 数值 >35 被视为未检出。

结果

我们的方案旨在提供一种 体外 评估不同部位人脂肪组织中CD34+CD31+血管细胞成脂潜能的方法。简化流程图如下所示： 图1A. 通过正向筛选表达 CD34 的细胞，第一步可获得 > 新鲜分离细胞群体中95%为CD34+细胞（图1A）。重要的是，这些细胞在传代培养几次后便会失去该标志物。由于CD34是多种造血和非造血祖细胞的共同标志物，因此接下来分离内皮祖细胞所需的步骤是从CD34+细胞群体中进行CD31+细胞的阳性筛选（图1A）。尽管CD31是内皮细胞的标志物，但也可能存在于某些造血细胞亚群中。我们通过流式细胞术分析了来自大网膜和皮下脂肪的多个样本， consistently 发现CD34+CD31+细胞不表达CD45标志物（图1B，上图面板）。通常情况下， <总细胞群体中仅有1%的细胞呈CD45阳性...

讨论

本文的重点是提供一种从人体内脏和皮下脂肪组织库中分离、扩增和诱导CD34+CD31+内皮细胞脂肪生成的方法。

已有文献报道了从啮齿类动物或人类不同血管床中分离内皮细胞的方法，这些方法主要采用荧光标记或磁珠偶联的CD31抗体^{18,19,20,21,22,23}。这些分离技术在普遍应用中的主要挑战在于不同血管床内皮细胞群体的异质性，以及易受成纤维细胞和血管壁细胞污染的高风险。然而，已有研究报道对分离技术进行了优化，以避免此类污染²⁴。使用这些技术通常从组织中分离出的是成熟内皮细胞。脂肪组织是干细胞/前体细胞的重要储存库，其中包括内皮前体细胞

