从人网膜和皮下脂肪组织中分离、扩增及诱导CD34+CD31+内皮细胞的脂肪生成

摘要

从脂肪组织血管前体细胞分化出白色和米色脂肪细胞在改善肥胖相关代谢方面具有潜在价值。本文描述了从人类脂肪组织中分离CD34+CD31+内皮细胞以及后续的分化方案 体外 扩增及向白色和米色脂肪细胞的分化。文中讨论了多种下游应用。

摘要

肥胖伴随着脂肪组织的广泛重塑，主要通过脂肪细胞肥大实现。脂肪细胞的过度生长会导致对胰岛素反应不良、局部缺氧和炎症。通过促进前体细胞分化为功能性白色脂肪细胞，可防止脂肪细胞群体的极端肥大，从而改善脂肪组织的代谢健康，并减轻炎症。此外，通过促进米色/棕色脂肪细胞的分化，可增加机体总能量消耗，进而导致体重减轻。这一策略有望预防肥胖相关合并症的发生，例如2型糖尿病和心血管疾病。

本文描述了从共表达 CD31 和 CD34 标志物的人类脂肪组织内皮细胞亚群中分离、扩增和诱导白色及米色脂肪细胞分化的方法。该方法成本相对较低，且不需耗费大量人力。该技术需要获取人类脂肪组织，皮下脂肪库适用于取样。在本实验方案中，于减重手术过程中收集病态肥胖受试者[体重指数（BMI）>35]的新鲜脂肪组织样本。通过从基质血管组分进行连续免疫分离，仅需 2–3 克脂肪即可获得足够数量的细胞。这些细胞可在体外培养中扩增 10–14 天，可进行冷冻保存，并在传代至第 5–6 代时仍保持其成脂分化能力。细胞使用含人胰岛素和 PPARγ 激动剂罗格列酮的成脂诱导剂混合物处理 14 天。

该方法可用于获得脂肪组织内皮细胞中驱动成脂反应的分子机制的概念验证实验，或用于筛选能够增强定向分化为白色或米色/棕色脂肪细胞的成脂反应的新药。利用小的皮下活检样本，该方法可用于在旨在刺激米色/棕色和白色脂肪细胞以治疗肥胖及其合并症的临床试验中，筛选出无反应的受试者。

引言

最近的证据表明，在小鼠和人类中，存在于脂肪组织血管中的一类细胞可分化为白色或米色/棕色脂肪细胞^1,2,3。这类细胞的表型尚存争议，有研究支持其为内皮细胞、平滑肌/周细胞，或一系列中间表型^4,5,6,7。本方法的开发旨在检测从肥胖个体不同脂肪库中分离出的CD34+CD31+内皮细胞的脂肪生成潜能。文献中其他研究主要关注整个基质血管组分或已知脂肪细胞前体细胞的脂肪生成能力^2,8,9。由于目前已有技术可特异性地将药物递送至脂肪组织内皮细胞¹⁰，因此了解这些细胞向白色或米色脂肪细胞诱导分化的潜能，对未来实现靶向治疗具有重要意义。

不同研究团队已报道将 CD31 与 CD34 标记物的组合用作从人脂肪组织中分离内皮细....

方案

东弗吉尼亚医学院的机构审查委员会批准了本研究及所用人体脂肪组织样本的采集。已从患者处获得知情书面同意。

1. 缓冲液、培养基和仪器的准备

1. 配制克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液（KRBBS）：135 mM 氯化钠、5 mM 氯化钾、1 mM 硫酸镁、0.4 mM 磷酸氢二钾、5.5 mM 葡萄糖、1 mM 腺苷、0.01% 抗生素/抗真菌素混合液（含青霉素 50 µg/mL、链霉素 50 µg/mL、庆大霉素 30 µg/mL、两性霉素 15 ng/mL）以及 10 mM HEPES（pH = 7.4）。该溶液每次组织采集和消化前均需新鲜配制。
2. 配制新鲜的胶原酶溶液：将 1 型胶原酶以 1 mg/mL 的浓度溶于 KRBSS 中，每克脂肪组织使用 3 mL。在组织消化前，将胶原酶溶液置于 37 °C 水浴中预热。
3. 配制 CD34 细胞分离缓冲液：在无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中加入 2% 胎牛血清（FBS）和 1 mM EDTA。
4. 配制脂肪生成培养基：DMEM/F12 培养基，添加 5% FBS、50 µg/mL 青霉素/链霉素、1.25 µL/mL 人胰岛素（终浓度为 5 µg/mL 或 144 mU/mL）以及 0.36 µL/mL 的 2.8 mM 罗格列酮溶液（终浓度为 1 µM）。
5. 配制 0.3% 油红 O（ORO）储备液（质量/体积）：将 0.3 g 油红 O 溶解于 ....