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
大型设备
生物安全柜	Nuaire	nu-425-400
细胞培养箱	Thermo-Fisher Scientific	800 DH
水浴	Forma Scientific	2568	双向振荡器
RT-PCR仪	BIO-RAD	CFX96-C1000
电泳槽	BIO-RAD	Mini PROTEAN 3 电泳槽
转膜电泳槽	BIO-RAD	Mini Trans-Blot 细胞转移装置
电泳电源	BIO-RAD	PowerPac Basic
ELISA 阅读仪	Molecular Devices	SpectraMax M5
印迹读取器	LI-COR	奥德赛	近红外
冷藏离心机	Eppendorf	5810 R
台式离心机	Eppendorf	MiniSpin Plus
荧光显微镜	Olympus	BX50
倒置显微镜	尼康	经颅磁刺激
KRBSS 缓冲液
HEPES	研究产品国际公司	H75030
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	792519
二水合氯化钙	Sigma-Aldrich	C7902
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P5655
硫酸镁	Sigma-Aldrich	M2643
氯化钠	Sigma-Aldrich	746398
磷酸二氢钠一水合物	Sigma-Aldrich	S9638
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9333
葡萄糖	Acros Organics	410950010
腺苷	Acros Organics	164040250
牛血清白蛋白	GE Healthcare Bio-Sciences	SH30574.02
青霉素/链霉素	赛默飞世尔科技	15070063
组织消化
20 mL 注射器	全球医学	67-2020
尼龙筛网，250 µm	Sefar	03-250/50
移液针头	Popper	7934
精细剪刀	Fine Science Tools	14058-11
组织镊	George Tiemann &和公司	160-20
I型胶原酶	沃辛顿生化	LS004196
培养皿，100 mm	USA Scientific	5666-4160	TC 处理组
Eppendorf 管，1.5 mL	USA Scientific	1615-5500
锥形管，15 mL	Nest Scientific	601052
50 mL 锥形管	Nalgene	3119-0050
闪烁瓶	Kimble	74505-20	组织切碎
细胞分离
Cellometer	Nexcelom	Auto 2000
Cellometer 载玻片	Nexcelom	CHT4-SD100-002
Cellometer 活率染色剂	Nexcelom	CS2-0106-5mL	吖啶橙/碘化丙啶
抗CD34磁珠	StemCell Technologies	18056	试剂盒
EasySep 磁铁	StemCell Technologies	18000
抗 CD31 塑料微珠	pluriSelect USA	19-03100-10
pluriSelect 10x 洗涤缓冲液	pluriSelect USA	60-00080-10
pluriSelect 连接环	pluriSelect USA	41-50000-03
pluriSelect 解离缓冲液	pluriSelect USA	60-00046-12
pluriSelect 孵育缓冲液	pluriSelect USA	60-00060-12
pluriSelect S 细胞筛	pluriSelect USA	43-50030-03
细胞培养
6孔板	USA Scientific	CC7682-7506	TC 处理
4孔板腔载玻片	康宁生命科学	354559	纤维连接蛋白包被
4孔板载玻片	Thermo-Fisher Scientific	154526PK	未包被玻璃
人脂肪微血管内皮细胞（HAMVEC）	Sciencell 研究实验室	7200	原代细胞系
内皮细胞培养基（ECM）	ScienCell 研究实验室	1001	完整试剂盒
DMEM/F12 基础培养基	Thermo-Fisher Scientific	11320082
胎牛血清（FBS）	Rocky Mountain Biologicals	FBS-BBT
胰岛素	Lilly	U-100	优泌乐
罗格列酮	Sigma-Aldrich	R2408
细胞分析
油红O染料	Sigma-Aldrich	O0625	在异丙醇中配制
96 孔板	USA Scientific	1837-9600
96孔PCR板	Genesee Scientific	24-300
RNA提取	Zymo Research	R2072	试剂盒
cDNA合成	BIO-RAD	1708841	Supermix
JumpStart PCR聚合酶	Sigma-Aldrich	D9307-250UN	热启动，使用 PCR Buffer N
氯化镁溶液	Sigma-Aldrich	M8787-5ML	PCR 反应中终浓度为 3 mM
dNTPs	Promega	U1515
TaqMan AdipoQ	Thermo-Fisher Scientific	Hs00605917_m1
TaqMan CIDEA	Thermo-Fisher Scientific	Hs00154455_m1
TaqMan RPL27	赛默飞世尔科技	Hs03044961_g1
TaqMan UCP1	Thermo-Fisher Scientific	Hs00222453_m1
BCA 法测定	Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT	试剂盒
双丙烯酰胺	BIO-RAD	1610146	40% 储备液
过硫酸铵	BIO-RAD	1610700
TEMED	BIO-RAD	1610800
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
甘氨酸	BIO-RAD	1610718
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	L3771
EDTA	Fisher Scientific	S311-100
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	B8026
转膜	EMD Millipore	IPFL00010
甲醇	Fisher Scientific	A452-SK4
Odyssey封闭缓冲液，Tris	LI-COR	927-50000
抗AKT抗体	Cell Signaling Technology	2920S	小鼠单克隆
抗pAKT抗体	Cell Signaling Technology	9271S	兔多克隆
抗UCP1抗体	Abcam	ab10983	兔多克隆
抗小鼠 IgG 抗体	LI-COR	926-68070	山羊多克隆，IRDye 680RD
抗兔IgG抗体	LI-COR	926-32211	山羊多克隆，IRDye 800CW
抗兔IgG抗体	Jackson ImmunoResearch	111-025-003	山羊多克隆，TRITC
磷酸盐缓冲液	赛默飞世尔科技	10010049
37% 甲醛溶液	Electron Microscopy Sciences	15686	用于细胞固定的4%溶液
正常山羊血清	Vector Laboratories	S-1000	10% 封闭液
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100	0.1% 透化溶液
DAPI	Thermo-Fisher Scientific	D1306
Calcein AM	赛默飞世尔科技	65-0853-39	细胞荧光成像
Matrigel 基底膜基质	康宁生命科学	356231	生长因子减少
DiI 标记的乙酰化低密度脂蛋白	Thermo-Fisher Scientific	L3484