结果

本方案旨在提供一种 体外 评估不同部位人脂肪组织中CD34+CD31+血管细胞成脂潜能的方法。简化流程图如下所示： 图1A第一步通过正向筛选表达CD34的细胞，可获得 > 新鲜分离细胞群体中95%为CD34+细胞（图1A重要的是，这些细胞在传代培养数次后会丢失该标志物。由于 CD34 是多种造血和非造血祖细胞的共同标志物，因此接下来分离内皮祖细胞所需的步骤是从 CD34+ 细胞群中对 CD31+ 细胞进行阳性筛选。图1A）。尽管 CD31 是内皮细胞的标志物，但它也可在部分造血细胞亚群中表达。我们通过流式细胞术分析了来自大网膜和皮下脂肪的多个样本， consistently 发现 CD34+CD31+ 细胞不表达 CD45 标志物（图1B，上图面板）。通常， <总细胞群中仅有1%的细胞呈CD45阳性。该结果.......

讨论

本文的重点是提供一种从人体内脏和皮下脂肪组织库中分离、扩增和诱导CD34+CD31+内皮细胞脂肪生成的方法。

已有文献报道了从啮齿类动物或人类不同血管床中分离内皮细胞的方法，这些方法主要采用荧光标记或磁珠偶联的CD31抗体^{18,19,20,21,22,23}。这些分离技术在普遍应用中的主要挑战在于不同血管床内皮细胞群体的异质性，以及易受成纤维细胞和血管壁细胞污染的高风险。然而，已有研究报道对分离技术进行了优化，以避免此类污染²⁴。使用这些技术通常从组织中分离出的是成熟内皮细胞。脂肪组织是干细胞/前体细胞的重要储存库，其中包括内皮前体细胞

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
大型设备
生物安全柜	Nuaire	nu-425-400
细胞培养箱	Thermo-Fisher Scientific	800 DH
水浴	Forma Scientific	2568	双向振荡器
RT-PCR仪	BIO-RAD	CFX96-C1000
电泳槽	BIO-RAD	Mini PROTEAN 3 电泳槽
转膜电泳槽	BIO-RAD	Mini Trans-Blot 细胞转移装置
电泳电源	BIO-RAD	PowerPac Basic
ELISA 阅读仪	Molecular Devices	SpectraMax M5
印迹读取器	LI-COR	奥德赛	近红外
冷藏离心机	Eppendorf	5810 R
台式离心机	Eppendorf	MiniSpin Plus
荧光显微镜	Olympus	BX50
倒置显微镜	尼康	经颅磁刺激
KRBSS 缓冲液
HEPES	研究产品国际公司	H75030
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	792519
二水合氯化钙	Sigma-Aldrich	C7902
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P5655
硫酸镁	Sigma-Aldrich	M2643
氯化钠	Sigma-Aldrich	746398
磷酸二氢钠一水合物	Sigma-Aldrich	S9638
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9333
葡萄糖	Acros Organics	410950010
腺苷	Acros Organics	164040250
牛血清白蛋白	GE Healthcare Bio-Sciences	SH30574.02
青霉素/链霉素	赛默飞世尔科技	15070063
组织消化
20 mL 注射器	全球医学	67-2020
尼龙筛网，250 µm	Sefar	03-250/50
移液针头	Popper	7934
精细剪刀	Fine Science Tools	14058-11
组织镊	George Tiemann &和公司	160-20
I型胶原酶	沃辛顿生化	LS004196
培养皿，100 mm	USA Scientific	5666-4160	TC 处理组
Eppendorf 管，1.5 mL	USA Scientific	1615-5500
锥形管，15 mL	Nest Scientific	601052
50 mL 锥形管	Nalgene	3119-0050
闪烁瓶	Kimble	74505-20	组织切碎
细胞分离
Cellometer	Nexcelom	Auto 2000
Cellometer 载玻片	Nexcelom	CHT4-SD100-002
Cellometer 活率染色剂	Nexcelom	CS2-0106-5mL	吖啶橙/碘化丙啶
抗CD34磁珠	StemCell Technologies	18056	试剂盒
EasySep 磁铁	StemCell Technologies	18000
抗 CD31 塑料微珠	pluriSelect USA	19-03100-10
pluriSelect 10x 洗涤缓冲液	pluriSelect USA	60-00080-10
pluriSelect 连接环	pluriSelect USA	41-50000-03
pluriSelect 解离缓冲液	pluriSelect USA	60-00046-12
pluriSelect 孵育缓冲液	pluriSelect USA	60-00060-12
pluriSelect S 细胞筛	pluriSelect USA	43-50030-03
细胞培养
6孔板	USA Scientific	CC7682-7506	TC 处理
4孔板腔载玻片	康宁生命科学	354559	纤维连接蛋白包被
4孔板载玻片	Thermo-Fisher Scientific	154526PK	未包被玻璃
人脂肪微血管内皮细胞（HAMVEC）	Sciencell 研究实验室	7200	原代细胞系
内皮细胞培养基（ECM）	ScienCell 研究实验室	1001	完整试剂盒
DMEM/F12 基础培养基	Thermo-Fisher Scientific	11320082
胎牛血清（FBS）	Rocky Mountain Biologicals	FBS-BBT
胰岛素	Lilly	U-100	优泌乐
罗格列酮	Sigma-Aldrich	R2408
细胞分析
油红O染料	Sigma-Aldrich	O0625	在异丙醇中配制
96 孔板	USA Scientific	1837-9600
96孔PCR板	Genesee Scientific	24-300
RNA提取	Zymo Research	R2072	试剂盒
cDNA合成	BIO-RAD	1708841	Supermix
JumpStart PCR聚合酶	Sigma-Aldrich	D9307-250UN	热启动，使用 PCR Buffer N
氯化镁溶液	Sigma-Aldrich	M8787-5ML	PCR 反应中终浓度为 3 mM
dNTPs	Promega	U1515
TaqMan AdipoQ	Thermo-Fisher Scientific	Hs00605917_m1
TaqMan CIDEA	Thermo-Fisher Scientific	Hs00154455_m1
TaqMan RPL27	赛默飞世尔科技	Hs03044961_g1
TaqMan UCP1	Thermo-Fisher Scientific	Hs00222453_m1
BCA 法测定	Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT	试剂盒
双丙烯酰胺	BIO-RAD	1610146	40% 储备液
过硫酸铵	BIO-RAD	1610700
TEMED	BIO-RAD	1610800
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
甘氨酸	BIO-RAD	1610718
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	L3771
EDTA	Fisher Scientific	S311-100
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	B8026
转膜	EMD Millipore	IPFL00010
甲醇	Fisher Scientific	A452-SK4
Odyssey封闭缓冲液，Tris	LI-COR	927-50000
抗AKT抗体	Cell Signaling Technology	2920S	小鼠单克隆
抗pAKT抗体	Cell Signaling Technology	9271S	兔多克隆
抗UCP1抗体	Abcam	ab10983	兔多克隆
抗小鼠 IgG 抗体	LI-COR	926-68070	山羊多克隆，IRDye 680RD
抗兔IgG抗体	LI-COR	926-32211	山羊多克隆，IRDye 800CW
抗兔IgG抗体	Jackson ImmunoResearch	111-025-003	山羊多克隆，TRITC
磷酸盐缓冲液	赛默飞世尔科技	10010049
37% 甲醛溶液	Electron Microscopy Sciences	15686	用于细胞固定的4%溶液
正常山羊血清	Vector Laboratories	S-1000	10% 封闭液
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100	0.1% 透化溶液
DAPI	Thermo-Fisher Scientific	D1306
Calcein AM	赛默飞世尔科技	65-0853-39	细胞荧光成像
Matrigel 基底膜基质	康宁生命科学	356231	生长因子减少
DiI 标记的乙酰化低密度脂蛋白	Thermo-Fisher Scientific	L3484